Name: 阿的Cre - LOX P为检测细胞融合重组方法在体内 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学习使用Cre-LoxP重组技术在体内追踪细胞融合事件的方法。该技术通过检测荧光素酶信号实现活体内细胞融合的实时成像，为发育生物学、干细胞生物学和癌症研究提供重要工具。

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作者谨此感谢威斯康星大学麦迪逊分校医学系的 Peiman Hemmati 博士慷慨提供 H1 MSCs，以及威斯康星大学心血管生理学核心设施的 Tim Hacker 博士、Gouqing Song 博士和 Jill Koch 女士协助完成小鼠手术。本研究工作得到了美国国家科学基金会向 Brian Freeman 提供的研究生研究奖学金以及 NIH R21 HL089679 项目的资助。

1. 供体细胞转染
<ol>
	<li>收获间充质干细胞（MSCs，源自H1胚胎干细胞，由Peiman Hematti博士惠赠； alternatively，任何假定会发生融合的任何物种的任何细胞类型） 体内 当细胞融合度达到70 - 80%时，使用1×胰蛋白酶（Mediatech，Manassas，VA）消化5分钟。 用不含抗生素的α-MEM完全培养基（Invitrogen，Carlsbad CA）灭活胰蛋白酶18离心，300 × g，5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL 1×PBS中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>转移 1.5 × 106 将细胞转移至1.5 mL离心管中，300 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液。将沉淀重悬于 300 μL Neon 转染系统（Invitrogen）的 R 缓冲液 6 μg (2 μg / 5.0 × 105 将p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc（Addgene，美国马萨诸塞州剑桥市）质粒转染至细胞中。按照制造商说明书（Neon转染系统，Invitrogen），向电穿孔对接孔中加入3 mL E缓冲液（Invitrogen）。</li>
	<li>将细胞-质粒溶液转移至 100 μL 使用Neon移液器吸头，以20 ms脉冲时长和1500伏电压进行电穿孔。将电穿孔后的细胞加入含有9.7 mL α-MEM完全培养基的15 mL锥形管中。</li>
	<li>重复步骤1.5两次，合并转染细胞，终体积为10 mL。加入10 mL细胞悬液（1.5 x 106 细胞）接种至含有10 mL α-MEM完全培养基的T175培养瓶中。电穿孔后细胞活力约为30%，可获得约4.5 × 105 每T175培养瓶中的活细胞数</li>
	<li>转染后24小时更换α-MEM完全培养基。</li>
	<li>当转染细胞融合度达到70 - 80%时收集（电穿孔后约2 - 3天）。使用血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞重悬至浓度为1.0 x 106 细胞50 μL α-MEM完全培养基。尽量缩短细胞处于悬浮状态的时间，以减少注射前的细胞死亡。</li>
</ol>
2. 心肌内注射
<ol>
	<li>使用异氟烷（Phoenix Pharmaceuticals, Inc., St. Joseph, MO）对转基因小鼠进行麻醉，该小鼠经基因工程改造后可在每个细胞中持续表达Cre重组酶（B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J，Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）。</li>
	<li>使用电动剃毛器或化学脱毛剂去除胸部区域的毛发。</li>
	<li>插入18号导管（Becton Dickinson &amp; Co, Franklin Lakes NJ）进行气管插管，并将小鼠连接至呼吸机，呼吸频率设置为每分钟120–130次，潮气量为150 μL。</li>
	<li>在第四肋间作横向切口，建立开胸术通路。</li>
	<li>观察心脏后，使用1 mL注射器（Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ）和28号针头（Becton Dickinson &amp; Co, Franklin Lakes NJ）进行两次心肌内注射，每次注射25 μL转染细胞悬液。为便于心肌内注射并防止对器官造成过度损伤，可将针头尖端弯曲约90度。</li>
	<li>注射完成后，使用可吸收缝线（如Vicryl）缝合肋骨和肌肉层，皮肤则用4-0尼龙线或丝线缝合。</li>
	<li>让小鼠从麻醉中恢复，并拔除气管插管。</li>
	<li>对照组应包括仅接受培养基注射的Cre小鼠、接受相同浓度未转染细胞的Cre小鼠，以及接受转染细胞的野生型小鼠（或 alternatively，接受不易融合转染细胞的Cre小鼠）。</li>
</ol>
3. 生物光子成像
<ol>
	<li>成像前5至15分钟，按每克小鼠体重10 μL的剂量，腹腔注射（IP）15 mg/mL的D-荧光素酶底物（D-Luciferin）（Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA）。</li>
	<li>使用异氟烷对小鼠进行麻醉诱导，诱导浓度为4%，维持浓度为1 - 2%。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于成像盒中，通过面罩持续给予1 - 2%异氟烷以维持麻醉状态（Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA）。可同时对多只小鼠进行成像。建议将假手术对照小鼠与实验小鼠一同成像，以便于发光信号的直观比较。</li>
	<li>使用Living Image软件（Xenogen）设置合适的曝光时间（通常为60秒，参见结果部分），调整成像区域以适配小鼠体型，并在整个成像过程中保持区域一致，以避免灵敏度变化。将成像对象高度设为4.5 cm。</li>
	<li>采集视野内小鼠的生物发光强度信号，并保存未经修改的原始图像文件。对图像进行处理，去除与对照组或未经处理小鼠相对应的背景信号。高于背景的信号强度反映动物体内融合细胞的存在。可使用Living Image软件（Xenogen）或开源图像分析软件进行强度分析。通常选择感兴趣区域（ROI）以比较不同动物及实验间的信号强度数据。</li>
</ol>
4. 代表性结果
为了确定Xenogen生物发光成像系统的灵敏度，将一种持续表达荧光素酶的细胞系（231-LUC-D3H1，Xenogen）注射至C57/Bl6小鼠（Jackson Laboratory）的心肌中。细胞注射浓度分别为1 × 106、1 × 103 或 1 × 101 个细胞。细胞移植后6小时，小鼠经腹腔注射荧光素底物，并使用Xenogen系统进行成像。当注射细胞数为1,000个时可检测到特异性信号（6只小鼠中有2只检测到信号，图2），而当细胞数为10,000个时检测结果更为可靠（6只小鼠均检测到信号）。重要的是，本研究还建立了荧光素酶表达细胞数量与信号强度之间的粗略相关性。
为验证所述方案在检测和追踪细胞融合方面的实用性，将转染了LoxP-Stop-LoxP-Luciferase质粒（Addgene）的MSCs递送至心肌组织 Cre表达该基因的小鼠。细胞移植后约一周，首先使用Xenogen系统对小鼠进行成像 无 D-荧光素注射。正如预期，未使用酶底物时，未检测到强度信号（图3。随后，腹腔注射 D-荧光素，检测到四只小鼠中有两只出现了与荧光素酶强度相对应的信号，表明发生了细胞融合。一周后，再次检测到类似的信号。图3），表明MSC偶联的融合产物可以被维持 体内. 在此情况下，研究被终止以评估心脏及周围组织，但可以设想进行更长期的分析和更频繁的成像，以追踪小鼠体内融合产物的维持、增殖以及可能的迁移。
<img alt="Gene editing process; Cre-lox system; cell transfection diagram; biophotonic imaging equipment." src="/files/ftp_upload/3581/3581fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 检测细胞融合技术的示意图 在体实验. 如果表达Cre的小鼠细胞与移植的携带floxed荧光素酶质粒的细胞发生融合，则会表达荧光素酶。通过向小鼠体内注射荧光素酶底物D-荧光素（D-luciferin），随后使用Xenogen生物发光成像系统对小鼠进行成像，即可检测荧光素酶的表达（改编自文献19）。
<img alt="癌症研究中对小鼠的生物发光成像；荧光信号指示肿瘤活性。" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 利用生物光子成像技术检测心肌组织中表达荧光素酶细胞的灵敏度。将稳定表达荧光素酶的细胞系（231-LUC-D3H1，Xenogen）以不同总细胞数量注射至C57/Bl6小鼠的心肌内。图像显示分别接受 1 × 106、1 × 103 和 1 × 101 个细胞的小鼠（从左至右），成像于注射后约6小时进行。
<img alt="Mice fluorescence imaging, optical analysis; experimental setup with chart of luminescence results." src="/files/ftp_upload/3581/3581fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 定量分析 体内 指示细胞融合的发光现象 MSCs 被转染了 LoxP-Stop-LoxP-Luciferase 质粒，并递送至心肌组织 Cre表达Cre的小鼠。细胞移植后约一周和两周，使用Xenogen生物发光成像系统对Cre小鼠进行成像，以检测指示细胞融合的发光强度。（A）假手术组及小鼠1-4（从左至右）在细胞移植后17天的 photograph 与发光强度叠加图像。（B）假手术组及小鼠1-4（从左至右）在细胞移植后17天的发光强度图像。选取对应于注射部位的感兴趣区域（黄色），并使用ImageJ（免费软件）软件测定发光强度水平。20（C）所有实验条件下，发光强度均以假手术小鼠相同感兴趣区域的信号进行归一化处理。术后一周，小鼠3和小鼠4显示出阳性发光信号，提示小鼠自身细胞与移植的间充质干细胞（MSC）发生了自发融合。该信号在小鼠3术后两周仍持续存在。为确定对应于小鼠3的信号在体内的器官特异性定位，暴露胸腔并切除主要器官进行成像。（D）小鼠3的照片与发光强度叠加图。注意发光信号定位于小肠。（E）小鼠3的发光强度图。（F）假手术小鼠的照片与发光强度叠加图。（G）假手术小鼠的发光强度图。

<ol><li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBernirschke%2C+KKP+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. New York. (2000).</li>
<li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li>
<li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li>
<li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+debris%2C+oxidative+stress+and+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li>
<li>Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+of+cells+between+species+yields+transdifferentiation+and+retroviral+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo.</a> FASEB. J. 18, 548-550 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+hematopoietic+cells+generate+cardiomyocytes+at+a+low+frequency+through+cell+fusion%2C+but+not+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation.</a> Nat. Med. 10, 494-501 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li>
<li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li>
<li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li>
<li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+%28Kap%29-luciferase+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li>
<li>Weir, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophotonic+imaging+in+HO-1.luc+transgenic+mice%3A+real-time+demonstration+of+gender-specific+chloroform+induced+renal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity.</a> Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).</li>
<li>Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+bioluminescent+Brucella+melitensis+mutants+GR019+%28virB4%29%2C+GR024+%28galE%29%2C+and+GR026+%28BMEI1090-BMEI1091%29+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice.</a> Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li>
<li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li>
<li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li>
<li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li>
<li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+tissue+transplantation+in+rats%3A+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li>
<li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li>
<li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方法首次实现了在包括小型动物在内的生物体中对细胞融合进行离散识别和时间动态分析。该方法结合了Cre-LoxP重组系统与后续的生物光子成像分析。该技术不仅适用于追踪细胞-细胞融合，还可用于病毒-细胞融合的监测，因此在追踪病毒感染过程中可能具有重要应用价值。成像过程快速，可同时对多个小型动物进行成像。融合的检测灵敏度受限于特定细胞伙伴在其相应微环境中的融合频率，以及LoxP-Stop-LoxP-荧光素酶质粒的转染效率。因此，若融合伙伴细胞中已整合LoxP-Stop-LoxP-荧光素酶序列，则可获得最佳实验结果。此外，成像时生物体必须保持静止，因此对小型动物需使用麻醉。

<table><tbody><tr><td>Neon 转染系统</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 100 &amp;mu;L 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>包含 R 缓冲液和 E 缓冲液</td></tr><tr><td>a-MEM 粉末</td><td>Invitrogen</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>006054</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-054-Cl</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>122796</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen 生物发光成像系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>IVIS Spectrum</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于检测细胞融合的cre-loxp重组方法 体内

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

同一类型的两个或多个细胞具有相互融合的能力，这一特性在后生动物的进化过程中被广泛用于形成多种复杂器官，包括骨骼肌、骨组织和胎盘。近期研究表明，同类型细胞的融合能够赋予细胞更强的功能。例如，当胎盘中的滋养层细胞融合形成合体滋养层细胞时，合体滋养层相较于未融合的滋养层细胞，能更有效地在母胎屏障间转运营养物质和激素。1-4近期的研究表明，不同类型细胞的融合能够引导细胞命运的改变。过去认为，通过细胞融合实现的细胞命运“逆转”或重编程仅限于细胞培养系统。然而，随着干细胞移植技术的出现，我们及其他研究团队发现，干细胞能够与体细胞发生融合 体内 且该融合促进干细胞分化5-7因此，细胞融合是一种受调控的过程，能够促进细胞存活和分化，因而可能在发育、组织修复乃至疾病发病机制中具有核心重要性。
限制细胞融合研究的问题在于缺乏适当的技术：1）准确识别融合产物；2）长期追踪融合产物。本文提出一种新颖的方法，通过在融合发生时诱导生物发光，以克服上述两项局限图1）；生物发光可被高灵敏度地检测到 体内8-15. 我们使用一种编码萤火虫荧光素酶（Photinus pyralis) 基因置于由两侧包围的终止密码子附近 LoxP 序列 当表达该基因的细胞与表达 Cre 重组酶蛋白的细胞融合时， LoxP 位点被切割，终止信号被切除，从而允许荧光素酶的转录。 由于信号是可诱导的，因此假阳性信号的发生率非常低。与现有利用Cre/LoxP 系统16, 17我们引入了一种“活体”检测信号，从而首次提供了追踪细胞融合动力学过程的机会 体内.
为了展示该方法，将广泛表达Cre重组酶的小鼠作为受体，接受转染了携带荧光素酶报告基因构建体的干细胞，该构建体的荧光素酶表达位于floxed终止密码子的下游。 通过心肌内注射将干细胞移植，并在移植后进行活体成像分析，以随时间追踪心脏及周围组织中细胞融合产物的存在情况。该方法可适用于在发育、疾病或成体组织修复的任何阶段，分析任何组织类型中的细胞融合现象。

一种用于在活体生物中随时间追踪细胞融合的方法。该方法利用 Cre-LoxP 通过细胞融合诱导荧光素酶表达的重组。所产生的发光信号可在活体生物中利用生物发光成像系统进行检测，其检测灵敏度为 &tilde;外周组织中的1,000个细胞。

一种用于检测细胞融合的Cre-LoxP重组方法 体内

同一类型的两个或多个细胞融合的能力在后生动物的进化过程中被广泛利用，以形成许多复杂的器官，包括……

本实验的总体目标是识别并追踪体内细胞间的融合事件。首先，在供体细胞中转入一种带有荧光素酶基因的flox位点。实验的第二步是将转染后的细胞递送至经基因改造、可组成型表达Cre重组酶的小鼠的组织中。第三步是成像受体小鼠组织中的生物发光，以对应细胞-细胞融合事件。随后根据实验条件分析信号强度。最终，通过检测与细胞融合相关的可诱导性生物发光，结果可显示细胞-细胞融合产物在活体小鼠体内的定位与迁移情况。该方法有助于解答发育生物学、干细胞生物学和癌症生物学领域的一些关键问题，例如细胞融合是否促进干细胞重编程，或癌症转移是否依赖于细胞融合。演示本实验流程的人员包括我们实验室的学生安东尼·斯普林斯（Anthony Springers）、尼古拉斯·科（Nicholas Co）和布莱恩·弗里曼（Brian Freeman），以及医学院副科学家加尔女王·宋（gal queen song）。当细胞融合用于体内实验时，需在细胞汇合度达到70%至80%时开始用胰蛋白酶消化。本实验中采用间充质干细胞，使用不含抗生素的α-MEM完全培养基终止胰蛋白酶反应，轻柔离心后小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升1×PBS中。使用血细胞计数板对细胞计数后，将150万个细胞转移至离心管中，离心形成细胞沉淀。小心吸除上清液后，按照制造商的说明书，将沉淀重悬于 300 微升含有 6 微克质粒的 R 缓冲液中。将 3 毫升 EBU 加入电穿孔对接孔中。然后将100微升细胞质粒溶液转移至Neon移液吸头中。将移液吸头插入电穿孔装置，进行电穿孔处理细胞。现在将这些细胞转移至含有9.7毫升α-MEM完全培养基的15毫升锥形管中。重复电穿孔过程两次，总共获得300微升电穿孔细胞，全部汇集于α-MEM完全培养基中。然后将细胞加入含有额外10毫升α-MEM完全培养基的T175培养瓶中。转染后24小时更换培养基，电穿孔后的细胞存活率约为30%，每瓶可获得约50万个活细胞。两到三天后，细胞融合度将达到70%至80%。然后在注射前立即重悬并计数细胞。将细胞重悬于α-MEM完全培养基中，浓度为每50微升培养基含100万个细胞，并尽快注射以尽量减少细胞死亡。本实验步骤使用经基因工程改造后可全身性表达Cree重组酶的小鼠，在使用异氟烷麻醉小鼠后进行操作。通过疼痛刺激测试确认小鼠已达到外科麻醉水平。现在使用电推剪或化学脱毛剂去除胸部区域的毛发。接着，用18号导管对小鼠进行气管插管，将其连接至小鼠呼吸机，并放置于加热垫上，以完成术前准备。随后，在第四肋间沿侧胸壁做横向切口，进行开胸手术。获得心脏的清晰视野。将连接在1毫升注射器上的28号针头尖端弯曲至近90度。用50微升已制备的细胞悬液充满注射器，并保留少量空气，以便将全部细胞悬液体积从针头中完全排出。现在将转染的细胞悬液在左心室前壁区域进行两次25微升的心肌内注射。确保细胞注射到位至组织内非常重要。注射完成后，可通过观察组织是否出现隆起现象来确认注射是否准确进入组织。使用可吸收缝线（如Vicryl缝线）缝合肋骨和肌肉层。用4-0尼龙线或丝线缝合皮肤以完成手术。进行手术和注射时应迅速操作，因为手术成功取决于操作过程的短暂性。现在将小鼠置于加热板上，使其从麻醉状态中恢复，并在小鼠出现咳嗽或反射活动时拔除气管插管。对照组应使用不含转染细胞的α-MEM培养基注射至乳霜冰中，而野生型小鼠则应注射转染细胞。使用4%异氟烷对需要成像的小鼠进行麻醉。通过腹腔注射的方式给小鼠注射D-荧光素。将每只麻醉后并已注射荧光素的小鼠仰卧放置。在成像箱中，可同时对多只小鼠进行成像，包括注射假对照小鼠。使用面罩，以 1% 至 2% 异氟烷维持其麻醉状态。将成像盒置于显微镜下，并打开商用软件以进行成像操作。首先设置合适的曝光时间，以完成软件的准备工作。接下来，设定一只小鼠的成像区域形状，并将相同的成像形状用于其他所有成像小鼠。然后将动物高度设置为 4.5 厘米。采集视野内一只或多只小鼠对应的生物发光强度信号。然后保存未修改的图像文件。对图像进行处理，去除背景信号，高于背景发光强度的信号对应于动物体内融合的细胞。我们发现 ImageJ 开源软件易于调整，且在图像后期处理中可靠。进行此分析时，最关键的是将从 Xeno gen 软件获得的图像导出为 T 文件。可以使用商业或开源的图像分析软件进行强度分析。通常需选择一个感兴趣区域，以比较不同动物和实验之间的强度数据，从而确定成像系统的灵敏度。将稳定表达荧光素酶的细胞系以不同浓度注射到C57BL/6小鼠的心肌中。六小时后，对小鼠进行生物发光信号成像。在注射了1000个细胞的六只小鼠中，有两只检测到信号；而在注射了10,000个细胞的六只小鼠中，均检测到信号。观看本视频后，您应能充分理解如何通过检测可诱导的生物发光来识别和追踪体内的细胞-细胞融合产物。

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生物工程

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荧光显微镜下观察细胞电融合

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通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔

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利用FRET敏化发射在活细胞中评估蛋白质相互作用

荧光共振能量转移（FRET）是一种用于在活细胞中检测蛋白质相互作用的成像技术。本文介绍了一种FRET实验方案，用于研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用，后者可将这些酶招募至靶启动子，从而在植物组织中实现基因表达的表观遗传调控。...

研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用 在体 通过荧光共振能量转移

学习使用Cre-LoxP重组技术在体内追踪细胞融合事件的方法。该技术通过检测荧光素酶信号实现活体内细胞融合的实时成像，为发育生物学、干细胞生物学和癌症研究提供重要工具。

一种用于检测细胞融合的Cre-LoxP重组方法体内

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