Name: 相关的光学和电子显微镜（CLEM），作为工具来可视化显微注射分子和他们的真核细胞的亚细胞目标 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学习使用显微注射相关光镜和电镜技术，将荧光标记的小分子或蛋白质导入哺乳动物细胞，观察从微米到纳米尺度的亚细胞形态变化，实现高分辨率成像分析。

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我们感谢Alto实验室成员提供的有益讨论。我们还感谢德克萨斯大学西南医学中心分子与细胞影像中心的Chris Gilpin博士、Tom Januszewski和Laurie Mueller，感谢他们提供的专业技术支持与建议。我们还感谢Xionan Dong博士对本文手稿的审阅。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI083359（资助给N.M.A.）支持。

1. 哺乳动物细胞培养
<ol>
 <li>
 正常大鼠肾细胞（NRK）、永生化宫颈癌细胞（HeLa）或其他合适哺乳动物细胞系在以下条件下培养： 37°C，5% CO₂2，置于活细胞培养皿中经光刻蚀处理的网格盖玻片上（参见 表1 在 DMEM + 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素中进行本方案所用的任何试剂或仪器的处理。操作培养的哺乳动物细胞时，应采取预防措施以维持无菌环境。
 </li>
 <li>
 根据您的实验时间线（0-5 小时） 与 注射后1-2天，细胞融合度应分别调整至约50%或约25%。 
 </li>
</ol>
2. 显微注射
<ol>
 <li>
 根据目标分子对细胞培养的兼容性，选择合适的缓冲液配制所需蛋白质、DNA 或小分子，最终体积约为 50 μl。加入惰性荧光染料（如德克萨斯红或瀑布蓝）以标记显微注射的细胞；注射用染料与荧光探针的选择应确保激发波长和发射波长不重叠。待注射分子所需浓度需通过实验确定，荧光示踪染料通常使用浓度为 0.5–1.0 mg/ml。通常使用商业试剂盒将罗丹明或其他荧光团共价连接至目标分子上，但也可根据检测灵敏度选择其他检测方法。更多信息请参见下文的“关键注意事项”。
 </li>
 <li>将注射液（约 50 μl）通过 0.22 μm 离心滤器过滤。相比真空或注射器过滤，离心滤器更优，因其可避免死体积问题。</li>
 <li>制备显微注射针时，按照制造商说明使用 Flaming-Brown 微量移液器拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管。也可直接从供应商（如 Eppendorf）购买显微注射针，该公司生产 femtotip 显微注射针。</li>
 <li>使用 Eppendorf 20 Femtotips 小心地将 4 μl 注射液移入显微注射针未处理的一端。确保拉制后的显微注射针内无气泡。将显微注射针装入连接于倒置显微镜的 Eppendorf FemtoJet Injectman 的微操作臂中。有关显微注射操作的详细综述，读者可参考《可视化实验杂志》此前发表的一篇文章8。</li>
 <li>将带有刻度盖玻片和培养细胞的活细胞培养皿放入蔡司倒置显微镜的载物台支架中。找到生长在光刻网格内的细胞，并记录该网格的字母数字标识符，后续所有步骤均需使用此编号。理想情况下应选择位于盖玻片中央的细胞，因为后续操作将限制盖玻片边缘区域的样本转移。</li>
 <li>手动将注射臂移至盖玻片上方，利用微操作器操纵杆和控制装置将注射针缓慢下移，直至针尖轻轻接触培养细胞表面，然后按下“限位”以防止针头进一步移动而折断脆弱的硼硅酸盐玻璃针。细胞显微注射的其余操作均依照 Eppendorf FemtoJet InjectMan 用户手册进行。该显微注射技术最近被用于研究细菌分泌的单个毒力蛋白9。</li>
 <li>在选定的网格内对每隔一个的细胞进行显微注射。当细胞密度约为 50% 时，每个 600 μm2 网格内大约有 80 个细胞（示例见图 3A）。因此，在进行荧光显微镜和电子显微镜观察时，可获得约 30–40 个实验组和对照组细胞。</li>
 <li>将活细胞培养皿放回哺乳动物细胞培养孵育箱中，根据实验设计所需时间继续培养。或者，也可在显微注射后直接进行延时显微成像分析，以在固定前观察特定亚细胞结构的出现情况。</li>
</ol>
3. 荧光显微镜
<ol>
<li>如需进行活细胞延时荧光检测，可在显微注射细胞后执行该测量，随后将培养基替换为含2.5%戊二醛的0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4），室温孵育10分钟。若无需活细胞检测，则弃去细胞培养基，加入5 ml含3.7%甲醛的1×PBS溶液，室温固定细胞10分钟。弃去固定液，更换为5 ml 1×PBS溶液，进入步骤3.2。注意：必须在完成荧光显微镜观察后，方可加入戊二醛。</li>
<li>将带有光刻网格盖玻片的活细胞培养皿置于荧光显微镜中（此步骤无需共聚焦显微镜），采集目标网格区域的5–10张明场与荧光图像，以记录细胞排列情况（图4A）。利用惰性注射染料的激发与发射波长，识别已进行显微注射的细胞（图4B）。为便于后续电子显微镜步骤中准确定位显微注射细胞，需获取不同放大倍数（如10×和65×）的图像。</li>
<li>使用共聚焦荧光显微镜，对步骤2.5中已识别网格内的显微注射细胞采集Z轴层扫图像。为将荧光图像与电子显微镜中观察到的亚细胞结构进行精确对应，需采用高倍放大（100×）成像。</li>
<li>使用市售盖玻片剥离液将盖玻片从活细胞培养皿底部取出，细胞面朝上置于新的细胞培养皿中，内含5 ml 1×PBS溶液。随后按照下述步骤对盖玻片进行电子显微镜样品处理。</li>
</ol>
4. 透射电子显微镜
<ol>
<li>用 2 ml 2.5% 戊二醛溶于 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液（pH 7.4）替换 1×PBS 缓冲液，室温孵育 10 分钟。更长的孵育时间虽非必需，但有助于维持细胞亚结构的完整性。注意：单独使用甲醛不足以作为电镜分析的固定剂。</li>
<li>移除固定液，加入 2 ml 1% 四氧化锇溶于 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液对细胞进行染色，孵育 30 分钟，随后用卡可基酸盐缓冲液洗涤三次，最后将所有缓冲液替换为 ddH2O。</li>
<li>按照标准电镜流程，将样品置于梯度浓度（70% 至 100%）乙醇中进行脱水。制备环氧树脂（Epon），并将光刻带网格的盖玻片细胞面向下放置于充满 Epon 树脂的模具上。在 60°C 下聚合 24 小时。通过将光刻网格盖玻片细胞面向下置于 Epon 树脂上，目标细胞及网格图案将在聚合过程中一同转移至 Epon 树脂中（示例见图 3B）。</li>
<li>通过将样品迅速浸入液氮和/或沸水中，从 Epon 树脂上取下盖玻片。在双目解剖显微镜下检查树脂表面，定位目标网格区域（注意：网格图案将以镜像形式转移）。使用无菌剃刀片或解剖刀修整 Epon 树脂块，使仅目标网格位于树脂块顶端。</li>
<li>使用超薄切片机，对修整后的树脂块进行连续切片，切片厚度根据需要设定（常规透射电镜约 70 nm，断层扫描电镜约 250 nm）。按照标准流程，用醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行染色反差增强。</li>
</ol>
5. 相关光镜与电镜显微技术
<ol>
 <li>利用先前步骤中获得的图像，在电子显微镜下重新定位感兴趣的细胞。一旦找到已进行显微注射的目标细胞，使用高分辨率共聚焦荧光图像来识别细胞内感兴趣的区域，并利用透射电子显微镜（TEM）对这些区域进行高分辨率成像。通过细胞边缘和核膜等结构作为定位标志，确定哪一张荧光z轴层扫图像与TEM切片相对应。
 </li>
 <li>
 使用您选择的成像软件（例如 Image J、Adobe Photoshop 等），将荧光图像的不透明度降低至50%，然后将其叠加到对应的TEM图像上。通过调整共聚焦图像的比例尺（注意保持比例不变）和旋转角度，使其与TEM图像对齐。适当调节荧光图像的对比度、锐度等参数可能有助于提高对齐精度。注意：我们发现异染色质、核膜以及细胞边缘是辅助两幅图像定向的极佳定位标志。
 </li>
</ol>





6. 关键注意事项
<ol>
 <li>为了更便于定位注射的小分子，可使用市售试剂盒将罗丹明（Rhodamine）或荧光素（Fluorescein）等荧光标记物共价连接至目标分子。在显微注射前异位表达一种荧光标记的亚细胞定位蛋白，可进一步获取额外信息。因此，荧光染料以及惰性显微注射示踪染料的选择至关重要。</li>
 <li>选择进行显微注射的细胞时，应挑选紧靠盖玻片中心区域贴壁的细胞，避免选择靠近边缘网格的细胞。这样可最大程度确保目标细胞能够成功转移至用于电子显微镜观察的环氧树脂（Epon resin）中。</li>
 <li>细胞汇合度非常重要，因为完全汇合的细胞单层将使在电子显微镜下识别显微注射细胞变得极为困难。建议接种细胞时控制密度，使其在短期实验当天达到约50%汇合度，或在较长（1–2天）实验当天达到约25%汇合度。利用细胞的位置、形态以及“空白区域”作为地标，有助于对齐和定位电子显微镜图像。</li>
 <li>共聚焦显微镜的光学切片厚度应根据实验需求进行调整，需通过实验经验确定10。</li>
 <li>固定剂甲醛和戊二醛应使用最高纯度等级的产品。甲醛能够固定细胞，同时保留蛋白质和小分子荧光染料（如罗丹明或FITC）的荧光特性，但无法充分保存可用于高分辨率电镜分析的超微结构。而戊二醛则能高度保留膜结构和亚细胞结构，适用于电镜分析，但会显著淬灭荧光信号。因此，两步法固定对于同时实现荧光显微镜和电镜观察至关重要。若进行活细胞实验，可省略甲醛固定步骤，最终仅通过戊二醛处理完成固定。</li>
</ol>
7. 典型结果
该方法能够将目标分子直接递送至真核细胞的细胞质中，并在从毫米到多纳米分辨率的范围内监测其定位以及对细胞和细胞器结构的影响。图2展示了实验装置与操作流程的示意图。该技术依赖于对生长在激光蚀刻玻璃网格盖玻片上的细胞进行显微注射（图3A），在共聚焦显微镜观察后，可将目标细胞以及网格图案一同转移至Epon树脂中（图3B）。
典型的显微注射联用冠状断层成像（CLEM）流程可获得荧光图像与电子显微照片，经关联比对后，可实现亚细胞定位与超微结构分析。将细胞培养于光刻有网格的玻璃盖玻片上，显微注射目标分子后，获取明场图像（图 4A）。加入惰性示踪染料以区分显微注射细胞与未注射细胞（图 4B）。利用与目标小分子相连的荧光染料或其他标记物，获取共聚焦z轴层扫图像（图 4C）。样品经戊二醛固定后进行电镜制样处理。获取电子显微照片，并将其叠加至对应细胞位置（图 4D）。对含有荧光信号的区域，以更高放大倍数进行更详细的观察（图 4E）。
<img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="为期五天的显微注射、荧光成像、电镜制样及关联成像实验时间线示意图" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 显微注射关联成像（CLEM）实验的时间线。根据实验设计，显微注射与荧光检测可在同一天完成。由于存在较长的孵育步骤，电镜样品制备耗时最长，通常需要 2–3 天。透射电镜（TEM）分析以及将荧光信号与电镜图像进行关联可在一天内完成。
 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="相关光镜与电镜示意图；显微注射、共聚焦显微镜、电镜照片。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 显微注射结合相关光镜与电镜（CLEM）流程的总体示意图。步骤 1： 在激光刻蚀带网格的玻璃盖玻片上定位生长的细胞，并对目标分子进行显微注射。步骤 2： 采集显微注射后细胞的明场图像及共聚焦荧光z轴层扫图像。步骤 3： 将盖玻片用于电镜分析样品制备，并包埋于Epon树脂中；利用转移的网格图案修块，使目标细胞位于块面顶端。步骤 4： 使用超薄切片机切割连续超薄切片。步骤 5： 将荧光图像与电镜图像进行关联比对。
<img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="微流控芯片分析；细胞培养示意图；标注A-C的装置；生物技术研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 网格图案有助于识别目标细胞。图A显示对生长至约50%汇合度的细胞进行显微注射；注意网格标识aK。比例尺为100 μm。图B显示将盖玻片上的网格图案转移至已聚合的Epon树脂块上，待在解剖显微镜下确定目标网格区域后，对该树脂块进行连续切片。图C显示为切片准备过程中转移的网格图案。注意，树脂块上的转移网格图案呈镜像反转；比例尺为1200 μm。
<img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="细胞结构的显微镜分析；包括荧光和相差成像；显示比例尺。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 显微注射相关联的光学显微镜与电子显微镜（CLEM）的代表性结果。图A 显示生长在激光蚀刻玻璃网格盖玻片上的NRK细胞的明场显微图像；箭头指示在图C-D中通过CLEM观察的两个细胞。图B 显示惰性示踪染料（本例中为Cascade Blue）的荧光信号，用于识别已进行显微注射的细胞。图C 显示明场图像与罗丹明标记小分子荧光信号的叠加图像。此处显示的两个细胞在图A和图B中由箭头标出。图D 为明场、荧光和电子显微镜图像的联合成像；箭头尖端指示在图E中以更高倍数成像的荧光点状结构。比例尺如下：图A和图B，100 μm；图C和图D，50 μm；图E，100 nm。

<ol><li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li>
<li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells%2C+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Anat%22%5BJournal%5D)">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li>
<li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li>
<li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li>
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<li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+%28FSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325(2009).</li>
<li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li>
<li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSemwogerere%2C+D+%22Confocal+Microscopy+in+Encyclopedia+of+Biomaterials+and+Biomedical+Engineering%22">Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering</a>. , Taylor and Francis. London. (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的方法可实现将纯化的蛋白质、核酸或小分子直接递送至真核细胞胞质，并通过荧光显微镜与电子显微镜的联合分析，实现超高分辨率的成像研究。该方法操作简便且结果可靠，可在具备常规核心设施和/或配备适当设备的电子显微镜实验室中自主完成。该技术同样适用于活细胞实验，允许用户实时监测荧光标记分子的动态行为，因此可与延时显微镜结合使用，并与断层电子显微镜进行关联分析。
在实验的各个阶段，均应进行初步的实证试验，以确定最佳的细胞融合度、显微注射效率和注射物适量递送、荧光染料及注射/示踪染料的优化，以及透射电镜分析所需的设备条件或专业技术的可及性。在整个CLEM流程的每一步中准确定位已注射的细胞对本方案至关重要，因此建议选择生长在盖玻片中心区域带有字母数字网格的细胞，以提高样品在共聚焦显微镜和电子显微镜下均能被成功记录的可能性。为便于定位目标细胞，在电子显微镜分析过程中应利用周围细胞的相对位置作为解剖标志，辅助识别特定样本。最后，切片厚度应根据所需的测量目的进行调整。进行透射电子显微镜（TEM）观察时，推荐使用约70 nm的连续超薄切片；而进行电子显微镜断层成像时，则推荐使用较厚的切片（约250...

<table><tbody><tr><td>光&amp;#8211;带盖玻片的活细胞培养板</td><td>MatTek 公司</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>德克萨斯红</td><td>Invitrogen</td><td>D3329</td><td></td></tr><tr><td>Cascade Blue</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>53002</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 离心过滤单元</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃移液管</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 型微操作仪</td><td>完成梯度测试后使用程序#4</td></tr><tr><td>FemtoJet 显微注射系统</td><td>Eppendorf</td><td>Injectman NI2</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片去除液</td><td>MatTek 公司</td><td>PDCF OS 30</td><td></td></tr><tr><td>Technai 透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Technai G2 BioTWIN</td><td></td></tr><tr><td>超微切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC6</td><td></td></tr></tbody></table>

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

真核细胞依赖于复杂、高度调控且功能各异的膜结合区室，这些区室维持了细胞正常功能所必需的生化极性。因此，理解酶、蛋白质和细胞骨架组分如何调控并维持这种生化分隔至关重要。利用荧光标记分子定位和/或干扰细胞内区室的研究已获得了大量知识，推动了人们对细胞调控机制的理解。荧光显微镜和共聚焦显微镜等成像技术使得确定荧光标记小分子的位置相对简便，然而对非常微小结构的分辨能力仍然有限1。
另一方面，电子显微镜能够以极高的分辨率揭示亚细胞结构的形态细节，但其静态特性使得精确测量高度动态的过程变得困难2,3。因此，将同一样品的光学显微镜与电子显微镜相结合的技术，即相关联的光镜与电镜技术（Correlative Light and Electron Microscopy, CLEM）4,5，兼具了快速荧光成像和电子显微镜高分辨率的双重优势6。这一强大技术已被应用于细胞生物学多个方面的研究5,7。自问世以来，该方法显著提升了我们在高分辨率下识别亚细胞结构与形态的能力。
本文介绍了一种简化的快速显微注射结合关联显微技术（CLEM）的操作方法（图1）。该显微注射CLEM流程可用于将特定数量的小分子和/或蛋白质直接导入真核细胞的细胞质中，并可在从毫米到多纳米分辨率的尺度上研究其效应（图2）。该技术基于在激光刻蚀的玻璃网格盖玻片上培养细胞，盖玻片固定于活细胞培养皿底部，随后对细胞进行显微注射，并利用共聚焦荧光显微镜和电子显微镜进行成像。网格图案有助于定位目标细胞，该网格可随目标细胞一起完整转移至用于样品固定的Epon树脂中，便于电镜分析前的包埋与切片（图3）。通过叠加荧光图像与电镜图像，使用者可确定目标分子在细胞内的亚细胞定位，以及其引起的任何形态学和/或超微结构变化（图4）。该技术适用于从≤5秒至数小时不等的时间点，具体取决于所注射样品的性质。

CLEM 技术已应用于分析经显微注射分子影响的膜、细胞器及亚细胞结构的超微形态。该方法结合了显微操作/显微注射、共聚焦荧光显微镜和电子显微镜等强大技术，可实现从毫米到多纳米级别的分辨率。该技术适用于多种不同的应用。

真核细胞依赖于复杂、高度调控且功能各异的膜包被区室，这些区室维持着生化极性……

以下实验的总体目标是将荧光标记的小分子或蛋白质导入培养的哺乳动物细胞的细胞质中，并在微米至多纳米分辨率下观察所诱导的形态学变化。该目标首先通过在带网格的玻璃盖玻片上培养哺乳动物细胞，然后使用显微注射技术将荧光标记的目标小分子或蛋白质注入细胞内来实现。随后，用甲醛固定细胞，并利用荧光显微镜进行观察和成像。然后用戊二醛固定细胞，进行切片、染色，并使用电子显微镜成像。最后，将明场荧光显微镜和电子显微镜下获取的图像进行合并与对齐。最终，通过这些图像的关联分析，研究人员能够以高分辨率观察由目标小分子或蛋白质诱导的结构变化。大家好，我是德克萨斯大学西南医学中心微生物学系Neil Alto博士实验室的Evan Reddick博士。今天我将向大家介绍M Clem技术，即显微注射关联光镜与电镜技术。该方法相较于单独使用的显微注射或显微镜技术的主要优势在于，这些技术在此过程中协同进行，并借助了带网格的玻璃盖玻片。正是这种带网格的盖玻片使得研究人员能够在实验方案的不同阶段返回到同一个细胞。此外，该技术使研究者能够观察由多种可注射的小分子或目的蛋白所诱导的亚细胞结构变化，并且可在微米至多纳米分辨率下进行观察。为进行显微注射，需将正常大鼠肾细胞或永生化宫颈癌细胞等培养细胞接种于固定在活细胞培养皿上的光刻蚀玻璃网格盖玻片上，于37°C和5%CO2条件下培养细胞。根据所使用的实验时间线，调整细胞的汇合度。完全汇合的培养板将使电镜下难以识别显微注射的细胞。因此，接种细胞时应使其在短期实验当天达到约50%的汇合度，而对于较长时间的实验，则应使其汇合度约为25%。在进行较长时间实验的当天，将荧光标记的蛋白质、DNA 或小分子用适当的缓冲液配制，终体积为 50 微升。根据所选荧光染料的类型，加入示踪染料（如德克萨斯红或瀑布蓝）。加入浓度为 0.5 至 1 毫克/毫升。使用0.22微米的离心滤器过滤溶液。按照制造商的指南拉制显微注射针后，小心地将数微升溶液用移液器加入到针的后端。将注射针装入连接倒置显微镜的商用显微注射装置的显微操作臂中。将培养细胞的培养皿放入倒置显微镜的载物台中。找到在光刻网格内生长的细胞，并记录该网格的字母数字标识符。此标识符将在后续所有步骤中使用。选择用于显微注射的细胞时，应挑选紧贴盖玻片中央区域附着的细胞，避免使用靠近边缘的细胞。这一点非常重要，因为这能确保将目标细胞高效地转移至后续透射电镜所用的环氧树脂中心样品台。手动缓慢降低注射臂至盖玻片上方，并使用显微操作器将注射针缓慢下移，直至针尖轻轻接触细胞表面。在选定的网格区域内，每隔一个细胞进行一次显微注射；对于约50%融合度培养的细胞，预期每600平方微米的网格内约有80个细胞，可获得约30至40个实验组和对照组细胞。注射后，将培养皿放回培养箱中，在所需时间内孵育以进行荧光显微镜观察。弃去培养基，用PBS中的甲醛在室温下固定

相关联的光学与电子显微镜技术（CLEM）作为可视化显微注射分子及其真核细胞亚细胞靶标的工具

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