在无菌无鼠标进定植评估肝代谢的变化 1 H核磁共振光谱
2011年12月15日
一个渐进的殖民化过程进行了介绍，以进一步评估其主机上的肝脏代谢的影响。定植被监视的非侵入性的，而基于核磁共振的代谢分析评估微生物的代谢产物的尿中排泄肝脏代谢高分辨率魔角旋转（人力资源的MAS）核磁共振完好活检的分析评估。
该程序的目的是评估进行性定植对宿主肝脏代谢的影响。这是通过首先逐步定植无菌小鼠来实现的。通过 NMR 波谱评估微生物共代谢物的尿液排泄来监测定植过程。
在监测定植过程之后，从小鼠身上收集肝活检并准备进行代谢分析。然后可以使用无损高分辨率魔角旋转 NMR 波谱从完整活检中获得肝脏代谢概况。最终，质子 NMR 波谱的这种使用揭示了参与代谢途径的各种代谢物，例如能量和氧化应激途径。
因此，该实验可以提供对定植过程中肝功能的见解。它也可以通过肾脏等系统应用。为了让动物定植，从隔离器中取出无菌老鼠，将它们安置在笼子里的传统饲养室中，在传统动物前面配备过滤器作为对照。
然后从对照传统笼子中取出的三天大的窝中，有一半与无菌动物的窝混合，将鼠标放在管子上，将尿液收集在 1.5 毫升的微管中，并通过轻轻按摩肠道来帮助。使用 5 毫米 NMR 探头采集至少需要 20 微升，但建议使用 30 微升以提高代谢分析的质量。立即将尿液快速冷冻在液氮中，储存在至少零下 40 摄氏度，直到 NMR 分析。
在 NMR 采集之前，在重水中制备 0.2 摩尔磷酸钠缓冲溶液。pH 7.4 含有 1 毫摩尔 TSP，将 30 微升尿液与 30 微升磷酸钠缓冲液混合。使用配备金属针头的 50 微升玻璃注射器，将 50 微升混合溶液转移到 1.7 毫米 NMR 毛细管中。
注意避免气泡。将毛细管适配器安装在装有尿液样品的毛细管顶部，并将其放入 2.5 毫米 NMR 微管中，用于 5 毫米 NMR 探头。这种试管组合可以用作标准的 5 毫米 NMR 试管，用于波谱采集。
在这个演示中，使用了一台 bruer 先进的 3 个 700 兆赫兹 NMR 波谱仪来收集数据。使用书面协议中讨论的参数获取一维质子 NMR 光谱。NMR 采集后，如书面方案中所述，在对动物实施安乐死后，使用提取杆从 2.5 毫米 NMR 管中取出毛细管，方法是轻轻拧紧毛细管适配器将其拉出。
准备肝活检。请勿使用任何含酒精的产品，以免污染，并使用水或盐水溶液清洗工具。从左叶收集肝活检，以进行可重复的活检。
始终收集在左叶的中心，避开组织较薄的外围区域。注意不要在胆囊漏气的情况下穿孔。立即用水或生理盐水清洗纸巾。
立即在液氮中快速冷冻活检，并将其储存在零下 80 摄氏度，直到 NMR 分析要设置 H-R-M-A-S-N-M-R，请将第三次活检插入锆转子，并用纯重水填充其余体积以进行 NMR 锁定。小心不要产生任何气泡，因为它们可能会改变后续匀场和数据采集的质量。使用圆柱形螺钉插入 50 微升 Teflon 垫片。
拧下它并使用短边的深度计进行校准。将螺纹销放在垫片上，然后用螺丝刀轻轻拧紧。干燥的房子，任何残留的水和一块纸巾。
接下来，将盖子放在转子顶部，并将其插入转子填料中。用力按压，直到盖子就位。转子与其帽之间不应留有任何空间，使用黑色记号笔标记转子底部的一半，以便检测光学旋转速率。
转子充分包装后，将其放入 NMR 波谱仪中，开始旋转 5 kHz。这里。使用了 bru 先进的 3 个 500 兆赫兹光谱仪。使用 CP MG 脉冲序列采集质子 NMR 波谱。
根据制造商的指南，丰度的 α 和数字葡萄糖双峰 5.22 ppm 可用于校准得到的 NMR 波谱。要打开转子的包装，请先取下转子的盖子，使用盖子拆卸器，拧下螺纹销，然后取下 Teflon 垫片。使用圆柱形螺钉，可以使用水和清洁剂彻底清洗设备。
定植 20 天的动物尿液代谢特征的质子谱清楚地说明了肠道微生物共代谢物在定植过程中的出现。该动物在无菌状态下没有排泄任何温顺的硫酸盐和非常少量的苯基乙酰甘氨酸、缩写的 PAG 和 que 细胞硫酸盐。随着定植的进行，肠道微生物群蛋白质代谢的这三个标志物显着增加，并在第 20 天达到平衡。
通过整合特定的 PAG 三联体峰，可以量化该特定标志物随时间的增加。该图表示使用质子 H-R-M-A-S-N-M-R 光谱法，一组 7 只动物在定植期间的平均 PAG 浓度，获得了两只小鼠在定植前后的肝脏代谢概况。该图很好地说明了可以从基于 A-M-A-S-N-M-R 的代谢概况中获得的信息。
可以可视化许多氨基酸以及来自高能代谢的代谢物。这些图谱还包含与氧化应激、核苷酸代谢和甲基胺代谢相关的信息。在这个例子中，很明显，无菌小鼠几乎没有糖原，葡萄糖和甘油三酯的含量非常低。
因此，按照此程序，可以应用多种统计工具，例如化疗，以便根据代谢特征对逻辑样本进行聚类，并突出显示与代谢状态相关的生物标志物。
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概述
本研究描述了一种逐步定植程序，以评估其对宿主肝脏代谢的影响。通过核磁共振代谢分析，利用尿液中微生物共代谢物的排泄，以非侵入性方式监测定植情况。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 代谢
- 微生物学
背景
- 了解肠道微生物群对宿主代谢的影响至关重要。
- 非侵入性监测技术对准确评估至关重要。
- 核磁共振光谱提供详细的代谢分析。
- 逐步定植可以揭示代谢途径的见解。
研究目的
- 评估逐步定植对肝脏代谢的影响。
- 监测尿液中微生物共代谢物的排泄。
- 使用核磁共振分析肝脏活检样本的代谢分析。
使用的方法
- 无菌小鼠的逐步定植。
- 通过核磁共振光谱评估微生物共代谢物的尿液排泄。
- 收集肝脏活检样本进行代谢分析。
- 高分辨率魔角旋转（HR MAS）核磁共振光谱用于完整的活检分析。
主要结果
- 识别参与能量和氧化应激途径的各种代谢物。
- 通过尿液代谢物分析成功监测定植。
- 对肠道微生物群和肝脏代谢之间的关系有了见解。
- 展示了代谢研究的非破坏性分析技术。
结论
- 逐步定植程序有效影响肝脏代谢。
- 基于核磁共振的技术对于研究代谢相互作用很有价值。
- 进一步的研究可以探索微生物群对代谢的治疗意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding host-microbiota metabolic interactions is critical for de-risking therapeutic targets in metabolic disease. This method enables non-destructive, longitudinal assessment of hepatic metabolic shifts during progressive gut colonization, providing mechanistic insights for target validation. It supports predictive confidence in early discovery by linking microbial activity to host pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracking microbial co-metabolite excretion as a functional readout of gut microbiota activity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through longitudinal monitoring of colonization impact on hepatic energy and oxidative stress pathways.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating microbial establishment with measurable shifts in glucose, glycogen, and triglyceride levels in intact liver tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream screening by establishing reproducible colonization models with quantifiable urinary biomarkers.
- Quantitative Output: Provides semi-quantitative metabolic profiling of intact liver biopsies via HR MAS NMR, enabling detection of key metabolites in energy and stress pathways.
- Platform Reuse: The NMR-based approach can be applied to other tissues (e.g., kidney), supporting cross-organ metabolic profiling in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models metabolic syndrome risk by revealing how progressive colonization alters hepatic metabolism in germ-free mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase microbial metabolite tracking to preclinical validation of host metabolic responses.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway-level interactions between gut microbiota and host hepatic function, reducing ambiguity in target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative assessment of microbiota-host metabolic interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by monitoring urinary excretion of microbial co-metabolites (e.g., phenyl acetyl glycine) as colonization progresses.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized, non-invasive monitoring of colonization using NMR-based urinary metabolic profiling.
- Analytics: Delivers quantitative metabolic readouts from intact liver biopsies, including glucose, glycogen, triglycerides, and oxidative stress markers, to compare metabolic states.
- Translational Research: Links microbial metabolic activity to hepatic pathway modulation, supporting preclinical continuity in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reproducible, non-destructive NMR workflow applicable across tissue types for metabolic profiling in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in host-microbiota metabolic interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through non-invasive colonization monitoring and intact tissue profiling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked biomarkers of metabolic pathway engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated hepatic metabolic responses to colonization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, germ-free animal handling, and metabolic profiling techniques.
- Dependent on HR MAS NMR instrumentation, capillary sample preparation tools, and cryogenic storage for urine and tissue samples.
- Necessitates cross-team standardization between microbiology, metabolomics, and pathology teams for consistent sample collection and analysis.
- Must account for variability in coprophagic behavior and environmental colonization when adapting to different model systems or facilities.
- Limited by the semi-quantitative nature of HR MAS NMR and the need for careful bubble-free sample preparation to ensure spectral quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Colonization of Germ-free Animals and Sample Collection
2:07
1H NMR Acquisition of Urine Microvolume
3:25
Collection of Liver Biopsy
4:09
1H High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR of Liver Tissue Biopsy: Sample Preparation
5:55
Urinary and Hepatic Metabolic Profiling through 1H NMR and 1H HR MAS NMR Spectra
7:32
Conclusion
