锁定核酸流式细胞术-荧光原位杂交（LNA flow-FISH）：一种用于细菌小RNA检测的方法

本实验的总体目标是检测单个细菌细胞中细菌 RNA 的表达。首先设计一种在 5' 端带有生物素 TEG 修饰的锁核酸（LNA）探针来实现这一目标。随后对细菌细胞进行固定，用达西尔（dathyl）、过碳酸盐（percarbonate）或 dsy 处理，再进行透化处理，使 RNA 变性，并使 LNA 探针与目标 RNA 杂交。

第三，对细胞进行洗涤、封闭和染色。最后，通过流式细胞术检测细胞的荧光信号。最终可评估随时间变化及在不同细胞群体中RNA表达水平的变化。

该方法有助于解答关于单个细胞内RNA种类的相对存在及其丰度，以及在同质或异质细胞群体中这种表达变化程度的关键问题。尽管目前该方法主要用于监测细菌小RNA的表达，但理论上，它可适用于检测几乎所有细胞类型中的RNA。在设计LNA探针序列后，应使用blast分析以确保该探针仅特异性结合目标sRNA或mRNA。

订购探针时，需在LNA寡核苷酸的5'端添加生物素TEG修饰。该生物素连接对于杂交后使用链霉亲和素-地高辛配对抗体进行染色是必需的。实验中应包含三种阴性对照：其一为A，即无LNA对照，在杂交过程中不加入LNA探针。

第二步，设置无探针对照，其中LNA探针与目标sRNA发生杂交，但由于缺乏荧光染料，杂交事件无法被检测。第三步，设置非表达sRNA或mRNA对照，使用靶向不存在或不表达的sRNA的LNA探针，以监测非特异性杂交。首先，收集1×10⁸个目标细菌细胞，并将其转移至1.5毫升微量离心管中。然后在2300×g离心5分钟，使细菌细胞形成沉淀。

用移液器吸除上清液，不要倾倒。接着，将沉淀重悬于400 µL PBS中，加入400 µL PFA乙酸-PBS固定液，并充分混匀细胞。然后在25 °C下孵育10分钟。

再次离心细胞后，静置5分钟，然后涡旋振荡一次。此次离心条件为4,500 × g，离心2分钟。用400 µL PBS将沉淀洗涤两次。

最后，将沉淀重悬于400 µL的PBS中，并将已固定的细胞在4°C下保存，最长可保存七天。首先，向每份固定的细菌细胞样品中加入400 µL新配制的0.1% DSY溶液，然后通过移液充分混匀细胞悬液。

将该混合物在25摄氏度下孵育12分钟，然后用400微升PBS洗涤细胞两次，再向细胞中加入800微升新鲜配制的溶菌酶溶液。通过涡旋充分混匀细胞与溶菌酶溶液，并在25摄氏度下孵育30分钟，期间偶尔混匀。离心沉淀细胞后，向细胞沉淀中加入800微升新鲜配制的蛋白酶K溶液，并用移液器充分吹打重悬细胞溶液以彻底混匀。

将细胞在25摄氏度孵育15分钟，在孵育中途涡旋振荡；孵育结束后离心并用400微升PBS洗涤细胞，再将细胞重悬于另外400微升PBS中，取100微升悬液分别加入四个独立的1.5毫升微量离心管中，随后离心收集细胞并弃去上清液。接着将四个样品分别加入100微升杂交缓冲液，在60摄氏度下孵育60分钟。杂交完成后，向杂交混合物中加入1毫升SSC加Tween 20（即SSCT），以帮助细胞从黏稠的杂交溶液中释放出来。

离心收集细胞后，向沉淀中加入200微升甲酰胺SSCT溶液，充分混匀。然后将样品置于65摄氏度的加热块中孵育30分钟。接着向混合物中加入1毫升SSCT溶液，再次离心收集细胞后，将细胞重悬于500微升SSCT溶液中，并将细胞悬液在加热块上孵育40分钟。

离心后，向杂交细胞沉淀中加入200微升封闭缓冲液，然后在25摄氏度孵育30分钟。再次离心后，向沉淀中加入50微升去除了生物素和染料的溶液，并充分混匀以制备无染料对照。再加入50微升封闭缓冲液。

将所有样品在25摄氏度下继续孵育12分钟，使用恒温混匀仪持续混匀，并用铝箔保护离心管避光。接着，用500微升SSCT缓冲液洗涤细胞一次，再用400微升含吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS + tween 20 或 PBST）洗涤一次。去除上清液后，加入100微升生物素化抗体、strippin及PBS，在25摄氏度下孵育30分钟，期间偶尔混匀；该抗体将结合上一步中引入的strippin DI偶联物。

然后，将细胞用400 µL PBST离心沉淀并洗涤两次后，向细胞中加入50 µL去标记的亲和素-染料溶液，充分混匀，进行第二次染色。此步骤可提高未加染料对照样本中每个杂交的LNA探针的信号输出。再次仅加入50 µL封闭缓冲液，然后将所有离心管置于恒温混匀仪中，在25 °C下持续混匀孵育12分钟。

加入染料溶液孵育后，先用500微升SSCT缓冲液再次洗涤细胞，第二次洗涤使用400微升PBST缓冲液。将细胞沉淀重悬于200微升PBST缓冲液中，并在4摄氏度保存，直至进行流式细胞术分析。对于较小的细菌细胞，将流式细胞仪的流速设为慢速，以减小液流核心尺寸。此外，对于具有前向散射光阈值截断功能的流式细胞仪，应将截断阈值设为尽可能低，以确保检测到微小的细菌细胞。

在此流式细胞术散点图中，展示了使用上述条件时固定和透化效果良好的细胞示例。在透化处理后，细胞群体较小且均一，表明细胞聚集体较少。然而，当使用较高浓度的溶菌酶时，细胞更容易发生聚集，并表现出增高的前向散射值，提示存在较大的颗粒，如本散点图所示。

此处展示了一次成功的LNA流式FISH实验的流式细胞术数据示例。该直方图显示了对目标sRNA的特异性检测，以及三个阴性对照。紫色的无染料阴性对照产生的荧光信号最少，其次是蓝色的无LNA阴性对照和红色的非表达sRNA阴性对照。

最后，使用针对SRNA的LNA特异性探针的样本在黑色背景下产生的荧光最强。一旦掌握，若操作正确，该技术可在约六小时内完成。此外，该技术提供的信息更多，且比逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）更具成本效益。

按照此步骤，可使用其他HAPS标记额外的探针，并在杂交步骤中加入，以实现多重RNA检测。I.