相关的光学和电子显微镜（CLEM），作为工具来可视化显微注射分子和他们的真核细胞的亚细胞目标
2012年5月4日
CLEM技术已被用于分析超微结构形态的细胞膜，细胞器，通过显微注射的分子和亚细胞结构的影响。这种方法结合了强大的技术，的显微/显微注射，共聚焦荧光显微镜，电子显微镜，允许毫米多纳米的分辨率。此技术是适合于各种各样的应用。
以下实验的总体目标是将荧光标记的小分子或蛋白质引入培养的哺乳动物细胞的细胞质中，并观察诱导的从微米到多纳米分辨率的形态变化。这是通过首先在网格玻璃盖玻片上培养哺乳动物细胞，然后用荧光标记的小分子或目标蛋白质显微注射来实现的。接下来，将细胞固定在甲醛中，并使用荧光显微镜观察和成像。
然后用戊二醛固定细胞，切片、染色并使用电子显微镜成像。最后，将明场荧光和电子显微镜期间拍摄的图像进行组合和对齐。最终，这些图像的相关性使研究人员能够在由感兴趣的小分子或蛋白质诱导的高分辨率扰动下成像。
大家好，我是达拉斯德克萨斯大学西南医学中心微生物学系 Neil Alto 博士实验室的 Evan Reddick 博士。今天，我将与您讨论 M Clem 手术或显微注射相关光学和电子显微镜。与显微注射或显微镜等独立技术相比，该程序的主要优点是，它们在这里协同进行，并辅助使用网格玻璃盖玻片。
正是这种网格状盖玻片允许研究人员在方案的不同部分返回同一个细胞。此外，该技术使研究人员能够观察各种可注射小分子或感兴趣的蛋白质引起的亚细胞结构变化，并且能够从微米到多纳米分辨率进行观察。为了准备显微注射，在贴有两个活细胞培养皿的光刻玻璃网格盖玻片上培养细胞，例如正常大鼠、肾脏或永生化宫颈癌细胞，在 37 摄氏度和 5% CO 2 下孵育细胞。
根据要使用的实验时间表，调整细胞的 co fluity。完全汇合的板将使电子显微镜中微量注射细胞的鉴定变得非常困难。因此，诸如它们之类的种子细胞在短期实验当天达到约 50% 的 co 流畅度和大约 25% 的 co 流畅度。
在较长实验的当天，在适当的缓冲液中制备荧光标记的蛋白质 DNA 或小分子，最终体积为 50 μL。根据所选的 Fluor ofor，添加示踪染料，例如 Texas red 或 cascade blue。添加浓度为 0.5 至 1 毫克/毫升。
通过 0.22 微米离心过滤器过滤溶液。按照制造商的指南拉动显微注射针后，小心地将微量溶液移液到针头后端。将针头装入连接到倒置显微镜的商用显微注射装置的显微机械臂中。
将培养细胞培养皿放入倒置显微镜的培养皿支架中。查找在照片蚀刻网格中生长的单元格，并记下网格的字母数字标识符。这将用于所有后续步骤。
重要的是选择粘附在盖玻片中心附近的显微注射细胞，并避免靠近外围的细胞。这很重要，因为它将确保将感兴趣的细胞有效地转移到稍后用于电子显微镜的 epon 树脂中心。手动将注射臂降低到盖玻片上，并使用微型机械手降低针头，直到尖端轻轻接触细胞表面。对于以约 50% Co 流利度生长的细胞，所选网格内的每隔一个细胞进行微量注射，预计每 600 平方微米网格约有 80 个细胞，这将产生约 30 至 40 个实验和对照细胞的 N。
注射后，将培养皿放回培养箱中所需时间以进行荧光显微镜检查。弃去生长培养基，在室温下用 PBS 中的甲醛固定细胞 10 分钟。用一种 XPBS 替换固定剂。
然后通过以低倍和高倍率拍摄所选网格的 5 到 10 张明场图像来记录细胞的排列。为了识别微量注射细胞，在惰性注射染料眼的激发和发射波长处拍摄荧光图像。使用共聚焦显微镜，在相同的先前成像网格内以高放大倍率收集微量注射细胞的 Zack 图像。
需要高放大倍率才能将荧光图像与将使用电子显微镜识别的亚细胞结构相关联。共聚焦成像后，使用盖玻片去除液将盖玻片与培养皿分离，并将其细胞面朝上放入含有一个 XPBS 的新鲜培养皿中。继续进行电子显微镜检查的处理。
遵循标准 EM 协议。为了固定染色剂和脱水样品，制备 epon 树脂并将盖玻片池面朝下放在填充 eon 树脂的试管顶部。让树脂在 60 摄氏度下聚合 24 小时。
从 epon 树脂上取下盖玻片。快速浸入液氮中。温度冲击从 60 摄氏度到零下 196 摄氏度。
将盖玻片从树脂管中脱落。等待 5 到 10 分钟，然后取回试管，试管现在没有盖玻片。在解剖镜下，检查填料表面以找到感兴趣的网格。
使用无菌剃须刀片或手术刀，将 epon 块向下修剪，使只有感兴趣的网格位于块的顶点，具有超微音切割修剪块的连续切片使用小便池醋酸盐和柠檬酸铅对切片进行对比使用标准方案。使用细胞的相对位置作为指导，在电子显微镜中重新定位所需的细胞。使用之前捕获的高分辨率荧光图像。
在电子显微照片中识别与荧光信号相对应的感兴趣区域。使用异质染色质的位置和核膜等标志来确定哪个荧光 Zack 图像对应于 EM 切片。目前正在使用 Image J 或 Adobe Photoshop 等成像程序进行成像，将荧光图像的不透明度降低到 50% 并将其叠加到相应的 TEM 图像上。
通过调整显示的比例来对齐图像。以下是显微注射和相关光学和电子显微镜的结果。该图像显示了在激光蚀刻玻璃网格盖玻片上生长的 NRK 细胞的明场显微照片。
请注意用于标识包含注入单元格的网格的 b 和 m 背景字母。箭头表示用电子显微镜识别和成像的两个细胞。此处显示的是用于识别微量注射细胞的惰性示踪染料级联蓝的荧光图像。
这是胺标记的小分子的明场和荧光信号的叠加。该面板代表了注射细胞的明场荧光和电子显微镜的相关性。箭头表示在此面板中以较高放大倍率成像的荧光点。
观看此视频后，您应该对如何使用显微注射 Clem 或相关光学和电子显微镜程序显微注射感兴趣的蛋白质并跟踪其诱导的亚细胞形态变化有一个很好的了解。
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概览
CLEM技术能够分析受微注分子影响的膜和细胞器的超微结构形态。通过结合微操作、共聚焦荧光显微镜和电子显微镜，该方法实现了从毫米到多纳米尺度的高分辨率成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 该研究侧重于小分子或蛋白质对培养的哺乳动物细胞的影响。
- 荧光标记允许在细胞内追踪这些分子。
- 结合不同的显微镜技术提高了观察到的变化的分辨率。
- 在不同分辨率下理解细胞反应对神经科学研究至关重要。
研究目的
- 将荧光标记的分子引入哺乳动物细胞。
- 观察这些分子诱导的形态变化。
- 对不同显微镜技术的图像进行关联以进行详细分析。
使用的方法
- 在带网格的玻璃盖片上培养哺乳动物细胞。
- 用荧光标记的小分子或蛋白质微注细胞。
- 用甲醛固定细胞以进行荧光显微镜成像。
- 用戊二醛固定、切片、染色，并使用电子显微镜成像。
主要结果
- 高分辨率图像揭示了被注入的分子诱导的扰动。
- 成功对齐荧光和电子显微镜的图像。
- 展示了CLEM分析亚细胞结构的能力。
- 提供了对各种尺度上形态变化的洞察。
结论
- CLEM技术有效用于研究细胞对微注分子的反应。
- 结合成像技术允许对细胞形态进行全面分析。
- 该方法可以应用于神经科学和细胞生物学的各种研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) enables biopharma teams to visualize the precise subcellular localization and morphological impact of microinjected molecules in eukaryotic cells. This dual-modality approach bridges the gap between dynamic fluorescent imaging and ultrastructural electron microscopy, supporting mechanistic de-risking and target validation. Integrating CLEM into discovery workflows enhances predictive confidence in early-stage compound and biologic evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular perturbations at subcellular resolution for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by correlating molecular localization with ultrastructural changes.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of protein or small molecule effects within disease-relevant cellular compartments.
Screening & Assay Development
- Provides validated imaging outputs for downstream assay development and screening workflows.
- Ensures reproducibility and standardization by leveraging gridded coverslips for precise cell tracking.
- Delivers quantitative and spatially resolved data to inform compound selection and prioritization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular morphological readouts with translational biomarker strategies when relevant.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling high-resolution mechanistic insights.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of cellular responses.
Pipeline & Workflow Integration
CLEM integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution, correlative imaging of microinjected molecules and their cellular effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking molecular localization to ultrastructural outcomes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables direct comparison of experimental and control conditions through aligned fluorescence and EM images.
- Translational Research: Offers mechanistic insights that inform biomarker alignment and preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse molecular and cellular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing high-content data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on direct cellular evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both fluorescence and electron microscopy techniques.
- Demands access to specialized instrumentation, including microinjection systems and high-resolution microscopes.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and image alignment.
- Adaptation may be needed for different cell types or molecular classes.
- Throughput is limited by manual microinjection and imaging steps.
