Name: 构建交付的干细胞壳聚糖微球的胶原凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 了解利用壳聚糖微球与胶原凝胶支架递送脂肪来源干细胞的方法。该技术可维持干细胞多能性，提高细胞存活率，为再生医学和药物递送提供新策略。

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D.O.Z. 获得了日内瓦基金会资助项目的资助。S.N. 获得了匹兹堡组织工程倡议会颁发的博士后奖学金资助。

1. 分离脂肪来源的干细胞（ASC）
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
	<li>按照先前所述方法6，分离大鼠肾周和附睾周围脂肪组织，并用含1%胎牛血清（FBS）的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤。</li>
	<li>将组织切碎，取1-2 g转移至含有25 mL含1% FBS的HBSS的50 mL离心管中，于室温下以500 g离心8分钟。</li>
	<li>收集漂浮的脂肪组织层，转移至125 mL锥形瓶中，加入25 mL含II型胶原酶（200 U/mL）的HBSS，在37 °C下于旋转摇床（125 rpm）中消化45分钟。</li>
	<li>小心移除液体部分（位于油层和脂肪组织层下方），依次通过100 μm和70 μm尼龙滤网过滤。滤液于室温下以500 g离心10分钟，吸除上清液，并用25 mL HBSS将沉淀洗涤两次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于50 mL生长培养基（MesenPRO RS基础培养基）中，该培养基添加了MesenPRO RS生长补充剂、抗生素-抗真菌剂（100 U/mL青霉素G、100 μg/mL硫酸链霉素和0.25 μg/mL两性霉素B）以及2 mM L-谷氨酰胺，然后将细胞悬液分装至2个T75培养瓶中（每瓶25 mL）。</li>
	<li>将脂肪源性干细胞（ASC）置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养（所有实验均使用第2至第4代ASC）。</li>
</ol>
2. 制备壳聚糖微球（CSM）
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
	<li>CSM 采用水包油乳化法结合离子凝聚技术制备，具体步骤依据我们先前的方案6。将壳聚糖水溶液（6 mL 含 3% w/v 壳聚糖的 0.5 M 乙酸溶液）加入 100 mL 油相混合物中进行乳化，油相由大豆油、正辛醇（1:2 v/v）和 5% 的失水山梨醇单油酸酯（span 80）乳化剂组成，使用顶置搅拌器（1700 rpm）和磁力搅拌器（1000 rpm）同时反向搅拌。这种双重搅拌方法可确保在交联发生前形成的胶束保持在溶液中，不会沉降至容器底部。此外，磁力搅拌子有助于在胶束形成和硬化过程中防止壳聚糖聚集。</li>
	<li>持续搅拌混合物约 1 小时，直至形成稳定的水包油乳液。每隔 15 分钟加入 1.5 mL 溶于正辛醇的 1% w/v 氢氧化钾溶液，共加入 4 小时（总计 24 mL），以启动离子交联反应。</li>
	<li>交联反应完成后，缓慢倾去含有 CSM 的油相，并立即将球状颗粒转移至 100 mL 丙酮中。用丙酮反复洗涤球状颗粒，直至完全去除油相。</li>
	<li>将回收的球状颗粒置于真空干燥器中干燥，并在不进行进一步处理的情况下进行分析。使用粒径分析仪测定 CSM 的平均粒径、每毫克比表面积及单位立方体积。</li>
	<li>后续实验前，用无菌水洗涤 CSM 三次，以去除残留盐分，并用无水乙醇进行灭菌处理。</li>
</ol>
3. 测定 CSM 中游离氨基的数量
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
	<li>采用 Bubins 和 Ofner7 的三硝基苯磺酸（TNBS）法测定离子交联后 CSM 中游离氨基的数量。将 5 mg 微球与 1 mL 0.5% TNBS 溶液加入 50 mL 玻璃试管中，于 40 °C 孵育 4 小时，随后加入 3 mL 6N HCl，在 60 °C 下水解 2 小时。</li>
	<li>将样品冷却至室温，加入 5 mL 去离子水和 10 mL 乙醚，萃取游离的 TNBS。</li>
	<li>取 5 mL 水相部分，于水浴中加热至 40 °C 保持 15 分钟，以蒸发残留的乙醚，冷却至室温后，用 15 mL 水稀释。</li>
	<li>使用分光光度计在 345 nm 处测定吸光度，以不含壳聚糖的 TNBS 溶液作为空白对照，并以用于制备 CSM 的壳聚糖样品测定总氨基数量，据此估算 CSM 相对于壳聚糖的游离氨基数量。</li>
</ol>
4. 在 CSM 中加载 ASC
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
	<li>将第2.5节中5 mg无菌CSM在无菌HBSS中平衡过夜，然后加入到孔径为8 μm的膜培养板小室（24孔板）中。</li>
	<li>待CSM沉降到膜上后，小心吸除HBSS，并在小室内侧加入300 μL生长培养基，外侧加入700 μL生长培养基。</li>
	<li>将ASC以适当浓度（1 × 104 至 4 × 104）重悬于200 μL生长培养基中，接种至培养板小室内的CSM上。接种后，培养小室内的培养基终体积为500 μL。</li>
	<li>将接种有ASC的CSM置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养24小时。</li>
</ol>
5. 确定 CSM 中 ASC 的加载百分比和细胞活力
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
	<li>孵育后，将载有 ASC 的 CSM 收集到无菌的 1.5 ml 微量离心管中，注意不要扰动已迁移至插入膜中的细胞。</li>
	<li>去除残留培养基，并向管中加入 250 μL 新鲜生长培养基。</li>
	<li>向每根试管中加入 25 μL MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐] 溶液（5 mg/mL），在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育 4 小时。</li>
	<li>孵育结束后，吸去培养基，加入 250 μL 二甲基亚砜，涡旋混合 2–5 分钟，以溶解甲臜复合物。</li>
	<li>将 CSM 在 2700 x g 条件下离心 5 分钟，并使用 630 nm 作为参考波长，测定上清液在 570 nm 处的吸光度。</li>
	<li>根据已知数量活 ASC 所获得的吸光度值，确定与 CSM 相关的细胞数量。</li>
</ol>
6. 表征含 ASC-CSM 的嵌入式胶原凝胶
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
	<li>将负载ASC的CSM（5 mg，约含2 × 104个细胞）与从大鼠尾腱提取的I型胶原蛋白（7.5 mg/mL，按Bornstein的方法8制备）混合，并用2 N NaOH调节pH至6.8后诱导纤维化。</li>
	<li>将纤维化的胶原蛋白-ASC-CSM混合物加入12孔板中，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>待完全纤维化后，将胶原蛋白-ASC-CSM凝胶在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续孵育最多14天。</li>
	<li>使用标准显微镜技术观察细胞从CSM向凝胶中的释放与迁移情况。</li>
</ol>
7. 代表性结果
在本研究中，我们开发了一种 体外 将干细胞从壳聚糖微球（CSM）递送至胶原凝胶支架的策略。大小均一的多孔CSM（175-225 μm 直径）和成分的材料被制备并用作细胞载体（图2）。将ASC与CSM共孵育后，细胞在2 x 10的浓度下贴壁4 细胞/5 mg CSM。细胞能够在微球表面铺展，并将伪足伸入微球的多孔缝隙中（图3）。一旦将载有细胞的 CSM 与胶原凝胶混合，细胞即开始迁移进入凝胶中（图4).
<img alt="生物材料特性图表；比较壳聚糖和胶原蛋白在生物相容性等特性上的表现。" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
表 1. 壳聚糖和胶原蛋白在干细胞递送系统中应用的生物学优势。
<img alt="ASCs 分离和 CSM 制备示意图；用于伤口愈合分析的支架载入过程。" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 示意图展示 ASC-CSM 负载胶原支架的双重用途整体策略。图 2、图 3 和图 4 在示意图中进行了标注，以帮助解读图像内容。
<img alt="ASCs 和 CSM 加载过程示意图；在细胞研究用培养插件中混合。" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图 2. 示意图展示将干细胞接种到壳聚糖微球上的过程。该过程涉及在孔径为 8-μm 的膜培养板插件中将 ASC 与 CSM 共培养。24 小时后，将微球从插件中取出，即可用于包埋至生物材料基质中。
<img alt="用于成像分析和表征的细胞结构共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜。" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 负载ASC的CSM的形态学表征。图A显示了负载ASC的CSM的光学显微图像，而图B显示了同一视野叠加共聚焦荧光显微镜图像的结果。ASC预先负载了钙黄绿素AM（绿色）。图C显示了一个未负载微球的扫描电镜图像，而图D显示细胞附着在微球表面（星号所示）。图E的透射电镜图像显示了一个未负载微球的横截面，可见大量孔隙和缝隙遍布整个微球结构。图F显示了一个横截面微球，其中细胞（箭头所示）附着并伸出伪足进入缝隙中。原始放大倍数：A &amp; B = 70X；C = 500X，D = 2,000X；E &amp; F = 2,500X。
<img alt="突出显示细胞形态结构特征及差异的细胞显微图像。" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. ASC 从 CSM 迁移进入三维胶原支架。图 A 和 B 显示了第 3 天细胞从微球向外迁移并进入胶原基质的 CSM 情况（A，箭头所示）。图 B 显示培养 12 天后的类似情况。透射电子显微镜（TEM）图像见图 C、D 和 E。图 C 和 D 中的星号表示被横切的微球，细胞正从微球向外迁移（箭头所示）。图 D 的高倍放大图像见图 E，显示细胞的丝状伪足附着在胶原原纤维上（插图）。原始放大倍数：A&amp;B = 100x；C&amp;D = 6,000x；E = 20,000x，插图 = 150,000x。
<img alt="细胞治疗的CSM示意图：可调节表面、可注射性、药物递送、组织构建体。" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 示意图展示CSM在再生医学与药物递送中的广泛应用。

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</ol>

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文中所包含的观点或主张均为作者的个人观点，不应被视为官方立场，也不代表美国国防部或美国政府的观点。作者为美国政府雇员，本工作是其履行公务期间完成的。所有工作均由美国陆军医学研究与物资司令部资助。本研究是在经美国陆军医学研究与物资司令部机构审查委员会审查并批准的方案下，依照已批准的方案进行的。

基于干细胞的治疗面临的一个主要障碍是开发出将细胞高效递送至特定修复区域的方法。由于患者之间的个体差异，以及组织类型、损伤面积和深度的不同，干细胞的递送方法必须根据具体情况进行个体化确定。尽管将干细胞包埋于基质中并递送至损伤部位似乎是组织工程中合乎逻辑的下一步策略，但仍存在一些技术难题。其中包括包埋细胞与基质的黏附能力，以及能否提供一种生物相容性良好的微环境，使细胞能够黏附、增殖并重建适宜的微环境，从而避免失巢凋亡（anoikis）9-10。该过程要求细胞上调其基质重塑相关机制，而这一过程可能需要数天时间才能完成，之后才能实现干细胞的增殖、迁移和分化等理想细胞行为。为克服这些问题，我们开发了一种方法：在将干细胞嵌入合适的基质以修复受损组织之前，预先将其负载于壳聚糖微球（chitosan microspheres, CSM）上。利用我们独特的离子交联方法制备微球，该方案可使&gt;90%的微球直径控制在175–225 μm范围内，从而形成一种理想的微米级细胞载体。更重要的是，交联后的微球仍保持正电荷，这非常有利于细胞的黏附。这些微球特性使得干细胞能够快速黏附至CSM表面。一旦黏附，这些负载干细胞的微球在支架（如胶原蛋白...

<table><tbody><tr><td>汉克斯平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14175</td><td>耗材</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>耗材</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6685</td><td>耗材</td></tr><tr><td>70-&amp;mu;m 尼龙筛网滤器</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>耗材</td></tr><tr><td>100-&amp;mu;m 尼龙筛网滤器</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td>耗材</td></tr><tr><td>MesenPRO 生长培养基系统</td><td>Invitrogen</td><td>12746-012</td><td>耗材</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td>耗材</td></tr><tr><td>T75 组织培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>137787</td><td>耗材</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>耗材</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>耗材</td></tr><tr><td>正辛醇</td><td>Acros Organics</td><td>150630025</td><td>耗材</td></tr><tr><td>司盘-80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6760</td><td>耗材</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>耗材</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-4859</td><td>耗材</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741</td><td>耗材</td></tr><tr><td>三硝基苯磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td>耗材</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>耗材</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472-484</td><td>耗材</td></tr><tr><td>8-&amp;mu;m 组织培养板插件</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td>耗材</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>耗材</td></tr><tr><td>MTT试剂</td><td>Invitrogen</td><td>M6494</td><td>耗材</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Qtracker 细胞标记试剂盒 (Q tracker 655)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>Q2502PMP</td><td>耗材</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Travigen</td><td>3447-020-01</td><td>耗材</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>耗材</td></tr><tr><td>12孔组织培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td>耗材</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>设备</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C24</td><td>设备</td></tr><tr><td>含5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;的加湿培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Model 370</td><td>设备</td></tr><tr><td>顶置式搅拌器</td><td>IKA</td><td>Visc6000</td><td>设备</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Corning</td><td>PC-210</td><td>设备</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>-</td><td>-</td><td>设备</td></tr><tr><td>粒径分析仪</td><td>Malvern Instruments</td><td>STP2000 Spraytec</td><td>设备</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp210</td><td>设备</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Beckman Coulter DU800UV/可见光分光光度计</td><td>设备</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Diagger</td><td>3030a</td><td>设备</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2</td><td>设备</td></tr><tr><td>光学/荧光显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td>设备</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>FV-500 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>设备</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Leo 435 VP</td><td>设备</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEOL 1230</td><td>设备</td></tr></tbody></table>

构建用于递送负载干细胞的壳聚糖微球的胶原水凝胶

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

多能干细胞已被证明在再生医学领域具有极高的应用价值1-3然而，为了有效地将这些细胞用于组织再生，必须考虑多个变量，包括植入部位的总体积和表面积、组织的机械特性以及组织微环境，后者涉及血管化程度和细胞外基质的组成成分。因此，用于递送这些细胞的材料必须具有明确化学组成的生物相容性，同时保持与宿主组织相仿的机械强度。这些材料还必须允许氧气和营养物质透过，以提供有利于细胞黏附和增殖的微环境。壳聚糖是一种具有良好生物相容性的阳离子多糖，易于进行化学修饰，并具有高亲和力以结合 体内 大分子4-5壳聚糖模拟细胞外基质中的糖胺聚糖组分，使其能够作为细胞黏附、迁移和增殖的基质。在本研究中，我们采用微球形式的壳聚糖将脂肪源性干细胞（ASC）递送至基于胶原蛋白的三维支架中6. 针对孵育时间和细胞密度确定了理想的细胞与微球比例，以实现可负载细胞数量的最大化。一旦脂肪来源干细胞（ASC）接种到壳聚糖微球（CSM）上，即可将其包埋于胶原支架中，并可在体外培养中长期维持。总之，本研究提供了一种将干细胞精确递送至三维生物材料支架中的方法。

目前干细胞治疗面临的主要障碍之一是确定将这些细胞递送至宿主组织的最有效方法。在此，我们描述了一种基于壳聚糖的递送方法，该方法操作简便且效率高，同时能够维持脂肪来源干细胞的多向分化潜能。

多能干细胞已被证明在再生医学领域具有极高的应用价值1-3。然而，为了有效利用这些细胞……

本方案提供了一种体外策略，通过将壳聚糖微球中的干细胞递送至胶原凝胶支架中进行收获与培养。首先，从原代脂肪干细胞中乳化并回收制备的壳聚糖微球。随后，将干细胞接种于壳聚糖微球上，并在孔径为八微米的膜插入式培养板中进行培养，以最终制备负载壳聚糖（CS）的壳聚糖微球（CSM），最后将微球递送系统与三维胶原凝胶支架混合。最终，这种CSM系统在再生医学和药物递送领域具有潜在应用价值。与现有的细胞注射或微囊化等方法相比，该技术的主要优势在于细胞能够附着于载体材料，并在初始施用后持续存留。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为esan微球具有固有的静电荷。在不扰动细胞的情况下，将细胞加载到微球层上会具有挑战性。切除并清洗包膜中的会阴和表皮脂肪组织，将组织切碎后，转移1至2克到含有1% FBS的25毫升HBSS中。离心后，收集漂浮的脂肪组织层至125毫升锥形瓶中。加入25毫升II型胶原酶，并在旋转摇床上孵育反应。现在小心移除油层和脂肪层下方的液体部分，并依次通过170微米的尼龙网筛过滤。用25毫升洗涤液洗涤两次后，通过离心收集细胞。HBSS重悬，将沉淀物悬浮于30毫升添加补充剂的MesenPro生长培养基中。将纯化的脂肪来源干细胞分装至两个T75培养瓶中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中扩增ASC制备物。该CSM方案是一种利用离子交联技术的水包油乳化过程。将6毫升壳聚糖水溶液在100毫升油相混合物中，通过顶部搅拌和磁力搅拌同时反向搅拌一小时，形成稳定的水包油乳液；每15分钟加入1.5毫升1%的氢氧化钾正辛烷溶液，持续四小时。离子交联反应完成后，缓慢倾去油相，并立即将微球加入100毫升丙酮中。用丙酮洗涤微球，直至完全去除油相。然后在真空条件下干燥回收的微球。使用粒径分析仪测定平均CSM颗粒大小、每毫克的表面积以及单位立方体积。用无菌水将CSM洗涤三次，以去除残留的盐分。现在将CSM制备物用无水乙醇灭菌，用于50毫升玻璃试管中的细胞实验，将5毫克微球与1毫升0.5% TNBS溶液混合，在40摄氏度下孵育4小时。然后加入3毫升6摩尔/升盐酸，在60摄氏度下孵育2小时。将样品冷却至室温后，加入5毫升去离子水和10毫升乙醚。为提取游离的TNBS，取5毫升水相等分试样，于水浴中加热至40摄氏度，保持15分钟，以蒸发残留的乙醚，随后冷却至室温。用分光光度计以15毫升水稀释样品。以TNBS作为空白对照，在345纳米处测定所制备的壳聚糖微球的吸光度。同时测量用于制备CSM的壳聚糖用量。现在计算CSM中游离氨基数量相对于壳聚糖中总氨基数量的比例。将5 mg无菌CSM在无菌HBSS中室温平衡过夜。将CSM转移至24孔培养板的8微米膜插件中。待CSM沉降后，小心吸除HBSS。然后向插件内加入300微升生长培养基，向插件外加入700微升生长培养基。重悬。将脂肪来源的干细胞悬浮于 200 微升生长培养基中，并接种至培养板内的 CSM 上。在 37°C、5% 二氧化碳的湿化培养箱中孵育 24 小时。将带有干细胞的 CSM 转移至无菌微量离心管中，注意不要扰动已迁移至插入膜中的细胞。现在去除残留的培养基，向每根试管中加入 250 µL 新鲜培养基。加入 25 µL 浓度为 5 mg/mL 的 MTT 溶液，孵育 4 小时。去除培养基，加入 250 µL 二甲基亚砜（DMSO），涡旋震荡以溶解甲臜复合物，然后将 CSM 在 2,700 ×g 离心 5 分钟。使用630纳米作为参考波长，测定上清液在570纳米处的吸光度。随后根据已知数量的活A SC所获得的吸光度值，确定与CSM相关的细胞数量。将5毫克负载SC的CSM与7.5毫克/毫升的Ⅰ型胶原混合，该胶原提取自大鼠。尾腱，使用2摩尔氢氧化钠调节pH至6.8，倒入培养板中。插入后立即转移至12孔板，孵育30分钟。在孵育期间每隔一天更换一次胶原A-S-C-C-S-M凝胶的培养基。同时利用标准显微技术监测细胞从壳聚糖微球（CSM）向凝胶中的释放及迁移情况。以下示例描述了将脂肪来源干细胞从壳聚糖微球体外递送至胶原凝胶支架的策略。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）图像显示所制备的壳聚糖微球具有均匀尺寸和多孔结构。将微球与原代脂肪来源干细胞共孵育表明，每毫克 CSM 钙盐可负载 4,000 个细胞。SC 染色显示细胞在 CSM 表面铺展，并将伪足延伸至微球的多孔缝隙中。当将负载细胞的 CSM 与胶原凝胶混合后，细胞会迁移进入凝胶，并可随时间推移进行追踪观察。该技术的意义立即延伸至大规模和慢性组织缺损的治疗。然而，由于该方法具有高度的通用性，可与多种用于治疗不同程度软组织和心肌组织缺损的细胞和/或生物材料相结合，因此这一治疗方案具有更广阔的应用前景。该方法有望为宿主细胞递送提供新的研究思路。它还可应用于其他系统，例如注射剂、递送治疗药物，以及开发可同时递送细胞和治疗药物的杂合系统。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

构建交付的干细胞壳聚糖微球的胶原凝胶

利用含有包埋细胞且表面涂覆内皮细胞的圆柱形胶原凝胶（称为模块）来构建微组织。...

利用含细胞的胶原凝胶模块制备微组织

本实验方案重点利用干细胞固有的能力，即响应其周围细胞外基质的信号，进而被诱导分化为多种表型。本方法学论文扩展了我们对一种双层水凝胶模型的描述与表征，该模型由聚乙二醇-纤维蛋白（PEG-fibrin）和胶原蛋白组成，可同时共诱导脂肪来源的干细胞分化1。...

构建双层水凝胶以调控ASC分化

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

软骨修复是一项尚未满足的医学挑战，而基于细胞的人关节软骨组织工程技术是一种有前景的解决方案。本文中，我们描述了三维（3D）仿生水凝胶作为扩增和成熟人关节软骨细胞的理想工具。...

用于关节软骨细胞培养与软骨生成的三维水凝胶支架

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

本文介绍了一种利用动态亚胺化学简便制备基于壳聚糖的可注射水凝胶的方法。同时提供了调节水凝胶机械强度的方法及其在三维细胞培养中的应用。...

壳聚糖基可注射水凝胶的制备及其在三维细胞培养中的应用

本文介绍了利用同轴流动聚焦装置包封人多能干细胞（hPSCs）的方法。我们证明，该微流控包封技术可高效生成hPSC细胞球。...

微流控法制备负载人多能干细胞球体的核-壳微胶囊

本方案描述了一种基于壳聚糖-京尼平的非乳液法微凝胶制备方法。这些微凝胶的尺寸可精确调控，并具有pH依赖性溶胀特性以及可降解性...

用于组织工程的尺寸可控且无乳液的壳聚糖-京尼平微凝胶的制备

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

了解利用壳聚糖微球与胶原凝胶支架递送脂肪来源干细胞的方法。该技术可维持干细胞多能性，提高细胞存活率，为再生医学和药物递送提供新策略。

构建用于递送负载干细胞的壳聚糖微球的胶原水凝胶

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