Name: 一个培养人关节软骨细胞的三维系统在滑液 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 了解利用滑液培养人关节软骨细胞的三维培养系统，通过海藻酸钙微珠包埋技术实现长期培养。该方法可维持细胞活性并促进软骨基质表达，为关节炎治疗及软骨再生研究提供可靠的体外实验模型。

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我们感谢 Robin Nye（塔夫茨医学中心）、内村智也（Tomoya Uchimura）和 Dana Cairns（塔夫茨大学）在滑液储存和离心方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：1R01AR059106-01A1），资助对象为 L.Z.。

一种在滑液中培养人关节软骨细胞的三维系统
在本研究中，我们采用改良的制造商推荐包封方案（Lonza，以及31），将人关节软骨细胞包封于海藻酸盐微球中。利用这些三维结构，我们建立了一种在含有不同比例人滑膜液的培养基中培养细胞的体系，并评估了这些三维结构中软骨相关基因的表达情况。
1. 准备用于三维（3D）包封的人关节软骨细胞（HAC）
<ol>
	<li>将一管人关节软骨细胞（HAC）（Lonza）（第2代）在37°C水浴中解冻1分钟。</li>
	<li>加入1 ml软骨细胞生长培养基（Lonza），在3000 rpm条件下离心3-5分钟以收集细胞，弃去上清液。</li>
	<li>用软骨细胞生长培养基（Lonza）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞接种至10 cm组织培养皿（BD Biosciences）中，使用软骨细胞生长培养基（Lonza）培养至细胞融合。人关节软骨细胞应使用不超过第3或第4代（P3或P4）的细胞。</li>
	<li>用155 mM NaCl溶液而非标准PBS洗涤培养皿中的HAC，随后进行胰蛋白酶消化以收集细胞用于海藻酸盐微珠包封。待细胞脱落后，在3000 rpm条件下离心5分钟。此时细胞已准备好进行三维包封。</li>
</ol>
2. 将HACs包封到3D微珠中
将HACs重悬于1.2%的海藻酸钠溶液（Sigma）中，细胞密度为8×105个细胞/mL。在包封前需使用标准细胞计数仪确定细胞数量。充分混匀至关重要，以确保细胞在微珠中分布均匀。
<ol>
	<li>将HAC/海藻酸盐溶液混合物用移液器吸入一个连接22号针头（Tyco healthcare, Inc.）的12 ml注射器中。</li>
	<li>同时，准备一个50 mL烧杯，加入体积为HAC/海藻酸盐溶液体积5倍的102 mM CaCl2溶液。在烧杯中放入搅拌子，并以约150 rpm的速度缓慢搅拌102 mM CaCl2溶液。</li>
	<li>将注射器针尖保持在CaCl2溶液液面上方约6英寸处，逐滴将HAC/海藻酸盐混合物加入CaCl2溶液中。通常情况下，形成的海藻酸盐微球直径为2 mm，包封密度约为104个细胞/微球。注意：注射器距CaCl2溶液的高度至关重要，距离过短会导致微球呈泪滴状而非球形，从而造成机械强度不均和细胞包封不均。</li>
	<li>让微球在CaCl2溶液中搅拌20–25分钟。尽管其他海藻酸盐包封方案建议较短的10分钟孵育时间，但我们发现延长在CaCl2溶液中的孵育时间有助于增强微球的完整性。</li>
	<li>去除CaCl2溶液，用2–3倍体积的NaCl溶液洗涤微球2–3次，再用软骨细胞分化培养基（Lonza）洗涤一次。虽然其他海藻酸盐微球包封方案使用滤膜进行上述洗涤步骤，但我们发现微球常被截留在滤膜中并干燥，从而降低包封效率。我们发现最有效的方法是在倾倒溶液前让微球自然沉降到烧杯底部。</li>
	<li>使用标准刮勺将微球转移至培养皿中。我们通常在软骨细胞生长培养基中，每3 cm孔培养12个微球，培养2天，使软骨细胞适应包封过程；之后更换为含滑膜液的软骨细胞分化培养基（Lonza）继续培养。</li>
</ol>
3. 在滑膜液培养基中培养软骨细胞
<ol>
	<li>可从门诊诊所获取新鲜的滑液（我们从塔夫茨医学中心获取滑液）。将滑液转移至15 ml Falcon管中并立即送至实验室，以3000 rpm离心15分钟以去除细胞碎片。将无细胞的滑液分装至1.5 mL微量离心管中，以避免反复冻融。上清液可于-80°C保存至使用。</li>
	<li>在培养前，将滑液与软骨细胞分化培养基（CDM，Lonza）按不同体积比混合，同时保持100 mM抗坏血酸和9 mM CaCl2的恒定浓度（此微量CaCl2用于确保海藻酸盐微珠的完整性）。</li>
	<li>将培养板置于37°C培养箱内的摇床上（摇动频率约75次/分钟），以促进海藻酸盐微珠内部的营养物质分布，并减少微珠聚集。这一点在长期培养软骨细胞（长达4周）时尤为重要。注意：尽管软骨细胞生长与分化培养基（Lonza）含有两种常用抗生素——庆大霉素和两性霉素，但在使用不同比例滑液进行软骨细胞培养时，我们未额外添加任何抗生素。实验过程中从未观察到污染现象。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基混合物。在长期培养过程中，滑液的黏度一直是海藻酸盐微珠包封软骨细胞培养的主要障碍。我们发现，将含滑液的培养基用102 mM CaCl2（50% V/V）稀释最为有效，该处理同时可增强海藻酸盐微珠的结构完整性。通过此方法，可用移液器缓慢移除培养基而不损伤微珠。</li>
</ol>
4. 收集海藻酸盐微珠中的HAC用于基因表达分析
在从海藻酸盐微珠中收获HACs用于基因表达分析时，必须格外小心。
<ol>
	<li>用 102 mM CaCl2 溶液洗涤海藻酸盐微珠 3 次，每次约 5 分钟。</li>
	<li>加入体积为微珠 4–5 倍的 55 mM 柠檬酸钠（NaCitrate）以回收软骨细胞。需确保海藻酸盐微珠完全浸没于柠檬酸钠溶液中。振荡或摇动 20–30 分钟。</li>
	<li>离心收集细胞，弃去上清液。</li>
	<li>进行 RT-PCR 分析时，将细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液（Qiagen RNA 提取试剂盒）中，随后进行 RNA 纯化。</li>
</ol>
5. 用海藻酸盐微珠固定 HACs 以进行组织学分析
进行组织学分析时，必须特别小心地从3D微珠中收获HACs。
<ol>
	<li>用 102 mM CaCl2 溶液清洗海藻酸盐微珠 3 次，每次约 5 分钟。为彻底去除黏稠的滑液，我们发现最有效的方法是使用软骨细胞分化培养基（Lonza）在 37°C 培养箱中振荡过夜清洗（振荡频率：约 75 次/分钟）。使用软骨细胞生长培养基可确保软骨细胞在长时间清洗过程中的存活，并促进固定剂最大程度地渗透。</li>
	<li>将微珠在 70% 乙醇中固定过夜，随后进行组织学分析。如需进行 DAPI 染色，将海藻酸盐微珠与 DAPI 溶液（500 ng/ml）在轻柔振荡条件下孵育 1 小时，然后用 102 mM CaCl2 溶液清洗 3 次，每次 15 分钟。DAPI 荧光图像可在荧光显微镜下观察。微珠也可切片后进行阿利新蓝（alcian blue）和苏木精-伊红（H&amp;E）染色。</li>
</ol>
6. 代表性结果
我们用于在高比例滑膜液中培养人软骨细胞的3D培养方法如图1所示的示意图。在将人软骨细胞包埋于海藻酸盐微珠后，将其置于添加不同比例滑膜液的培养基中进行培养。由于滑膜液具有较高黏度，因此必须在持续振荡条件下培养软骨细胞，以防止软骨结构聚集，并确保营养物质均匀分布。此外，在回收软骨细胞前必须对海藻酸盐微珠进行充分洗涤，以便固定液或裂解缓冲液能够渗透进入微珠内部（图1）。图2展示了海藻酸盐微珠中软骨细胞的明场（BF）图像。通过DAPI染色确认了细胞在微珠内的均匀分布情况（图2）。在21天培养期结束时，采用qRT-PCR进行基因表达分析。所有PCR均以GAPDH作为参考基因进行标准化，因其被确定为软骨细胞qPCR分析中最可靠的参考基因之一32。图3展示了一个示例，其中我们分析了来自6名骨关节炎患者混合滑膜液中培养的人关节软骨细胞的结果。与Lonza来源的软骨细胞已在2D培养中扩增、不可避免地导致去分化33的事实一致，我们发现第0天的软骨细胞几乎不表达软骨基质相关基因（图3）。使用软骨细胞分化培养基（Lonza）或添加滑膜液的培养基进行3D培养，显著提高了胶原蛋白、聚集蛋白聚糖（aggrecan）和MMP13等软骨相关基因的表达水平，表明至第21天软骨细胞发生了再分化（图3）34。随着培养基中滑膜液比例的增加，软骨基质标志物II型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达水平保持在相似水平（图3A和3B）。此外，与仅在普通培养基中培养的细胞相比，在100%滑膜液中培养的软骨细胞甚至表现出软骨降解酶MMP13的mRNA表达下降（图3C）。有趣的是，细胞死亡标志物caspase 3的表达水平随着滑膜液比例的增加而逐渐降低，提示滑膜液培养可减少细胞凋亡水平（图3D）。因此，我们的结果表明，在3D条件下使用高比例滑膜液培养人关节软骨细胞是一种可行的技术。
表格与图示
<img alt="软骨细胞包封与培养示意图；基因表达分析设置；细胞回收过程。" src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1."> 
图1. 在三维海藻酸盐微珠中以高比例滑液培养人关节软骨细胞的方法示意图。首先，将软骨细胞与海藻酸盐溶液混合。当逐滴加入CaCl2溶液时，软骨细胞被固定在交联的Ca-海藻酸盐水凝胶微珠内。这些三维结构随后在软骨细胞分化培养基（Lonza）中培养，并添加不同比例的人滑液。在摇床条件下培养21天后，对含细胞的海藻酸盐微珠进行充分洗涤，随后回收细胞用于基因表达分析。
<img alt="荧光和细胞结构分析的连续显微图像。" src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2。 包含 0%、30%、50%、70% 和 100% 滑膜液的人类关节软骨细胞包封培养物的明场（BF）和 DAPI 图像。在所有培养条件下，软骨细胞均呈球形。叠加明场（BF）与 DAPI 图像以确认软骨细胞的位置和分布。插图：放大图像。箭头：BF 与 DAPI 染色图像中软骨细胞的共定位。
<img alt="胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、MMP13、Caspase3 mRNA 表达柱状图，D0 与 D21 比较。" src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3."> 
图 3. 包封的人关节软骨细胞在培养第 0 天（D0）及添加不同比例滑膜液（SF）（0%、30%、50%、70% 和 100%）培养 21 天后（D21）的 qRT-PCR 分析结果。此处显示四个独立样本的结果。所有 PCR 均以 GAPDH 作为内参。A. II 型胶原 mRNA 表达。B. 聚集蛋白聚糖 mRNA 表达。C. MMP13 mRNA 表达。D. Caspase 3 mRNA 表达。使用 INSTAT 软件对 0% 与 100% 滑膜液（SF）培养条件下的第 0 天和第 21 天样本进行统计学显著性分析。* 表示 P&lt;0.05。

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<li>Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+positively+the+proliferation+of+bovine+satellite+cells+and+their+myogenic+differentiation+through+up-regulation+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD.</a> Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).</li>
<li>Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chondrocytic+gene+expression+by+biomechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Eukaryot.+Gene.+Expr%22%5BJournal%5D)">Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals.</a> Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).</li>
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<li>Anat, J. 121, 107-118 (1976).</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

本报告中，我们建立了一种方法，可在含有高浓度人源滑膜液的培养基中，将人关节软骨细胞置于三维环境中进行培养。滑膜液是构成关节腔内自然环境的主要成分之一，而关节软骨细胞即位于此环境中。然而，滑膜液的高黏度一直是软骨细胞三维长期培养的主要挑战。为克服在黏性环境中维持三维结构内营养物质均匀分布的难题，并防止细胞聚集，我们通过轻柔摇动使软骨构建物保持持续运动。为增强软骨构建物的结构完整性，我们对传统将软骨细胞接种至海藻酸盐水凝胶的步骤进行了改进，包括优化微珠形成时间及换液操作31。在长期培养过程中，当软骨构建物需在黏稠的滑膜液中操作时，这些步骤尤为关键。
 我们认为，该方法将使我们能够在天然环境——滑液中研究人关节软骨细胞的生物学特性。一个潜在的问题是，包裹在海藻酸盐微球中并在黏稠环境中生长的软骨细胞，其试剂扩散可能并不理想。因此，在研究特定试剂对工程化软骨的影响时，可通过减小海藻酸盐微球的尺寸以及采用灌注系统来促进试剂在滑液中的分布，从而实现更佳的扩散效果。尽管我们的代表性结果来源于在骨关节炎患者来源的滑液中培养正常人软骨细胞，但我们认为该方法可推广应用于其他健康个体...

<table><tbody><tr><td colspan="4">特定试剂与设备列表：</td></tr><tr><td>试剂名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注</td></tr><tr><td>海藻酸钠（海藻酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2158-250G</td><td>2.4% 溶液，储存于 40&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>氯化钙二水合物，颗粒状</td><td>JT Baker</td><td>A19339</td><td></td></tr><tr><td>软骨生成生长培养基</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156（基础培养基）</td><td></td></tr><tr><td>CC-4409（添加剂）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>软骨生成分化培养基</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3226（基础培养基）</td><td></td></tr><tr><td>CC-4408（添加剂）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人关节软骨细胞</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>Dapi（4&amp;#8242;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒（用于RNA提取）</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>PCR试剂：SYBR Green</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95053-500</td><td></td></tr><tr><td>12 ml 注射器</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>512852</td><td></td></tr><tr><td>22 号皮下注射针头</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>平台摇床</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Vari-mix</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原正向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>II型胶原反向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>MMP13 正向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>MMP13 反向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Caspase 3 正向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Caspase 3 反向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3&amp;rsquo;</td></tr></tbody></table>

一种用于在滑液中培养人关节软骨细胞的三维培养系统

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

软骨破坏是骨关节炎的核心病理特征，而骨关节炎是美国导致残疾的主要原因之一。成年个体的软骨自我再生能力较弱 体内；因此，骨关节炎会导致不可逆的软骨丧失，并伴有慢性疼痛和活动障碍 1,2软骨组织工程在再生和恢复组织功能方面展现出广阔前景。该技术通常将软骨细胞接种于天然或合成支架材料中，形成三维结构，并在平衡的培养基中进行一段时间的培养，旨在构建出具有成熟生化特性和生物力学性能的组织，可用于移植修复缺损部位 体内 3-6实现软骨细胞生长和基质沉积的最佳条件对于软骨组织工程的成功至关重要。 
 在天然的关节腔内，覆盖于骨关节表面的软骨浸润在滑液中。这种透明且黏稠的液体为无血管的关节软骨提供营养，并含有对软骨细胞代谢至关重要的生长因子、细胞因子和酶7,8。此外，滑液主要通过分泌两种关键成分——透明质酸和润滑素，实现软骨表面之间的低摩擦运动9 10。相比之下，组织工程软骨通常在人工培养基中培养。尽管这些培养基可能更有利于对软骨细胞代谢进行条件明确的研究，但滑液更能准确反映关节软骨细胞所处的天然微环境。
 事实上，滑液具有易于获取和保存的优点，并且通常可由机体定期补充。多个研究团队在培养人、牛、兔和狗的软骨细胞时，已在培养基中添加了滑液，但大多仅使用较低浓度的滑液（低于20%）11-25。尽管已有研究在含有较高比例滑液的培养基中培养鸡、马和人的软骨细胞，但这些培养系统均为二维培养系统26-28。本文中，我们介绍一种在三维培养系统中使用高比例滑液（最高达100%）培养人关节软骨细胞的方法，培养周期为21天。在此过程中，我们克服了滑液高黏度带来的主要技术难题。该系统使得在三维环境中研究滑液对人软骨细胞的影响成为可能，并可进一步结合构成软骨天然生长环境的另外两个重要因素——氧张力和机械负荷29,30，从而模拟软骨生长的自然微环境。此外，该系统还可用于检测滑液对软骨细胞的生物学活性，为开发软骨再生技术和关节炎的治疗方案提供一个研究平台。

介绍了一种在高水平滑液环境中培养人关节软骨细胞的三维体系。滑液最能反映关节软骨的天然微环境，且易于获取和保存。因此，该体系可用于研究软骨再生以及筛选治疗关节炎的药物。

软骨破坏是骨关节炎的核心病理特征，而骨关节炎是美国导致残疾的主要原因之一。成人的软骨不会……

以下实验的总体目标是在长期培养中利用滑膜液培养人关节软骨细胞。该目标首先通过将软骨细胞包埋于海藻酸盐微珠中实现，随后在滑膜液中对软骨细胞进行培养，从而使其在模拟正常生长条件的三维环境中增殖。需要定期更换培养基，以确保细胞充分获得营养物质。该实验步骤的最后一步是从海藻酸盐微珠中收获软骨细胞，用于基因表达和组织学分析。这些分析结果证实，在海藻酸盐微珠中培养的软骨细胞具有活性，能够增殖，并表达大量软骨基质。与现有方法相比，使用该技术的主要优势在于，我们是在三维环境中而非二维条件下分析软骨细胞。此外，我们使用滑液作为培养基，而非人工培养基。因此，结合三维结构和滑液的使用，使我们能够在更接近自然的环境中进行分析，而不是在培养板上的二维环境和人工培养基中进行。该方法有助于解答软骨生物学和组织工程领域的关键问题。例如，软骨细胞在滑液中长期孵育时会表现出何种行为？此外，在将软骨细胞移植到宿主体内之前，是否应先使其适应滑液环境？将一毫升冻存的人类关节软骨细胞或 HACS 置于温水中解冻一分钟，以进行准备。然后将 HACS 混入含有两毫升预热软骨细胞生长培养基的冻存管中。为去除含有 DMSO 的冻存液，于 3000 RPM 离心 3 至 5 分钟使细胞沉淀，弃去上清液，并将细胞重悬于七毫升软骨细胞生长培养基中。接着，将细胞转移至10厘米培养皿中，培养至细胞汇合。Hacks细胞的传代次数不应超过三到四代。待细胞汇合后，使用氯化钠溶液而非PBS洗涤Hacks细胞。然后使用0.5毫升标准胰蛋白酶EDTA溶液消化细胞并收集。待细胞脱落后，离心沉淀，即可用于三维包埋。吸取离心后的细胞沉淀，弃去上清液，然后将其重悬于1.2%海藻酸钠溶液中，细胞密度为每毫升80万个细胞。现在配制体积为海藻酸钠溶液五倍的氯化钙溶液。在配制海藻酸钠溶液的同时，保持氯化钙溶液缓慢搅拌。用移液器将海藻酸钠溶液转移至一支连接22号针头的12毫升注射器中。当氯化钙溶液准备好后，将注射器尖端置于氯化钙溶液表面约六英寸高处。注射器的高度已到位。氯化钙溶液非常重要。如果高度不够，珠子将无法形成球形。然后逐滴加入海藻酸盐混合液。通常得到的珠子直径约为2毫米，每粒珠子含有约10⁴个细胞。为增强微珠的完整性，将微珠在溶液中搅拌 20 至 25 分钟。搅拌完成后，静置微珠使其沉降，并倾去氯化钙溶液。随后，用约等于微珠体积 2 至 3 倍的氯化钠溶液洗涤微珠 2 至 3 次。不要使用滤器，而在更换洗涤液间隙让磁珠自然沉降，以保持其湿润。在氯化钙洗涤步骤之后，用软骨细胞分化培养基洗涤一次。然后使用刮铲将磁珠转移至培养皿中，在软骨细胞生长培养基中培养 48 小时，之后再更换为软骨细胞培养基。含有滑液的分化培养基，滑液必须在采集后立即制备。将新鲜滑液转移至15毫升离心管中，并立即以3000 RPM离心15分钟。为去除细胞碎片，取上清液，即无细胞的滑液，分装至1.5毫升微量离心管中，于-80摄氏度保存，直至确定滑液的最佳浓度。使用不同体积比的滑液与软骨细胞分化培养基配制培养液，其中抗坏血酸和氯化钙的浓度保持恒定。将培养板置于37摄氏度的摇床培养箱中。每两到三天更换一次培养基，更换前先移除旧的培养基。用氯化钙溶液稀释以降低其黏度，同时增强微珠的完整性。然后缓慢地将微珠从培养板中移出。微珠可培养长达四周后再进行收获，具体时间取决于其增殖情况、基质产生量以及实验目的。在从海藻酸盐微球中收获软骨细胞以进行基因表达或组织学分析时，若进行基因表达分析，则用氯化钙溶液将海藻酸盐微球清洗三次，过程中不使用滤膜。通过将微球浸入体积为微球体积四到五倍的柠檬酸钠溶液中来分离软骨细胞。振荡混合物20至30分钟，然后将细胞在15 mL离心管中离心沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于常规试剂盒的细胞裂解缓冲液中，按照标准化的RNA纯化方案进行操作，以制备用于固定的洗涤磁珠。在氯化钙洗涤后，加入Wash Inc. 软骨分化培养基过夜。将珠子置于 2 毫升 70% 乙醇中，在 4 摄氏度下固定超过 15 分钟，随后进行组织学分析以进行 dappy 染色。将海藻酸盐珠子在 DAPI 溶液中孵育 1 小时，同时轻轻振荡。然后用氯化钙溶液洗涤珠子三次，再在荧光显微镜下观察海藻酸盐珠子。这些微珠也可进行切片，用于伊文思蓝（Ian Blue）和苏木精-伊红（H&E）染色。对DAPPY染色的海藻酸盐微珠进行组织学切片，并叠加明场图像，结果显示，在所有培养条件下（从不含滑膜液的培养基到完全基于滑膜液的培养基），微珠内的细胞均呈现均匀分布。在21天培养期结束时，检测了来源于6例骨关节炎患者的混合滑膜液中培养的人关节软骨细胞的基因表达，结果与既往报道一致。第0天的软骨细胞几乎不表达软骨基质基因；而在软骨细胞分化培养基中进行三维（3D）培养，或在添加滑膜液的培养基中培养，均显著提高了II型胶原（collagen two）、ACAN和MMP13等软骨相关基因的表达水平，表明软骨细胞发生了再分化。到第21天时，随着培养基中滑膜液比例的增加，软骨基质标志物的水平达到可比程度。在100%滑膜液中培养的软骨细胞，其II型胶原和ACAN mRNA的表达甚至表现出较单独培养基中培养的细胞更低的软骨降解酶MMP13 mRNA表达水平。有趣的是，细胞死亡标志物caspase-3的表达水平随着滑膜液比例的增加而逐渐降低，提示滑膜液培养可降低细胞凋亡水平。因此，在三维环境中培养人关节软骨细胞并维持高水平的滑液是一种可行的技术。一旦掌握，包封技术的完成时间可不到一小时。在更换培养基时，务必彻底清洗凝胶珠。同时，使用移液器时需注意避免损坏珠子。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个培养人关节软骨细胞的三维系统在滑液

软骨细胞合成软骨细胞外基质的过程可受到机械刺激的影响。本方法描述了对包埋于三维结构中的软骨细胞施加动态压缩应变的技术，以及评估软骨细胞代谢变化的方法。...

软骨细胞-琼脂糖水凝胶的机械刺激

本文所述方法展示了如何将商用喷墨打印机改装为具有同步紫外光聚合功能的生物打印机。该打印机能够利用细胞和生物材料构建三维组织结构。本研究成功构建了三维新生软骨。...

利用三维喷墨打印技术制备人类软骨组织

软骨修复是一项尚未满足的医学挑战，而基于细胞的人关节软骨组织工程技术是一种有前景的解决方案。本文中，我们描述了三维（3D）仿生水凝胶作为扩增和成熟人关节软骨细胞的理想工具。...

用于关节软骨细胞培养与软骨生成的三维水凝胶支架

本文介绍了一种在自组装肽支架中建立三维培养系统以促进去分化的成人关节软骨细胞向类软骨组织分化的实验方案。...

在三维肽支架中培养哺乳动物细胞

本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。...

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

本文提供了用于软骨细胞压缩的气动微流控装置的制备与表征的详细方法。...

一种用于对软骨细胞施加动态压缩刺激的微流控平台

我们提供了从人源间充质干细胞生成四种组织的详细方法，这些组织用于模拟人类膝关节中的软骨、骨、脂肪垫和滑膜。这四种组织被整合到一个定制的生物反应器中，并通过微流控系统相互连接，从而构建出膝关节芯片。...

创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

本方案详细描述了从人关节软骨中分离软骨细胞、纤维连接蛋白黏附实验衍生的软骨祖细胞（FAA-CPs）以及迁移性软骨祖细胞（MCPs）的方法。内容涵盖用于分离和鉴定这些细胞的酶消化、纤维连接蛋白黏附以及基于迁移的实验方法。...

利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

本研究描述了一种通过在低黏附条件下利用重力使细胞聚集形成软骨细胞球体，随后将所得球体在微型生物反应器中进行培养的方法。...

利用重力条件和自制微型生物反应器在低黏附环境下由不同软骨细胞生成球状体

一种使用关节滑膜炎的临床前模型 离体 具有保留功能与结构的人类滑膜组织

了解利用滑液培养人关节软骨细胞的三维培养系统，通过海藻酸钙微珠包埋技术实现长期培养。该方法可维持细胞活性并促进软骨基质表达，为关节炎治疗及软骨再生研究提供可靠的体外实验模型。

一种用于在滑液中培养人关节软骨细胞的三维培养系统

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