高通量与低通量根结线虫筛选 Meloidogyne spp.

本实验的总体目标是筛选感染根结线虫的植物。首先，在沙质土壤或生长袋中培育健康的幼苗。接着，制备高感染性的根结线虫二龄幼虫接种物。

然后对幼苗进行适当的接种和感染。最后评估寄主根系上线虫卵块的发育情况。我们将演示对植物根部（而非线虫）进行高通量和低通量筛选的方法。

高通量系统的主要优势在于植物生长所需空间有限，且便于对感染情况进行评估。因此，这些方法可实现可重复且一致的感染效果，使线虫对植物根部的侵染更加均匀，从而更准确地评价植物的寄主状态。通常，初次进行植物根部线虫侵染评估的研究人员可能会遇到困难，主要原因在于未能选用适当的植物发育阶段来进行根部线虫接种。

此外，使用已培养数天的感染期幼虫进行实验，这些幼虫通常具有较低的感染能力。演示该实验步骤的将是我的实验室中的胡国添和一名研究生。我将演示在生长袋中进行筛选的实验步骤，用于盆栽试验。将番茄种子种植于装有富含有机质土壤（如Sunshine Mix）的单个花盆中，种子萌发后，将温室温度维持在22至28摄氏度。

在发芽后约两周、两片真叶期时，每周用 miracle grow 施肥一次，将单株幼苗移栽至装有无菌沙质土壤的花盆中，土壤成分为 90% 沙子和 10% 有机质。加入 osmo coat 缓释肥料，并在 22 至 28 摄氏度的温室中培养两周。之后继续每周使用 miracle grow 施肥一次。

对于高通量筛选，将植物种子直接播种于装有沙质土壤的育苗盘中。用塑料膜覆盖直至种子萌发，并按照前述条件进行培养。种子萌发后，添加Osmocote缓释肥料，并每周用Miracle-Gro营养液施肥一次。在培养皿中铺有多层Kimwipe白纸，将种子置于其中并在25至28摄氏度的培养箱中进行萌发，然后将幼苗转移至独立的种植袋中。

或者，将种子放入纸槽中，直接在单个袋内萌发。将袋子放入塑料悬挂式文件夹中，每文件夹一个，并将文件夹整齐排列在架子上，保持垂直状态。

将架子放入温度维持在25至28摄氏度、光照16小时、黑暗8小时循环的受控环境室中。播种后约10至14天，每天用反渗透水对育苗袋浇灌一次或两次。当幼苗发育出具有三级根尖的充分根系时，即可进行接种。开始卵提取前，需用热水彻底清洗工作区域及所有工具，以避免污染。

将一个水桶放在水槽中用于收集，使溶液流过，并在桶口上方放置一个金属网支撑架。由上至下按孔径递减的顺序叠放三个筛网，使卵滞留在25 µm的筛网中。剪去感病植株的上部并小心弃置。

将植株从花盆中取出，放入装满水的塑料桶中浸泡以清洗根部。在流动水下进一步冲洗根部，直至土壤颗粒被完全洗净。然后从感染的番茄根部提取根结线虫卵。

首先，用剪刀将根部剪成小段，并去除主根。将一株植物的切碎根段放入一个带盖的大塑料瓶中，加入适量10%次氯酸钠溶液，以浸没根段为宜。盖紧瓶盖，振荡两分钟。

打开罐子，将根部倒入上方的筛子中，使用连接在喷雾喷头上软管的水进行冲洗，彻底冲洗至所有漂白剂气味完全消失。同时使用木槌轻敲筛子的侧面，以防止筛孔堵塞。

暂停，取下顶层筛子并冲洗残留物。然后取下第二层筛子，用洗瓶的温和水流冲洗，收集细小残留物，其中包括来自最后一层筛子的卵。

将残渣移至筛子的一侧。用最少的水将残渣和卵收集到一个干净的烧杯中。将桶中收集的水通过25微米筛网过滤，以收集可能漏过的卵。

用清水充分冲洗，并收集到同一个烧杯中。用几层Kim擦拭纸铺垫一个洁净的金属篮，然后将其放入玻璃培养皿中，使金属篮底部与培养皿之间保持一厘米的距离。

将提取的线虫卵倒入金属网篮中的滤纸上。加入足够的液体，使金属网篮底部接触水面，但不浸入水中。

每天用塑料盖盖住顶部。检查水分蒸发情况，并向培养皿中添加适量水，使篮子底部接触水面。为防止卵在六至八天内每隔一天干燥，将含有二龄幼虫（J2）的水从培养皿收集到烧杯中。

若不立即使用，应立即将收集的接种物在室温下通过实验室空气供应或水族箱泵产生的空气进行曝气。随后在磁力搅拌器上以低速搅拌接种物，开始下一步操作。使用三份等量的收集到的线虫。

为了计算会计中的J twos数量。滑动或放置培养皿，计算平均值，并确定接种所需的体积。这些是在显微镜下观察到的J twos。

通常，每株盆栽植物使用 3000 个 J twos，而育苗盘中生长的植物每株使用 500 个 J twos。在接种植物之前，请确保土壤湿润但不过于潮湿。进行盆栽接种时，在每株番茄根系周围的沙土中打三个孔，深度约为花盆的一半。

使用铅笔标记后，用移液器将J twos（J2幼虫）接种到每个植物的三个孔中。随后，将用于高通量筛选的孔板用盖子覆盖。使用经改造的带侧孔密封针头，将其侧壁打孔并粘接到5 mL移液器上。

用移液器将J twos滴入土壤中。将植物置于温室中培养6至8周，温度保持在24至27摄氏度。每月施用两次美乐棵（Miracle Grow）肥料。

为了评估感染情况，切去植株顶部，小心地将植株从花盆中取出并清洗根部。然后将根部浸入每升含一毫克的溶液中，使卵块染成蓝色。

气雾染色15分钟。用清水冲洗根部，并通过计数单个根系上的染色卵块进行评估。可使用带光源的放大镜帮助观察卵块，计数线虫、接种物，并如前所述在磁力搅拌器上搅拌。

将袋子从悬挂文件夹中取出，平放在水平表面上。每个袋子接种 1,500 条 J 二幼虫，接种体积为五毫升。掀起袋子的塑料盖，将线虫均匀分布在根系表面。

接种后，将袋状物用黑色纸张覆盖以避光，并保持水平放置24小时。之后，将袋状物重新放回生长室水中的悬挂文件夹内。每天需用半浓度霍格兰溶液对植株处理一至两次，持续约三天，直至观察到植株对肥料产生反应为止。

通常表现为叶片绿色加深，茎生长更加旺盛。接种后三天，用水保持小袋湿润。接种约30天后，向每个小袋注入约10至20毫升的75毫克/升溶液。

气相染色。将小袋保持水平位置，并在染料中浸泡过夜。次日，倒出小袋中的液体，在透射光照明的载物台上通过计数卵块来评估根系。

此处放大显示的是被广泛感染的番茄植株根部，其大量卵块被染成蓝色。使用托盘可在较小的生长空间内对数百株植物进行筛选。生长袋还允许快速、高效且非破坏性地评估根部，无需清洗根部即可检测根结线虫感染情况。

该方法还能在较小的生长空间内实现对数千株植物的高通量筛选。图中显示的是生长在袋中的豇豆植株根系，接种后可见蓝色染色的卵团。对于线虫的植物测定实验，感染时间非常关键。

因此，即使仅延迟感染数天，也可能导致极低的感染水平。观看本视频后，您现在应已充分了解如何用根结线虫感染植物并对其进行评估。请务必注意，被线虫感染的根系需要得到妥善处理。

在丢弃根部之前进行高压灭菌，以限制线虫的扩散。此外，使用空中喷洒的草甘膦时需谨慎，高剂量具有致癌性。

因此，在处理被该化学物质感染的根部以及配制该化学物质时，都需要佩戴手套。