Name: 在无菌无鼠标进定植评估肝代谢的变化 1 H核磁共振光谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 了解利用核磁共振波谱技术评估无菌小鼠渐进定植对肝脏代谢影响的方法。通过尿液微生物共代谢物监测和肝活检代谢分析，揭示能量与氧化应激通路中的代谢物变化。

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所有用作示例的核磁共振谱图均来自一项先前已发表的研究7，该研究由雀巢公司提供资金支持。

1. 无菌动物的定植与样品采集
 <ol>
 <li>将无菌动物从隔离器中取出，并安置于常规饲养室中，笼具前方放置过滤装置，这些动物将作为对照组（图1）。</li>
 <li>取对照组常规饲养笼中3日龄的垫料一半，与无菌动物的垫料混合。每次更换垫料时，须保留1/3的脏垫料，以维持一定的细菌水平（至少保留3天）。</li>
 <li>将小鼠置于1.5 mL微量离心管上方，通过轻柔按摩腹部促进排尿，收集尿液。立即用液氮速冻，并在至少-40°C条件下保存，直至进行核磁共振（NMR）分析。使用5 mm NMR探头进行检测时，至少需要20 μL样本体积，但建议使用30 μL以提高代谢谱分析的质量。</li>
 <li>动物安乐死时不应使用任何麻醉剂，以避免因麻醉化合物在肝脏中的代谢而干扰NMR共振信号（例如，可采用颈椎脱位法，并通过放血确认死亡）。</li>
 </ol>
 2. 肝脏活检样本采集建议
 <ol>
 <li>请勿使用含酒精的任何产品，以避免污染。仅用水或生理盐水清洗工具。</li>
 <li>切勿穿刺胆囊。若发生胆汁泄漏，应立即用水或生理盐水冲洗组织。</li>
 <li>如图2所示，从左叶采集肝活检样本（约15–50 mg）。为确保活检可重复性，应始终在左叶中心区域取样，避免周边较薄的组织区域。</li>
 <li>立即用液氮速冻活检样本，并在进行核磁共振（NMR）分析前于-80°C保存。</li>
 </ol>
 3. 尿液微量体积的1H NMR检测
 <ol>
 <li>在D2O（99.8%）中配制含1 mM 3-(三甲基硅基)丙酸-d4（TSP）的0.2 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4。</li>
 <li>将30 μL尿液与30 μL磷酸钠缓冲液混合。</li>
 <li>使用配备金属针头（外径0.5 mm）的50 μL玻璃注射器，将50 μL混合溶液转移至1.7 mm NMR毛细管（图3（2））中。注意避免产生气泡。</li>
 <li>将毛细管适配器（图3（3））安装在装有尿液样品的毛细管顶端，并将其放入适用于5 mm NMR探头的2.5 mm NMR微量管（图3（1））中。将此组合管作为标准5 mm NMR管用于谱图采集。</li>
 <li>使用提取杆（图3（4））通过轻轻旋转毛细管适配器，将毛细管从2.5 mm NMR管中取出。</li>
 </ol>
 4. 肝组织活检的1H HR MAS NMR：样品制备
 <ol>
 <li>MAS 转子组件和工具如图 4 所示。</li>
 <li>将活检组织（约 15–50 mg）插入氧化锆转子（图 4 (1)）中，并用纯 D2O 填满剩余体积，以用于 NMR 锁场。注意避免产生气泡，因为气泡会影响后续匀场质量以及数据采集质量。</li>
 <li>使用圆柱形螺钉（图 4 (5)）插入 50 μL 聚四氟乙烯垫片（图 4 (2)）。将其旋下，并使用短端的深度规（图 4 (8)）进行校准。此步骤中需特别注意样品，因为部分样品可能从垫片孔中泄漏。若发生泄漏，则部分活检组织会被破坏，样品重量将不再可靠，因此必须从头重新开始样品制备。</li>
 <li>放置螺纹销钉（图 4 (3)），并用螺丝刀（图 4 (6)）轻轻旋紧。用一片纸巾彻底吸干任何残留水分。</li>
 <li>将转子帽（图 4 (4)）置于转子顶部，并将其插入转子压紧装置（图 4 (6)）中。用力按压直至转子帽完全就位，转子与转子帽之间不应留有任何空隙。</li>
 <li>使用黑色记号笔标记转子底部的一半位置，以便进行光学转速检测。</li>
 <li>将转子放入核磁共振波谱仪中，并以 5 kHz 开始旋转。根据仪器制造商的指南，使用 CPMG 脉冲序列采集1H NMR 谱图13。</li>
 <li>利用 α 异头葡萄糖在 5.22 ppm 处的共振峰（双峰）对 NMR 谱图进行校准。</li>
 <li>拆卸转子时，使用转子帽移除工具（图 4 (9)）取下转子帽。旋下螺纹销钉，并用圆柱形螺钉取出聚四氟乙烯垫片。使用水和洗涤剂彻底清洗。</li>
 </ol>
 5. 代表性结果
 可通过尿液代谢谱分析来监测肠道微生物的活性。文献中已报道了大量可通过1H NMR鉴定的尿液微生物共代谢物7,14-17。这些微生物共代谢物在监测定植过程方面特别有用，因为它们提供了一种快速且无创的方法，用于评估新建立的生态系统何时达到稳定状态。图5A清晰地展示了在定植过程中肠道微生物共代谢物的出现情况。该图显示了按照步骤2所述方法获得的一只经步骤1所述方法定植20天后的动物的尿液代谢谱。该动物在无菌状态（第0天，蓝色）时未排泄任何硫酸吲哚酚，且仅排出极少量的苯乙酰甘氨酸（PAG）和p-甲酚硫酸盐。随着定植的进行，这三种由肠道微生物介导的蛋白质代谢标志物显著增加，并在第20天达到平衡状态（红色）。如图5B所示，通过PAG共振信号可方便地对一组动物进行监测。该图是通过对7只动物在图5A中灰色高亮区域（δ 7.40–7.43）下的共振峰面积进行积分而获得的，该区域对应于PAG的一个特定共振信号（三重峰）。
 1H 高分辨魔角旋转（HR MAS）核磁共振（NMR）波谱是一种非破坏性技术，可快速、可重复地获取各类活检样本的代谢谱18。在本实验方案中，我们采用这一强大技术获得了2只小鼠在定植前（蓝色）和定植后（红色）的肝脏代谢谱（图6）。该图清晰展示了基于MAS NMR的代谢谱所能提供的信息。可检测到多种氨基酸，以及来自能量代谢的多种代谢物，如葡萄糖、糖原、乳酸、甘油三酯、(D)-3-羟基丁酸和烟酸。这些代谢谱还包含与氧化应激相关的信息（例如抗坏血酸、谷胱甘肽）、核苷酸代谢（例如肌苷、尿苷）以及甲胺代谢（例如胆碱、氧化三甲胺）。在此示例中，无菌小鼠几乎不含糖原，且葡萄糖和甘油三酯含量极低，这与先前报道的结果一致7。
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig1.jpg" alt="无菌小鼠定植过程；尿液、肝组织活检；核磁共振代谢谱分析；示意图、谱图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1。"> 图1。 定植方案概览。将无菌动物与普通动物共同饲养在配备过滤装置的笼具中，并交换它们的仔鼠，以实现来自普通动物肠道菌群的逐步定植（1）。利用1H NMR进行代谢谱分析来监测肠道微生物活性（2-3）。通过1H HR MAS NMR代谢谱分析评估肝脏代谢状态（4-5）。
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig2.jpg" alt="肝脏解剖图，标注了肝叶；穿刺取样区域已标示。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 图 2。 小鼠肝脏解剖结构。图示肝脏以平坦面朝下放置于台面。为确保穿刺取样的可重复性，建议始终从左侧肝叶中央区域取样，如虚线矩形所示。
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig3.jpg" alt="色谱装置；用于液体分离方法设置的玻璃柱和接头。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3。"> 图 3. 适用于微量样品的 1.7 mm NMR 毛细管套装。图注：1：2.5 mm NMR 微量管，2：1.7 mm NMR 毛细管，3：毛细管接头，4：提取杆。
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig4.jpg" alt="光学激发实验的光谱学装置组件；包括工具和金属部件。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4。"> 图4。 高速魔角旋转（MAS）转子设备。关键部件：1：MAS转子，2：50 μL 聚四氟乙烯（Teflon）垫片，3：螺纹销，4：端帽，5：圆柱螺钉，6：螺丝刀，7：转子装填器，8：深度规。
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig5.jpg" alt="随时间变化的吲哚基-S衍生物的核磁共振谱比较及PAG浓度图分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5。"> 图5。 定植期间尿液代谢谱的演变。 
 
 <ol class="ualpha">
 <li>放大谱图中 6.8–7.8 ppm 的芳香区，可观察到微生物共代谢产物。1H NMR 谱图来自同一位个体在定植后第 0 天（蓝色）、第 4 天（绿色）、第 15 天（橙色）和第 20 天（红色）。灰色区域对应于用于生成 B 图的积分范围。 
 说明：1-MeHistamine：1-甲基组胺；Indoxyl-S：吲哚硫酸盐；His：组氨酸；p-Cresol-S：对甲酚硫酸盐；PAG：苯乙酰甘氨酸。
 </li>
 <li>定植期间 PAG 的平均浓度（n=7）。采用 Student t 检验比较不同时间点 PAG 浓度的差异：a：与第 0 天相比，p&lt;0.05；b：与第 10 天相比，p&lt;0.01。</li>
 </ol>
 
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig6.jpg" alt="核磁共振波谱图；显示葡萄糖、乳酸等代谢物的峰；化学位移分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6。"> 图6。 来自无菌（蓝色）和前无菌（红色）小鼠肝活检组织的典型600 MHz 1H HR MAS NMR谱图。加粗的质子对应于甘油三酯共振峰。 
图注：3-HB：3-羟基丁酸，GSH：还原型谷胱甘肽，TGs：甘油三酯，TMAO：氧化三甲胺。

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<li>Merrifield, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+system-wide+characterisation+of+the+pig%3A+a+model+for+human+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology.</a> Mol. Biosyst. , (2011).</li>
<li>Tugnoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+gastric+mucosa+by+HR-MAS+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy.</a> International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Sitter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HR+MAS+MR+spectroscopic+profiles+of+breast+cancer+tissue+with+clinical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters.</a> NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).</li>
<li>Beckonert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling%2C+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine%2C+plasma%2C+serum+and+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

在本实验方案中，我们描述了一种在开放环境中进行逐步定植的方法，旨在通过完整活检组织的1H HR MAS NMR谱分析进一步研究肠道微生物群对肝脏代谢的影响。文献中已报道多种定植方法。对动物进行特定微生物群定植的最常用方法包括口服灌胃或使用被污染的饮用水19,20。粪便接种也可用于定植，如先前所述21。本文所介绍的定植方法源自Koopman JP等人于1986年描述的一种“标准化”无菌动物的方法22。在该研究中，作者将一只正常的常规饲养动物放入隔离器中与无菌动物共同饲养。然而，并非总能将动物持续饲养在隔离器内，特别是在定植过程中需要对动物进行操作时（若需采集样本则尤为困难）。因此，另一种选择是将原无菌动物与作为对照的常规饲养动物所污染的垫料一同饲养于常规开放环境中。该方法使得为实现定植而进行的动物操作最少化，从而相比口服灌胃显著降低了动物应激。此外，该方法可实现更接近自然过程的渐进式肠道定植，并使同笼饲养的动物获得均一的微生物定植，这一点已通过微生物DNA图谱的DGGE（变性梯度凝胶电泳）分析得到证实（参见Claus等人7的补充材...

<table><tbody><tr><td colspan="4">特定试剂与仪器列表：</td></tr><tr><td>2.5 mm 微量管</td><td>New Era</td><td>NE-H5/2.5-V-Br</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mm 毛细管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NORS175001</td><td></td></tr><tr><td>毛细管适配器</td><td>New Era</td><td>NE-325-5/1.7</td><td></td></tr><tr><td>提取棒</td><td>New Era</td><td>NE-341-5</td><td></td></tr><tr><td>HR-MAS 转子 BL4，配有 50 &amp;mu;L 球形聚四氟乙烯垫片套件</td><td>Bruker Corporation</td><td>HZ07213</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;L 插件工具包</td><td>Bruker Corporation</td><td>B2950</td><td></td></tr><tr><td>Advance III 600 MHz NMR</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H HR MAS NMR 固体探头</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氘代水 99.9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>530867-1L</td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲基硅基)丙酸-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (TSP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

通过1h 核磁共振波谱法评估无菌小鼠在逐步定植过程中的肝脏代谢变化

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

众所周知，肠道细菌对宿主稳态具有重要贡献，可提供多种益处，例如免疫保护和维生素合成。它们还为宿主提供大量营养物质，使这一生态系统成为至关重要的代谢器官。随着越来越多证据表明肠道菌群与代谢综合征之间存在关联，阐明宿主与其肠道微生物群之间的代谢相互作用，已成为现代生物学面临的重要挑战之一。1-4
 定植（也称为正常化过程）是指微生物在原本无菌的动物体内建立的过程。虽然这一过程在出生时自然发生，但也常用于成年无菌动物，以控制其肠道菌群生态系统，并进一步确定其对宿主代谢的影响。控制定植过程的常用方法是采用灌胃法，使用单一或混合的微生物。该方法会导致快速定植，但其缺点是极具应激性5。因此，有必要尽量减少应激反应，并获得较慢的定植过程，以便逐步观察细菌定植对宿主代谢的影响。
 在本文中，我们描述了一种利用非破坏性代谢谱分析技术，在逐步定植过程中评估肝脏代谢变化的方法。我们建议通过基于1H核磁共振（NMR）的代谢谱分析，检测尿液中微生物共代谢产物的排泄情况，来监测肠道微生物的定植过程。该方法能够评估肠道微生物活性的稳定性，而不仅仅局限于通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）监测粪便细菌来评估肠道微生物生态系统是否稳定建立6。定植过程在常规开放环境中进行，通过使用被常规动物污染的脏垫料启动，这些常规动物将作为对照组。由于啮齿类动物具有食粪行为，因此可实现均匀的微生物定植，正如先前研究所描述的那样7。
 利用1H高分辨率魔角旋转核磁共振波谱法，可直接从完整的肝活检组织中测定肝脏代谢谱。该半定量技术能够在不破坏细胞结构的前提下，快速评估甘油三酯、葡萄糖和糖原等主要代谢物，从而进一步估算定植过程与肝脏代谢之间复杂的相互作用7-10。该方法也可应用于任何组织活检样本11,12。

本文描述了一种逐步定植方法，以进一步评估其对宿主肝脏代谢的影响。通过基于核磁共振（NMR）的代谢谱分析，无创监测微生物共代谢产物在尿液中的排泄情况，以评估定植过程；同时，通过对完整肝组织活检样本进行高分辨率魔角旋转（HR MAS）NMR代谢谱分析，评估肝脏代谢状态。

通过1H 核磁共振波谱法评估无菌小鼠在逐步定植过程中的肝脏代谢变化

众所周知，肠道细菌对宿主稳态具有重要贡献，可提供多种益处，例如免疫保护和维生素……

本实验的目的是评估逐步定植对宿主肝脏代谢的影响。首先对无菌小鼠进行逐步定植以实现该目标，通过核磁共振（NMR）波谱法检测尿液中微生物共代谢物的排泄情况，从而监测定植过程。在监测定植过程后，从小鼠体内采集肝脏活检样本，并进行代谢谱分析的制备。随后，可利用非破坏性的高分辨率魔角旋转核磁共振波谱法对完整的活检样本进行检测，获得肝脏代谢谱。最终，这种质子核磁共振波谱技术可揭示参与能量代谢和氧化应激等代谢通路中的多种代谢物。因此，该实验可为肝脏在定植过程中的功能提供见解，也可应用于肾脏等其他系统。为实现动物定植，需将无菌小鼠从隔离器中取出，并饲养于常规饲养室的笼具中，笼具前方需配备过滤装置，常规饲养的动物作为对照组。然后，取自对照常规鼠笼中三天大的垫料的一半与无菌动物的垫料混合。通过将小鼠置于1.5毫升微量离心管上方并轻轻按摩其肠道以辅助排尿，收集尿液。使用5毫米核磁共振（NMR）探头检测至少需要20微升尿液，但建议使用30微升以提高代谢谱分析的质量。收集后应立即用液氮速冻尿液，并在至少-40摄氏度条件下保存，直至进行NMR分析。在进行核磁共振（NMR）检测之前，用重水配制0.2摩尔的磷酸钠缓冲液，pH值为7.4，并含有1毫摩尔的TSP。取30微升待测尿液与30微升磷酸钠缓冲液混合。使用配备金属针头的50微升玻璃注射器，将50微升混合溶液转移至1.7毫米的NMR毛细管中。注意避免产生气泡。将毛细管适配器安装在装有尿液样本的毛细管顶端，并将其放入一根2.5毫米的NMR微量管中，以用于5毫米NMR探头。这种组合的试管可作为标准的5毫米NMR试管用于谱图采集。本实验中，使用一台Bruer Advanced 700兆赫兹核磁共振波谱仪（NMR）采集数据。根据书面实验方案中讨论的参数，获取一维质子核磁共振谱。核磁共振数据采集完成后，按照书面实验方案中所述的动物安乐死步骤，在2.5毫米核磁共振管中使用提取杆轻轻旋转毛细管接头，将毛细管取出。准备进行肝活检。请勿使用任何含酒精的产品，以避免污染，并使用水或生理盐水清洗工具。为获得可重复的活检样本，应从左叶采集肝活检组织。采集时应始终位于左叶的中央区域，避免在组织较薄的周边区域操作。注意勿穿破胆囊，以防胆汁泄漏。组织采集后应立即用水或生理盐水冲洗。立即将活检组织在液氮中速冻，并在负80摄氏度下保存，直至进行核磁共振分析。为进行高分辨魔角旋转核磁共振（H-R-M-A-S-N-M-R）实验，将第三份活检组织插入氧化锆转子中，并用纯重水填充剩余体积以实现核磁共振信号锁定。注意避免产生气泡，因为气泡可能影响后续匀场和数据采集的质量。使用圆柱形螺丝插入一个50微升的聚四氟乙烯（Teflon）垫片。将其拧下，并使用短端的深度规进行校准。将螺纹销置于垫片上，用螺丝刀轻轻拧紧。用一张纸巾擦干仪器表面及残留的水分。接下来，将盖帽置于转子顶部，并将其插入转子压紧器中。用力按压，直至盖帽完全就位。转子与其盖帽之间不应留有任何空隙。使用黑色记号笔标记转子底部的一半位置，以便进行光学转速检测。转子充分装填后，将其放入核磁共振波谱仪中，并以5 kHz开始旋转。此处使用的是Bruker Avance III 500 MHz波谱仪。采用CPMG脉冲序列采集质子核磁共振谱。根据制造商的说明，可利用在 5.22 百万分之一处出现的强α和数字葡萄糖双重峰对所得核磁共振（NMR）谱图进行校准。拆卸转子时，先使用帽盖移除工具取下帽盖，拧下螺纹销，移除聚四氟乙烯（Teflon）垫片。使用圆柱形螺丝，可用水和洗涤剂彻底清洗装置。在定植过程期间，肠道微生物共代谢物的出现情况在此动物定植20天后的尿液代谢谱质子谱中得到清晰展示。该动物在无菌状态下未排泄任何吲哚硫酸，且仅排出极少量的苯乙酰甘氨酸（缩写为PAG）和对羟基苯乙酰硫酸。随着定植的进行，这三种由肠道微生物介导的蛋白质代谢标志物显著增加，并在第20天达到平衡状态。通过积分特定的 PAG 三重峰，可以量化该特定标志物随时间的增加情况。该图展示了利用质子 H-R-M-A-S-N-M-R 波谱法对七只动物在定植期间平均 PAG 浓度的检测结果，同时获得了两只小鼠在定植前后肝脏代谢谱。此图很好地说明了从 A-M-A-S-N-M-R 基础的代谢谱中可获得的信息。可以检测到多种氨基酸以及能量代谢产生的代谢物。这些谱图还包含与氧化应激、核苷酸代谢和甲胺代谢相关的信息。在此示例中，无菌小鼠几乎检测不到糖原，且葡萄糖和甘油三酯含量极低，这一现象非常明显。因此，通过遵循此操作流程，可应用多种统计工具（如chemo）根据代谢谱对逻辑样本进行聚类，并突出与代谢状态相关的生物标志物。

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科研

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