Name: 赖氨酸去甲基化酶活性的定量测量中的应用的MassSQUIRM (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习使用MALDI质谱和同位素标记化学法定量测量赖氨酸去甲基化酶活性的MassSQUIRM方法。该技术通过还原甲基化反应提高检测准确性，为表观遗传学研究提供可靠工具。

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感谢UAMS蛋白质组学中心提供的质谱技术支持。本项目的资助来自美国国立卫生研究院（NIH）基金项目P20RR015569、P20RR016460和R01DA025755。

本方案修改自 Blair et al. 6。
1. LSD1 去甲基化实验
<ol>
	<li>在终体积为 20 μL 的体系中，将 125 ng 重组 LSD1 与 0.25 μg 二甲基化组蛋白 H3 肽（ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-生物素）在去甲基化酶缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 8.5，50 mM KCl，5 mM MgCl2，5% 甘油）中混合。此外，设置一个不含酶的肽段对照组。该对照组用于第 3 部分，无需进行还原性甲基化。</li>
	<li>在 37°C 下孵育 2 小时。</li>
	<li>为收集肽段，向每个样品中加入 8 μL POROS R2 20 微米磁珠，并在室温下振荡 15 分钟。使用前将 1 体积磁珠与 1 体积甲醇混悬，再加入 10 体积的 5% 甲酸 / 0.2% 三氟乙酸进行预处理。</li>
	<li>通过移液器吸取 20 μL 0.1% 三氟乙酸进入两个 C18 ZipTip 柱尖并推出，对柱尖进行预处理。重复此步骤两次（使用 0.1% 三氟乙酸），然后用 70% 乙腈 / 0.1% 三氟乙酸冲洗四次，最后再用 0.1% 三氟乙酸冲洗四次。</li>
	<li>通过移液器将两个样品（对照组和去甲基化反应组）加载至预处理后的 C18 ZipTip 柱尖，将磁珠悬液加至柱尖内的 C18 树脂后方，并推动液体穿过柱尖。</li>
	<li>用 20 μL 0.1% 三氟乙酸洗涤 ZipTip 柱尖两次。</li>
	<li>用 40 μL 70% 乙腈 / 0.1% 三氟乙酸进行洗脱。</li>
	<li>使用 SpeedVac 浓缩仪将每次洗脱液完全冻干。</li>
</ol>
2. 还原性甲基化
本实验方案的此部分内容修改自 Blair et al. 和 Rayment et al.6,7。
<ol>
	<li>用 100 μL 的 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重悬去甲基化反应体系。</li>
	<li>向去甲基化反应体系中加入 8 μL 的 15 mg/mL 二甲胺硼烷。二甲胺硼烷溶于 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，配制成 15 mg/mL 的储存液，需新鲜配制。</li>
	<li>向去甲基化反应体系中加入 16 μL 的 250 mM 氘代甲醛。250 mM 氘代甲醛通过将储存液用 H2O 稀释制得，需新鲜配制。</li>
	<li>在 4°C 下孵育 2 小时。</li>
	<li>重复步骤 2.2、2.3 和 2.4。</li>
	<li>重复步骤 2.2。</li>
	<li>在 4°C 下孵育约 15 小时。</li>
	<li>向去甲基化样品中加入 12.5 μL 的 1 M Tris（pH 7.4），以终止还原性甲基化反应。</li>
</ol>
3. 基质辅助激光解吸电离质谱
<ol>
	<li>将 POROS R2 20 微米珠加入去甲基化反应中，并按照步骤 1.3-1.6 所述方法通过 ZipTip 收集。</li>
</ol>
注意：将对照品在100 μL、pH 7.4的50 mM磷酸盐缓冲液中重悬，并从第3.1步开始与其他样品同样处理。
<ol start="2">
	<li>使用 2 μL 的 33% 饱和 2,5-二羟基苯甲酸将对照组和去甲基化酶反应样品从 ZipTip 上洗脱至 MALDI 样品靶板。配制 33% 饱和 2,5-二羟基苯甲酸的方法：先用 70% 乙腈 / 0.1% TFA 配制 2,5-二羟基苯甲酸的饱和溶液，再用 70% 乙腈 / 0.1% TFA 将其稀释至 33% 饱和浓度。让洗脱后的样品自然干燥并结晶。</li>
	<li>使用 PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF 质谱仪或可用的高分辨率 MALDI 质谱仪采集质谱数据8,9,10。</li>
	<li>使用 PerkinElmerSciex TOFworks 软件或质谱仪制造商提供的软件查看质谱图并提取峰面积。</li>
	<li>通过具备串联质谱功能的可用质谱系统进行 MS2 分析，以确认反应产物。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>为了补偿使用重甲醛（图1B）所引起的同位素重叠，测定对照样品（未进行还原性甲基化）中13C2和13C4同位素峰面积（A）相对于单一同位素峰的比值（图2A）。 
	公式1：A13C2/A12C = r1 
	公式2：A13C4/A12C = r2 
	这将得到在您的实验条件和质谱仪下，肽段处于这些同位素状态的特异性比值（r1 和 r2）。</li>
	<li>在去甲基化酶反应样品中，使用以下公式中的 r1 和 r2 值，定量各修饰状态下肽段的相对含量（图2B）： 
	公式3：H3K4me2 = A1 
	公式4：H3K4me = A2 - r1(A1) 
	公式5：H3K4 = A3 - r2(A1) - [r1(A2 - r1(A1))]</li>
</ol>
5. 代表性结果
利用LSD1，我们展示了MassSQUIRM在定量赖氨酸去甲基化反应中的有效性。如实验方案部分所述，我们使用125 ng的LSD1和0.25 μg二甲基化组蛋白H3肽（ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-生物素）进行了去甲基化酶反应。对照组和去甲基化酶反应样品均经过还原性甲基化处理，并进行MALDI质谱分析。未进行还原性甲基化的对照反应显示出该肽典型的同位素峰簇，并为公式1和公式2提供了峰面积（图2A）。去甲基化酶反应的质谱图则为公式3至公式5提供了峰面积（图2B）。根据对照组和去甲基化酶反应的峰面积计算，我们确定LSD1催化该肽生成如下反应产物：33.7%的Lys4二甲基化形式、42.3%的Lys4单甲基化形式以及24%的Lys4未甲基化形式。有关LSD1去甲基化酶活性的完整分析及抑制剂研究，请参见Blair et al. 6。请注意，改变反应时间、酶浓度和底物浓度等变量可实现对酶活性的深入分析。
<img alt="蛋白质测序流程图；质谱分析；肽段碎裂及强度。" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. MassSQUIRM 方法概述。（A）组蛋白 H3 的一个N端肽段在赖氨酸4位点可处于未甲基化（绿色）、单甲基化（红色）或双甲基化（蓝色）状态。每种肽段化学组成的差异导致离子化效率不同，从而使定量分析变得复杂。（B）还原性甲基化将所有赖氨酸残基转化为双甲基化状态，使所有肽段的离子化行为趋于一致。在还原性甲基化反应中使用重甲醛可保留原始甲基化状态的信息。空心圆圈表示轻甲基化，实心圆圈表示重甲基化。 修改自 Blair et al. 20116。
<img alt="质谱分析；显示肽段同位素标记的 m/z 图谱；色谱结果。" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. MassSQUIRM 可用于定量差异甲基化的肽段。（A）采用质谱分析二甲基化合成组蛋白 H3 肽段（ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-生物素），并在方程 1 和方程 2 中将各峰相对于单一同位素峰的峰强比值记为 r1 和 r2。（B）将相同的合成肽段在去甲基化缓冲液中与 125 ng LSD1 于 37°C 孵育两小时，随后进行 MassSQUIRM 分析。重叠峰组成的混合峰群代表了三种不同的甲基化状态，如图 1B 所示。单一同位素峰下的面积分别记为 A1、A2 和 A3，并用于方程 3 至方程 5 的计算。空心圆圈表示轻度甲基化，实心圆圈表示重度甲基化。改编自 Blair 等，20116。

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

MassSQUIRM 是一种经济且定量的方法，用于全面分析参与单甲基化和二甲基化过程的赖氨酸去甲基化酶的活性。MassSQUIRM 不仅能够定量反应产物，还能定量反应中间体。该检测方法可作为研究 LSD1 及其他组蛋白去甲基化酶作用机制的有力工具。它还将有助于对许多新发现的赖氨酸去甲基化酶（如 PHF8）进行分类，并可适用于某些甲基转移酶的研究。

<table><tbody><tr><td>LSD1</td><td>BPS 生物科学</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2-生物素化肽段</td><td>实验室制备</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>POROS R2 20 微米珠</td><td>应用生物系统公司</td><td>1-1129-06</td><td></td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; ZipTip</td><td>EMD Millipore</td><td>ZTC18M</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>2,5-二羟基苯甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td></td></tr><tr><td>硼烷二甲胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>180238</td><td></td></tr><tr><td>同位素偏重 &lt;em&gt;d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;-甲醛</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>DLM-805-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fluka</td><td>06440</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Na-磷酸盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 浓缩仪</td><td>天才</td><td>DNA110</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-prOTOF 质谱仪和 TOFworks 软件</td><td>珀金埃尔默股份有限公司</td><td>无</td><td></td></tr></tbody></table>

masssquirm 定量检测赖氨酸去甲基化酶活性的应用

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

近年来，表观遗传调控因子已被发现是多种疾病中的关键因素1-3。因此，这些酶成为小分子研究和药物开发的主要靶点4。许多表观遗传调控因子是最近才被发现的，目前仍处于分类过程中。其中一类酶为赖氨酸去甲基化酶，可从组蛋白及其他蛋白质的赖氨酸残基上移除甲基基团。由于这类酶具有新颖性，目前开发用于研究其活性的检测方法还很少。这已成为组蛋白去甲基化酶分类及高通量研究的障碍。目前存在的去甲基化酶检测方法极少，且多数为定性性质，无法同时区分不同的赖氨酸甲基化状态（无甲基、单甲基、双甲基和三甲基）。质谱分析常用于测定去甲基化酶活性，但现有的质谱检测方法并未解决不同甲基化程度的肽段电离效率不同的问题。甲基化肽段的差异性电离使得甲基化状态之间的比较变得困难，且显然无法实现定量分析（图1A）。因此，现有检测方法尚未优化，无法对去甲基化酶活性进行系统全面的分析。
本文介绍一种称为 MassSQUIRM（基于同位素还原性甲基化的质谱定量法）的方法，该方法利用氘代甲醛对胺基进行还原性甲基化，使所有赖氨酸残基均被二甲基化，从而使其成为基本相同的化学物种，因此具有相同的电离效率（图1B）。还原性甲基化后的唯一化学差异在于氢与氘，而这种差异不会影响基质辅助激光解吸电离（MALDI）的电离效率。MassSQUIRM 检测法特异性针对去甲基化反应产物，适用于含有未甲基化、单甲基化或二甲基化赖氨酸的样品。该方法同样适用于产生相同反应产物的赖氨酸甲基转移酶。在此，我们结合还原性甲基化化学与 MALDI 质谱技术，检测 LSD1（一种能够去除二甲基和单甲基基团的赖氨酸去甲基化酶）在合成肽底物上的酶活性5。该检测方法操作简便，任何具备实验室 MALDI 质谱仪或可通过蛋白质组学平台获取该设备的实验室均可开展。该方法具有约 8 倍的动态检测范围，并可轻松扩展至微孔板格式5。

我们介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离质谱结合还原性甲基化化学方法来定量分析赖氨酸甲基化变化的技术。

MassSQUIRM 定量检测赖氨酸去甲基化酶活性的应用

近年来，表观遗传调控因子已被发现是多种不同疾病中的关键参与者1-3。因此，这些酶成为小分子药物研发的主要靶点……

质量squirm技术旨在利用同位素标记甲基化和基质辅助激光解吸电离质谱法来定量赖氨酸去甲基化酶活性。首先，在含有甲基化赖氨酸的肽段上进行酶促去甲基化反应；随后，使用氘代甲醛对去甲基化反应产生的肽段产物进行化学再甲基化，生成完全甲基化的肽段，使其在基质辅助激光解吸电离过程中具有相同的离子化效率；接着，通过多级质谱对每种肽段种类进行定量，并校正同位素峰重叠效应。为了鉴定未甲基化、单甲基化、二甲基化和三甲基化肽段的相对含量，质量squirm技术根据质量变化来确定每种去甲基化反应产物的相对丰度。与常规的霉菌质谱等现有方法相比，该技术的主要优势在于质谱评分能够考虑不同甲基化肽段之间电离效率的差异。我们最初是在开发一种利用同位素标记的重乙酸酐来测量组蛋白乙酰化水平的方法时，提出了这一思路。该技术面临的挑战是提取峰面积数据，而肽段同位素峰簇的重叠可能使这一过程变得复杂。将125纳克重组的特异性赖氨酸去甲基化酶1酶与0.25微克生物素标记的二甲基化组蛋白H3肽在20微升去甲基化酶缓冲液的终体积中混合，进行去甲基化反应。同时准备一个对照样品，其中含有0.25微克肽但不含LSD1酶，将反应管和对照管在37摄氏度下孵育两小时。接下来，为准备R2 20微米多孔珠，将等体积的珠子与甲醇混合。然后向样品中加入10倍体积的三氟乙酸-甲酸，每个样品加入8微升多孔微珠，室温下振荡15分钟。同时，对两个C18柱尖进行预处理：用20微升0.1%三氟乙酸-70%乙腈溶液吹打洗涤4次，再用20微升0.1%三氟乙酸溶液吹打洗涤4次。接下来，将两个样品加载到已活化的 Zip Tip 上。使用移液器将液体体积缓慢推过 C18 树脂，重复此操作，直至两个样品的总体积均完全通过 Zip Tip。随后用 20 微升 0.1% TFA 溶液洗涤 ZipTip 两次，再用 40 微升洗脱缓冲液洗脱样品，并使用真空浓缩仪将洗脱液完全干燥。首先将样品重悬于 100 微升 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，然后加入 8 微升硼氢化二甲胺和 16 微升去重水合甲醛。在 4 摄氏度下孵育 2 小时。加入硼氢化二甲胺和氘代甲醛，再次进行还原性甲基化反应，并孵育 2 小时。第三次加入硼氢化二甲胺，在 4 摄氏度下孵育 15 小时。用12.5微升1摩尔Tris（pH 7.4）终止反应，然后使用真空浓缩仪将样品完全干燥。首先，将对照组和去甲基化酶反应样品重悬于100微升50毫摩尔磷酸缓冲液（pH 7.4）中。现在向对照组和去甲基化反应样品中各加入八微升多孔微珠，按照之前所示方法用 Zip Tip 收集。用两微升体积洗脱至 MALDI 样品靶板上，室温下静置干燥至结晶。随后进行质谱分析。 将谱图文件导入工作软件，并导出至 m/z 软件。进一步通过串联质谱法验证反应产物。首先，测定对照样品中碳 13C2 和碳 13C4 同位素

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

赖氨酸去甲基化酶活性的定量测量中的应用的MassSQUIRM

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MassSQUIRM 定量检测赖氨酸去甲基化酶活性的应用

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