通过¹³C标记的蛋白质源性氨基酸进行代谢通路的验证与发现

本实验方案的目的是利用碳13辅助的代谢分析来研究细菌代谢。首先，在含有标记碳源的培养基中培养微生物，使标记的碳原子被整合到微生物蛋白质中。随后收集微生物，并提取氨基酸，进行水解和衍生化处理。

将样品注入气相色谱-质谱联用仪（GCMS）。通过追踪生化网络中代谢物之间的原子转移路径，可以确定微生物所利用的功能性代谢途径。我是 Bert Burla。

本文介绍的方法可作为转录组学和蛋白质组学的补充，用于确定微生物中的代谢通路。我们已利用该技术研究了蓝细菌等光合微生物的自养或异养碳利用特性。在本视频中，我们将以ANOTHE 5 1 1 42为模式菌株，演示如何利用标记碳底物来发现新的酶功能。

演示该实验步骤的人员为我本人、li Yu 和 Chu Yang Fang。首先，在未标记培养基中培养 *Cyana thesei* 细菌。当细菌达到对数生长中期时，按体积接种 3% 至碳 13 标记的培养基中。

然后，为避免在对数生长中期将初始接种物的传代培养物中的未标记碳引入同一标记培养基中，当碳13标记的Cy Thesei细菌达到对数生长中期时，通过离心收集10毫升菌液。将菌体沉淀重悬于1.5毫升6摩尔盐酸中，并转移至透明玻璃螺口气相色谱（GC）小瓶中。

盖紧小瓶并将其置于100摄氏度的烘箱中24小时，以将生物质蛋白水解为氨基酸。生物质颗粒经水解后可得到20种常见氨基酸中的16种。水解完成后，将氨基酸溶液转移至2毫升微量离心管中，然后在20,000 ×g条件下离心5分钟，以沉淀固体颗粒。

离心后，将上清液转移至新的气相色谱小瓶中，以去除水解溶液中的固体颗粒，防止其进入气相色谱柱。接下来，对氨基酸进行衍生化处理，使其具有挥发性，以便通过气相色谱进行分离。将干燥的样品溶解于150 µL四氢呋喃（THF）和150 µL叔丁基二甲基硅烷与三氟甲基甲酯的混合液中。

乙酰胺，T-B-D-M-S 衍生化试剂：将所有样品置于 65 至 80 摄氏度的烘箱中孵育 1 小时。孵育过程中偶尔涡旋样品，以确保小瓶中的代谢物充分溶解。在 20,000 ×g 条件下离心 10 分钟，然后将上清液转移至新的气相色谱小瓶中。

上清液应为澄清的淡黄色溶液。气相色谱温度设置如下：在150°C下保持2分钟，然后以每分钟3°C的速率升至280°C。

以每分钟20摄氏度的速率升温至300摄氏度，然后保持五分钟。对于30米长的气相色谱柱，将溶剂延迟时间设为约五分钟，质荷比范围设为60至500之间。运行后，采用1:5或1:10的分流比，进样体积为1 µL，载气为氦气，流速为1.2 mL/min，通过气相色谱-质谱联用仪（GCMS）分析样品。

使用 Microsoft Excel 分析 GCMS 数据。该图展示了每种氨基酸的气相色谱保留时间及其特有的质荷比峰。T-B-D-M-S。衍生化氨基酸通常在质谱中明显裂解为两个带电片段：M 减去 57 的片段，包含完整的氨基酸；以及 M 减去 159 的片段，缺少氨基酸的α-羧基。对于亮氨酸和异亮氨酸也是如此。

M减去57的峰被其他质谱峰碎片所重叠。N减去15可用于分析整个氨基酸的标记情况。此外，F 3 0 2 基团通常在大多数氨基酸中被检测到，它仅包含氨基酸骨架中的第一个α-羧基和第二个碳原子。

然而，由于该 Ms.Peak 通常信噪比较低，因此不推荐使用 F 3 0 2 进行代谢通量的定量分析。氨基酸或中心代谢物的衍生化会引入大量天然存在的同位素标记，包括碳13、氧18、硅29和硅30。原始质谱同位素或谱图中由天然同位素引起的测量噪声可通过使用已发表的软件进行校正。

最终的同位素标记数据以质量分数形式报告。例如，M0、M1、M2、M3 和 M4，代表含有零至四个碳-13标记的氰基碳的片段。该5 1 1 2不含苏氨酸氨裂解酶（three anine ammonia lyase），该酶在典型的异亮氨酸合成途径中催化苏氨酸转化为2-酮丁酸。

因此，为了阐明该生物体中的异亮氨酸合成途径，将集胞藻（Cyana Thesei）5 1 1 42 菌株在含有 54 毫摩尔甘油的 ASP 二号培养基中培养，并按照本视频所述方法进行 GCMS 分析，结果如图所示。集胞藻 5 1 1 42 利用第二位标记的甘油作为主要碳源，我们观察到苏氨酸和丙氨酸（其前体为丙酮酸）各含有一个标记碳原子，而异亮氨酸则含有三个标记碳原子。因此，集胞藻 5 1 1 42 中的异亮氨酸合成不能来源于大多数生物所采用的苏氨酸途径。另一方面，亮氨酸与异亮氨酸基于碎片 M 减 15 和碎片 M 减 159 具有相同的标记模式。

例如，来自含氮-15的完整氨基酸的同位素或数据表明，亮氨酸和异亮氨酸的标记模式相同。因此，亮氨酸和异亮氨酸必须由相同的前体物质——丙酮酸和乙酰辅酶A合成。该观察结果与柠檬酸-苹果酸途径中用于异亮氨酸合成的标记碳原子转化过程一致。

该方法可用于研究多种微生物的代谢，一旦掌握，可在约一周内完成从开始到结束的全部流程。