干细胞移植在一种 体外 模拟缺血/再灌注模型

将心脏来源的细胞接种于细胞培养板中以模拟缺血环境。通过在无葡萄糖培养基中培养150分钟并使氧浓度低于0.5%，建立再灌注模型的缺血条件。该缺血阶段可导致大多数细胞皱缩和起泡。随后恢复正常的培养基和氧浓度，以模拟再灌注过程。

将间充质干细胞与受损细胞共同添加并进行共培养。共培养24小时后，使用钙染色和碘化乙啶同源二聚体对细胞染色，以区分活细胞与死细胞。共聚焦显微镜结果显示，两种细胞群体及其相互作用清晰可见。流式细胞术分析揭示出受损细胞存在三个聚类，可在图上绘出并进行统计学分析。干细胞移植相关方案正逐步进入临床实践，提升治疗效果、优化方案稳定性以及寻找可用于移植的新细胞来源，是当前研究的重点方向。

研究细胞治疗的有效性并非易事，需要新的工具来探究治疗过程中的相关机制。我们设计了一项实验方案，以实现对缺血、灌注损伤以及干细胞移植后细胞间连接乃至亚细胞水平机制的观察。我们的设计原则是完全体外的系统，其中仅包含宿主细胞和供体细胞。

因此，将其与周围组织分离。在损伤前后及过程中持续测量细胞活力，最长可达24小时。同时明确区分两种细胞群体，以便追踪移植细胞的命运。

为了实现这一目标，我们建立了一种氧糖剥夺（OGD）方案，随后进行再氧合。所选用的宿主细胞是年龄九号 C 二细胞，即已知的红色心肌母细胞系。在 OGD 处理后，通过将骨髓来源的间充质干细胞添加至培养体系中进行移植，以支持受损细胞的恢复。

该设置使我们能够利用共聚焦显微镜观察细胞间连接，并通过流式细胞术定量受损细胞的存活率。接下来开始操作，看看具体如何进行：移除 H nine C two 细胞的培养基。

用 PBS 洗涤细胞两次，加入 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，在培养皿中于 37 度培养箱中消化 5 分钟。用 DMEM 培养基终止胰蛋白酶消化作用。以 1200 转/分钟离心 8 分钟收集细胞。

去除上清后，将细胞重悬于1 mL DMEM培养基中，使用血细胞计数板并借助台盼蓝染色进行细胞计数，每孔接种30,000个H9c2细胞。将12孔板放入37°C含二氧化碳的培养箱中培养24小时。通过抽吸去除培养基，用PBS洗涤细胞两次。

加入 3 mm 葡萄糖-free 培养基。将培养板放入细胞培养系统中。开始通入氮气，以去除培养系统中的氧气。

等待氧气浓度降至0.5%，然后启动计时器。0.5%的氧气浓度相当于约3毫米汞柱的氧分压，使细胞经历150分钟的模拟缺血。在缺血期间，细胞会从培养表面脱落，细胞膜开始出现起泡现象。我们发现，不同细胞群体所需的时间略有差异，以达到60%至80%的细胞损伤程度。

因此，我们建议首先从两次R孵育开始。如果效果不足，可延长OGD时间。在我们的实验中，模拟缺血结束时，通常需要对年龄为九的C2细胞进行150至70分钟的OGD。

从细胞中移除无葡萄糖培养基，用移液器将正常培养基加入孔中。将12孔板置于37摄氏度二氧化碳培养箱中孵育30分钟。此阶段为再灌注期。

在模拟缺血期间，准备用于移植的挽救细胞。将荧光染料vibrant DID按1:200的比例用DMEM培养基稀释。吸除挽救细胞中的培养基，每皿加入300 µL含vibrant DID的DMEM培养基，在37°C二氧化碳培养箱中孵育30分钟。

在再灌注结束后的30分钟，向每孔含有千个间充质干细胞的缺血后H nine C two心肌母细胞中加入。初始步骤与H nine C two细胞接种相同，用PBS洗涤两次，胰酶消化并计数。将共培养的细胞放入37摄氏度二氧化碳培养箱中培养24小时。

24小时后，从孔中收集培养基和贴壁细胞。收集培养基也非常重要，因为在24小时孵育期间，一些死亡细胞可能已从培养皿表面脱落。

将细胞重悬于500微升活/死/凋亡溶液中，加入5 NMO钙离子和400 NMO乙二醇均二聚体，溶剂为PBS，细胞浓度为每毫升5×10⁴个细胞。对于共培养体系，间充质干细胞与H9c2细胞可通过各自的荧光标记加以区分。借此可检测细胞融合现象及细胞间接触位点。

以盲法方式使用10倍物镜对每种培养物的四个独立视野进行观察，可评估死细胞比例，从而获得可重复的细胞计数结果。将细胞转移至流式细胞术检测管中。启动Cell Quest Pro软件，以设置流式细胞仪进行测量。

制备活细胞和死细胞的对照样品。活细胞在正常条件下以相同密度培养，并用钙染色。死细胞则用10微摩尔过氧化氢处理一小时，然后用乙锭同源二聚体（Ethereum homodimer）染色，并以相同方式收集。应调整仪器设置，使活细胞呈钙阳性、乙锭同源二聚体阴性。

尽管死亡细胞为钙离子阴性且为碘化丙啶同源二聚体阳性，但这些细胞亚群的百分比可用柱状图表示，并对这些数值进行统计分析。我们发现，加入健康的干细胞可提高群体中存活细胞的比例。有趣的是，我们还观察到，损伤后存活下来的细胞不仅可以从死亡细胞中分选出来，也可以从原本一直保持存活的细胞中分离出来。

我们认为这一群体值得进一步研究。观看本视频后，您应能够充分理解如何以标准化的方式开展体外干细胞移植的模拟缺血实验。就此结束。

感谢观看，祝您的实验顺利。如果您有任何技术问题，请随时与我们联系，我们将竭诚为您服务。