赖氨酸去甲基化酶活性的定量测量中的应用的MassSQUIRM

质量蠕动方案旨在使用同位素甲基化量化赖氨酸去甲基化酶活性，而 maldi 质谱法首先对含有甲基化赖氨酸的肽进行酶催化的去甲基化反应。然后残基将去甲基化酶反应的肽产物与氘代甲醛化学甲基化，产生均匀甲基化的肽，这些肽以相同的方式电离，然后用多对质谱法定量每种肽种类，并解释同位素重叠。为了鉴定 un mono 染料和 trimm 甲基化肽的相对量，质量蠕动结果根据质量变化确定每种去甲基化酶反应产物的相对量。

与常规霉菌质谱法等现有方法相比，该技术的主要优点是质量分数解释了不同甲基化肽之间的电离差异。当我们开发了一种使用同位素重乙酸酐测量组蛋白乙酰化水平的方法时，我们第一次有了这种方法的想法。该技术的挑战在于提取峰面积数据，而肽同位素包络的重叠可能会使数据复杂化。

对于去甲基化酶反应，将 125 ng 重组赖氨酸特异性去甲基化酶 1 酶与 0.25 μg 生物素化二甲基组蛋白 H 3 肽混合，最终体积为 20 μL 去甲基化酶缓冲液。此外，制备含有 0.25 μg 肽（不含 LSD、一种酶）的对照样品，将反应和对照管在 37 摄氏度下孵育 2 小时。接下来，为了制备 R，两个 20 微米多孔微珠混合等体积的微珠和甲醇。

然后加入 10 体积的 TFA 甲酸，向每个样品中加入 8 微升多孔微珠，并在室温下搅拌 15 分钟。同时，调节两个 C 18 拉链尖端。用 20 μL 0.1% TFA 移液 2 次，用 70% 乙腈橡胶 0.1% TFA 移液 4 次，用 0.1% TFA 再移液 4 次。

接下来，将两个样品加载到经过调节的拉链尖端上。使用移液器，将体积推入 C 18 填料中。重复上述步骤，直到两个样品的总体积都已推过拉链尖端。

然后用 20 微升 0.1% TFA 洗脱样品在 40 微升幻觉缓冲液中清洗拉链尖端两次，然后用高速真空浓缩器完全干燥。首先，将样品重悬于 100 μL 的 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液 pH 7.4 中。然后加入 8 微升孔径二甲基胺和 16 微升降额甲醛。

在 4 摄氏度下孵育 2 小时。通过加入钻孔二甲基胺和氘代甲醛重复还原甲基化，并孵育 2 小时。第三次，加入钻孔二甲基胺，在 4 摄氏度下孵育 15 小时。

用 12.5 微升 1 摩尔 tris. pH 7.4 淬灭反应物，用 speed vac 浓缩器完全干燥。首先 Resus，将对照和去甲基化酶反应样品悬浮在 100 μL 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液 pH 7.4 中。

现在向对照和去甲基化酶反应样品中加入 8 微升多孔微珠，并如前所述收集在 zip 尖端。以 2 微升体积逃脱到 MALDI 样品板上，并在室温下干燥至结晶。继续通过质谱分析样品。

在 to work 软件中打开 spectro 文件并导出到 M over Z 软件。通过串联质谱法进一步验证反应产物。首先，确定碳 13 C 2 和碳 13 C 4 同位素相对于对照样品单同位素峰的峰面积比。

使用这些计算出的比率来量化每个修饰中存在的肽的相对量。去甲基化酶反应样品的状态。LSD one 酶可有效用于赖氨酸去甲基化的质量蠕动定量。

由于对照反应不进行还原甲基化，因此表示该肽的典型同位素包络所得峰面积决定了存在于碳 13 C 2 和碳 13 C 4 中的肽的背景比。同位素状态，即对照反应质谱中的峰面积，允许定量存在于每种修饰状态下的肽的相对量。在去甲基化酶反应中，这些对照和去甲基化酶反应的峰面积可测定 33.7% 二甲基赖氨酸 4 42 0.3% 单甲基赖氨酸 4 和 24% 未甲基化赖氨酸 4。

这种质量 squam 方法为组蛋白表观遗传学领域提供了关键见解，例如组蛋白赖氨酸残基的去甲基化如何导致各种疾病。虽然这种甲基化测定已应用于研究去甲基化酶，但它也可用于研究甲基转移酶。