Name: 锁核酸流式细胞仪，荧光原位杂交（LNA流FISH）:细菌小RNA检测方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用锁核酸流式细胞仪荧光原位杂交技术检测单个细菌细胞中的小RNA表达。该方法结合LNA探针与流式细胞术，实现高通量单细胞RNA定量分析，为微生物基因表达研究提供新工具。

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本工作由美国海军研究实验室核心资金通过美国海军研究办公室资助。

1. LNA 探针与实验设计
<ol>
	<li>设计与您转录的 sRNA/mRNA 序列互补的 LNA 探针，或在 <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> 定制设计。若选择定制设计服务，您将获知探针序列，但无法得知 LNA 的掺入模式。每个 LNA 残基加入 DNA 或 RNA 寡核苷酸后，LNA-RNA 杂交双链的 Tm 将升高 2 至 10 °C14。理想情况下，设计的 LNA 探针长度应为 20–25 个核苷酸（过长的探针合成难度较大），且其 RNA 杂交的 Tm 应在 85–90 °C 之间。</li>
	<li>完成序列设计后，使用 BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> 或将探针序列比对至本地数据库，以确保该探针仅特异性结合目标 sRNA/mRNA。</li>
	<li>订购 LNA 探针时，应在 LNA 寡核苷酸的 5' 端添加生物素-TEG 修饰。该生物素化修饰是杂交后使用链霉亲和素-染料偶联物进行染色所必需的。必要时也可将该修饰加至 3' 端，但 5' 端修饰成本更低，且通常产率更高。</li>
	<li>实验中应包含三个阴性对照：(i) “无 LNA”对照，即在杂交步骤中不加入 LNA 探针；(ii) “无染料”对照，即加入 LNA 探针与目标 sRNA 杂交，但因未添加荧光染料而无法检测杂交信号；(iii) “非表达 sRNA/mRNA”对照，使用靶向不存在或不表达的 sRNA 的 LNA 探针，以监测非特异性杂交情况。</li>
	<li>本实验中所用的特异性 LNA 探针与 sRNA CsrB 互补，其序列为 5'-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3'（大写字母表示 LNA 单体）。</li>
	<li>收到冻干 LNA 探针后，用无核酸酶水重悬至 50 μg/mL，分装为 10–20 μL 体积，于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
溶液
<ul>
	<li>8% 多聚甲醛（PFA）、10% 乙酸 PBS 溶液：取 1 mL 32% PFA、400 μL 乙酸、400 μL 10X PBS（pH = 7.4）和 2.2 mL 无核酸酶水混合。若需分装冷冻保存，应不加乙酸，将溶液分装成单次使用量后于 -20°C 冷冻保存。</li>
	<li>60% 硫酸葡聚糖溶液：将 6.0 g 硫酸葡聚糖加入 50 mL 圆底离心管中，加水至终体积 10 mL。将该混合物置于 65 °C 水浴中加热，直至硫酸葡聚糖完全溶解（可能需要 1–2 小时）。在溶解过程中可能需要补充少量水，以维持 10 mL 总体积。将 60% 硫酸葡聚糖溶液分装后于 -20 °C 保存，直至使用。</li>
</ul>
2. 固定
<ol>
	<li>收集 1×108 个发光的 Vibrio campbellii 或目标细菌细胞，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。此细胞量足以用于制备四个流式 FISH 样本（一个特异性 LNA 探针样本和三个阴性对照）。若需检测其他 sRNA/mRNA 种类，应额外收集若干份 1.5 mL 微量离心管的细胞样本。</li>
	<li>在 2300 × g 条件下离心 5 分钟，使细菌细胞沉淀。用移液器吸弃上清液，并将细胞重悬于 400 μL 1× PBS 中。</li>
	<li>向该混合物中加入 400 μL 含 8% 多聚甲醛（pfa）和 10% 乙酸的 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS）溶液，充分混匀后于 25 °C 孵育 10 分钟，期间在 5 分钟时混匀一次。除非另有说明，所有孵育步骤均在加热的离心管架中进行。多聚甲醛溶液应在使用前新鲜配制，或使用加入乙酸后冷冻保存的分装液。多聚甲醛是一种交联固定剂，有助于保持细胞形态并保留细胞内 RNA。</li>
	<li>在 4500 × g 条件下离心 2 分钟，使细胞沉淀，并用移液器吸弃上清液。后续所有需要离心的步骤均应使用相同条件（7K，2 分钟）。需特别注意：离心后应使用移液器吸除上清液，而非倾倒。</li>
	<li>用 400 μL 1× PBS 洗涤细胞两次，并将最终的细胞沉淀重悬于 400 μL 1× PBS 中。此时细胞已固定，可在 400 μL 1× PBS 中于 4 °C 保存最多七天。</li>
</ol>
3. 焦碳酸二乙酯处理
<ol>
	<li>配制 400 μL 的 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）1×PBS 溶液（每份待测样品需使用 400 μL 该溶液，因此请根据样品数量相应调整配制量）。DEPC 溶液应使用 DEPC 原液新鲜配制。DEPC 处理可通过羰基乙氧基化作用使 RNase 失活，从而降低背景信号。</li>
	<li>向每份固定的细菌细胞样品中加入 400 μL 的 0.1% DEPC 溶液，并用移液器充分混匀。在 25°C 下孵育 12 分钟。用 400 μL 1×PBS 洗涤细胞两次，以 7K 离心 2 分钟收集细胞沉淀，并弃去上清液。</li>
</ol>
4. 透化
<ol>
	<li>将1.0 mg溶菌酶加入1 mL Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）中，配制成1.0 mg/mL的溶液。该溶液应新鲜配制。向细胞中加入800 μL 1 mg/mL的溶菌酶溶液，用移液器充分混匀，并在25 °C孵育30分钟，期间偶尔混匀。离心收集细胞（7K，2分钟），弃去上清液。溶菌酶通过水解细菌细胞壁中存在的肽聚糖发挥通透化试剂的作用。</li>
	<li>在TE缓冲液中配制3.0 μg/mL的蛋白酶K溶液。该溶液应使用储存于-20 °C的20 mg/mL蛋白酶K储备液新鲜配制。蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，可降解多种蛋白质，有助于探针和试剂对RNA的可及性。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入800 μL 3.0 μg/mL的蛋白酶K溶液，用移液器充分混匀。在25 °C孵育15分钟，孵育过程中中途涡旋振荡一次。</li>
	<li>离心收集细胞（7K，2分钟），弃去上清液，并用400 μL 1X PBS洗涤细胞一次。弃去洗涤后的上清液后，将细胞重悬于400 μL 1X PBS中，并将100 μL重悬液分别加入四个新的1.5 mL微量离心管中。离心收集细胞（7K，2分钟），弃去上清液。</li>
</ol>
5. 杂交
<ol>
	<li>为每个样品准备 100 μL 杂交缓冲液（HB）。HB 由 50% 体积的甲酰胺、10% 质量的硫酸葡聚糖（每 100 μL 加入 16.7 μL 的 60% 硫酸葡聚糖溶液）、1X 丹哈特溶液、50 mM 磷酸钠（pH 7.0）、2X 柠檬酸钠（SSC）、20 μg 剪切的鲑鱼精子 DNA（SSSD）和 20 μg 酵母 tRNA 组成。</li>
	<li>HB 的每种组分具有不同的作用。甲酰胺可降低核酸双链的熔解温度，从而有助于 RNA 变性并最小化细胞损伤。硫酸葡聚糖作为排阻体积的聚合物，用于浓缩探针并提高杂交速率。丹哈特溶液、酵母 tRNA 和 SSSD 作为封闭剂，以减少非特异性结合。</li>
	<li>在每个含有细胞重悬液的 1.5 mL 微离心管中，加入 95 μL HB 和 5.0 μL sRNA/mRNA 特异性 LNA 探针（最终浓度为 20 pmol 的特异性 LNA）或水（用于无 LNA 的阴性对照）。例如：
	<ol class="lalpha">
		<li>管 1 - 95 μL HB + 5.0 μL sRNA/mRNA 特异性探针</li>
		<li>管 2 - 95 μL HB + 5.0 μL sRNA/mRNA 特异性探针（“无染料”阴性对照）</li>
		<li>管 3 - 95 μL HB + 5.0 μL sRNA/mRNA 探针（“非表达 sRNA/mRNA”阴性对照）</li>
		<li>管 4 - 95 μL HB + 5.0 μL 水（“无 LNA”阴性对照）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="4">
	<li>将所有四个样品在 60 °C 下孵育 60 分钟。杂交温度取决于 LNA 探针的 Tm，应设置为比预测的 Tm 低约 30 °C，以利于 RNA 退火。较高的杂交温度和杂交缓冲液（HB）中的甲酰胺可确保目标 sRNA 或 mRNA 的二级结构发生变性。</li>
</ol>
6. 杂交后洗涤
<ol>
	<li>杂交后，向杂交混合物中加入 1.0 mL 0.1X SSC 缓冲液（含 0.1% tween-20，简称 SSCT）。此步骤可使细胞从黏稠的杂交溶液中释放。离心收集细胞（7K，2 分钟），弃去上清液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 200 μL 含 50% 甲酰胺、2X SSC 和 0.1% tween-20 的溶液，充分混匀，并在加热块中 65 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>向混合物中加入 1 mL 0.1X SSCT，离心收集细胞（7K，2 分钟），弃去上清液。</li>
	<li>加入 500 μL 0.1X SSCT 重悬细胞，在加热块中 65 °C 孵育 40 分钟。离心收集细胞（7K，2 分钟），弃去上清液。</li>
</ol>
7. 封闭与染色
<ol>
	<li>配制封闭缓冲液（BB）和链霉亲和素-染料染色溶液。从5X储存液（商业化产品，参见试剂部分）制备1X BB溶液。每四支试管一组，准备1.2 mL的1X BB溶液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入200 μL 1X BB，重悬细胞，并在25°C下孵育30分钟。</li>
	<li>使用链霉亲和素偶联的染料来检测生物素化的LNA探针。在封闭的同时，用1X BB配制浓度为2 μg/mL的DyLight 488链霉亲和素或其他所需染料-链霉亲和素偶联物溶液，孵育30分钟（三个样品需配制300 μL）。</li>
	<li>与1X BB孵育后，以7K离心2分钟收集细胞沉淀，并弃去上清液。向细胞沉淀中加入50 μL链霉亲和素-染料溶液，充分混匀，并在25°C下持续振荡（使用涡旋振荡器或温控混合仪）孵育12分钟。对于“无染料”对照组，仅加入50 μL 1X封闭缓冲液。在后续操作中，使用铝箔包裹管子以避光。</li>
	<li>用500 μL 0.1X SSCT缓冲液洗涤细胞一次，再用400 μL含0.1% Tween-20的1X PBS（PBST）洗涤一次。以7K离心2分钟收集细胞，弃去上清液。</li>
	<li>在初始链霉亲和素偶联物染色后，通过引入生物素化的抗链霉亲和素抗体结合至链霉亲和素-染料偶联物，然后再次使用链霉亲和素-染料进行染色，从而放大信号输出，提高每个杂交LNA探针的检测信号（图2）。</li>
	<li>向细胞中加入100 μL含1 μg/mL生物素化抗链霉亲和素抗体的1X PBS溶液，重悬细胞，并在25°C下孵育30分钟，期间偶尔混匀。以7K离心2分钟收集细胞，弃去上清液，并用400 μL 1X PBST洗涤两次。</li>
	<li>向细胞中加入50 μL浓度为2 μg/mL的链霉亲和素-染料溶液，充分混匀，并在25°C下持续振荡（使用涡旋振荡器或温控混合仪）孵育12分钟。对于“无染料”对照组，仅加入50 μL 1X封闭缓冲液。</li>
	<li>用500 μL 0.1X SSCT缓冲液洗涤细胞一次，再用400 μL 1X PBST洗涤一次。</li>
	<li>将细胞重悬于200 μL 1X PBST中，4°C保存直至进行流式细胞术分析。对于较小的细菌细胞，应将流速设为慢速以减小液流核心尺寸。此外，对于具有前向散射阈值截断功能的流式细胞仪，必须将阈值设为尽可能低，以确保检测到小型细菌细胞。</li>
	<li>检测DyLight 488时，流式细胞仪应配备488 nm激光器及FITC的标准发射滤光片。至少应采集2×104个事件。为适配配备不同激光器的流式细胞仪，本方案也可使用其他链霉亲和素偶联的荧光染料。</li>
</ol>
8. 代表性结果
有效固定和透化的细胞示例如 图3A 中的流式细胞术散点图所示。当采用上述透化条件时，细胞群体较小且均一，表明细胞聚集体较少。当使用较高浓度（5 mg/mL）的溶菌酶时，细胞更容易发生聚集，并表现出增高的前向散射值，提示存在较大的颗粒（图3B）。一次成功的LNA流式FISH实验的流式细胞术数据示例如 图4 所示。该直方图展示了目标小RNA的特异性检测结果以及三个阴性对照。其中，“无染料”阴性对照产生的荧光信号最低，其次为“无LNA”和“非表达sRNA”阴性对照。最后，使用sRNA特异性LNA探针的样品产生最强的荧光信号。一旦通过此方式验证了实验方法和LNA探针的有效性，便可进一步设计实验，用于监测sRNA信号随时间的变化，或在基因突变、不同培养条件等处理下的响应情况等。
<img alt="细菌流式细胞术示意图；展示了固定、杂交、染色过程。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1。"> 
图 1。 LNA 流式 FISH 实验检测细菌 sRNA 的整体流程示意图。
<img alt="使用生物素化LNA探针的核酸检测方法；示意图显示了依次结合的步骤。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2。 LNA流动FISH信号的染色与扩增。a）生物素化LNA探针的杂交。b）使用荧光DyLight 488链霉亲和素偶联物进行染色。c）生物素化抗链霉亲和素抗体与DyLight 488链霉亲和素结合。该抗体可通过其抗原结合位点与链霉亲和素结合，或通过其生物素残基被链霉亲和素结合。d）通过进一步使用荧光DyLight 488链霉亲和素偶联物染色实现信号扩增。
<img alt="流式细胞术点图显示侧向散射与前向散射数据分析及细胞群门控。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3。"> 
图 3。 流式细胞术点图显示 a) 1 mg/mL 溶菌酶、3 μg/mL 蛋白酶 K 透化处理和 b) 5 mg/mL 溶菌酶、3 μg/mL 蛋白酶 K 透化处理的前向散射与侧向散射结果。
<img alt="使用流式细胞术检测DyLight 488荧光强度的直方图，显示事件计数与荧光强度的关系。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4。"> 
图4。 LNA流动-FISH结果的直方图分析。每种样品产生的荧光信号由四条曲线表示：黑色——sRNA特异性LNA探针；红色——“非表达sRNA”阴性对照；蓝色——“无LNA”阴性对照；紫色——“无染料”阴性对照。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所介绍的LNA流动FISH方法用于检测一种来自革兰氏阴性海洋细菌Vibrio campbellii的小RNA（sRNA）表达，该sRNA的表达此前已通过基于微阵列的表达谱分析和反转录聚合酶链式反应确认16。迄今为止，我们已利用该方法监测了多种RNA的表达（例如反式编码sRNA、调控蛋白质活性的sRNA、核糖开关以及mRNA）。因此，我们确信该方法具有良好的适应性，可用于检测任何sRNA或mRNA靶标，并可针对任何细菌种类或细胞类型进行相应修改。若需将本方案应用于其他类型的细胞，最关键的可调节变量是通透化步骤。例如，在调整本文所述的通透化条件时，应测试溶菌酶和蛋白酶K浓度的变化。我们发现，将溶菌酶和蛋白酶K的用量加倍或增至三倍，会显著影响LNA流动FISH的结果。此外，在测试其他通透化条件时，应评估细胞是否发生聚集、细胞损失情况，以及可获得的最佳信噪比荧光信号。细胞聚集程度可通过显微镜观察和/或流式细胞术进行检测。在流式细胞术中，细胞聚集体在前向散射与侧向散射点图中表现为拖尾现象，而合适的通透化方法应尽可能减少这种拖尾效应。本方法也适用于多重sRNA检测，无需对所述方案进行重大修改，只需在杂交步骤中加入用其他半抗原（如地高辛）标记的额外LNA探针，随后使用抗地高辛抗体及荧光素偶联的二抗进行检测即可。目前，我们在此方法中遇到的唯一局限是其难以从低丰度表达的sRNA分子中产生足够强的信号，相关研究正在进行中，以确定该方法的检测阈值（即每个细胞内的绝对拷贝数）。
总体而言，LNA 流式 FISH 方法能够在高通量条件下在单细胞水平上检测细菌 sRNA 或 mRNA 的表达，从而揭示特定 sRNA 的存在情况、相对丰度及其在群体中表达水平的变异程度。

<table><tbody><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9932</td><td>（非 DEPC 处理）</td></tr><tr><td>32% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15714</td><td>无乙醇</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Acros Organics</td><td>327290010</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯 (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>保持干燥</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2879</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K (20 mg/mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9342</td><td>去离子，分装后冷冻</td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖，分子量 &amp;gt; 500,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td>将 60% 溶液分装并冷冻</td></tr><tr><td>Denhardt&amp;rsquo;s 溶液 50X 浓缩液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td>分装并冷冻</td></tr><tr><td>柠檬酸钠缓冲液 20X</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精 DNA（剪切）10 mg/mL</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9680</td><td>分装并冷冻</td></tr><tr><td>酵母 tRNA (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15401-011</td><td>分装并冷冻</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>5X &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; 杂交封闭液</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-1220</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 488 标记链霉亲和素</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5488-1</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗链霉亲和素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-0500</td><td>分装并冷冻</td></tr></tbody></table>

锁定核酸流式细胞术-荧光原位杂交（lna flow-fish）：一种用于细菌小rna检测的方法

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于在细胞环境中检测和定位特定核酸序列的强大技术。为了提高通量，FISH 可与流式细胞术（flow cytometry）结合，形成流式FISH（flow-FISH），从而实现对数千个单个细胞中靶向核酸序列的检测。因此，与基于裂解液或群体样本的核酸检测方法相比，flow-FISH 具有明显优势，因为每个细胞都被视为独立的观测单位，从而允许进行更强大的统计分析和方差分析。这些特性促使 FISH 和 flow-FISH 方法被广泛应用于多种不同领域，其有效性已在端粒长度测定1,2、细胞鉴定与基因表达分析3,4、感染细胞中病毒增殖的监测5以及细菌群落分析与计数6中得到成功验证。
传统上，FISH 和 flow-FISH 方法的特异性依赖于 DNA 寡核苷酸探针。然而近年来，使用核酸类似物替代 DNA 寡核苷酸探针作为 FISH 和 flow-FISH 探针，显著提高了两种技术的灵敏度和特异性，这主要归因于这些类似物与天然核酸结合时具有更高的熔解温度（Tm）7,8。锁核酸（Locked nucleic acid, LNA）探针是一类含有 LNA 核苷酸的核酸类似物，这些核苷酸被穿插在 DNA 或 RNA 序列中9,10。已有研究表明，LNA 探针与 flow-FISH 联用时优于传统的 DNA 探针7,11，并已成功用于检测真核生物的 mRNA12 以及哺乳动物细胞中的病毒 RNA5。
本文进一步拓展了这一能力，描述了一种LNA流动-荧光原位杂交（flow-FISH）方法，可实现对细菌细胞中RNA的特异性检测（图1）。具体而言，我们关注的是小非编码调控RNA（sRNA）的检测，近年来sRNA引起了广泛关注，因其已被发现作为关键调控元件参与多种重要的细胞过程13。然而，目前可用于研究sRNA的工具仍十分有限，而在细菌细胞中检测sRNA所面临的挑战，部分原因在于sRNA分子本身尺寸较小（通常为50–300个核苷酸长度）、丰度较低，以及在操作具有不同细胞膜结构的微小生物细胞时普遍存在技术困难。在本方法中，我们描述了能够保持细菌细胞结构完整的固定与通透化条件，使LNA探针得以有效穿透细胞，并结合信号放大步骤，从而实现对低丰度sRNA的特异性检测（图2）。

本文描述了一种新型高通量方法，该方法利用锁核酸探针和流式细胞术-荧光原位杂交技术，实现对单个细菌细胞中小RNA和mRNA表达的检测及相对定量。

锁定核酸流式细胞术-荧光原位杂交（LNA flow-FISH）：一种用于细菌小RNA检测的方法

荧光原位杂交（FISH）是一种强大的技术，用于在细胞内检测和定位特定的核酸序列……

本实验的总体目标是检测单个细菌细胞中细菌 RNA 的表达。首先设计一种在 5' 端带有生物素 TEG 修饰的锁核酸（LNA）探针来实现这一目标。随后对细菌细胞进行固定，用达西尔（dathyl）、过碳酸盐（percarbonate）或 dsy 处理，再进行透化处理，使 RNA 变性，并使 LNA 探针与目标 RNA 杂交。第三，对细胞进行洗涤、封闭和染色。最后，通过流式细胞术检测细胞的荧光信号。最终可评估随时间变化及在不同细胞群体中RNA表达水平的变化。该方法有助于解答关于单个细胞内RNA种类的相对存在及其丰度，以及在同质或异质细胞群体中这种表达变化程度的关键问题。尽管目前该方法主要用于监测细菌小RNA的表达，但理论上，它可适用于检测几乎所有细胞类型中的RNA。在设计LNA探针序列后，应使用blast分析以确保该探针仅特异性结合目标sRNA或mRNA。订购探针时，需在LNA寡核苷酸的5'端添加生物素TEG修饰。该生物素连接对于杂交后使用链霉亲和素-地高辛配对抗体进行染色是必需的。实验中应包含三种阴性对照：其一为A，即无LNA对照，在杂交过程中不加入LNA探针。第二步，设置无探针对照，其中LNA探针与目标sRNA发生杂交，但由于缺乏荧光染料，杂交事件无法被检测。第三步，设置非表达sRNA或mRNA对照，使用靶向不存在或不表达的sRNA的LNA探针，以监测非特异性杂交。首先，收集1×10⁸个目标细菌细胞，并将其转移至1.5毫升微量离心管中。然后在2300×g离心5分钟，使细菌细胞形成沉淀。用移液器吸除上清液，不要倾倒。接着，将沉淀重悬于400 µL PBS中，加入400 µL PFA乙酸-PBS固定液，并充分混匀细胞。然后在25 °C下孵育10分钟。再次离心细胞后，静置5分钟，然后涡旋振荡一次。此次离心条件为4,500 × g，离心2分钟。用400 µL PBS将沉淀洗涤两次。最后，将沉淀重悬于400 µL的PBS中，并将已固定的细胞在4°C下保存，最长可保存七天。首先，向每份固定的细菌细胞样品中加入400 µL新配制的0.1% DSY溶液，然后通过移液充分混匀细胞悬液。将该混合物在25摄氏度下孵育12分钟，然后用400微升PBS洗涤细胞两次，再向细胞中加入800微升新鲜配制的溶菌酶溶液。通过涡旋充分混匀细胞与溶菌酶溶液，并在25摄氏度下孵育30分钟，期间偶尔混匀。离心沉淀细胞后，向细胞沉淀中加入800微升新鲜配制的蛋白酶K溶液，并用移液器充分吹打重悬细胞溶液以彻底混匀。将细胞在25摄氏度孵育15分钟，在孵育中途涡旋振荡；孵育结束后离心并用400微升PBS洗涤细胞，再将细胞重悬于另外400微升PBS中，取100微升悬液分别加入四个独立的1.5毫升微量离心管中，随后离心收集细胞并弃去上清液。接着将四个样品分别加入100微升杂交缓冲液，在60摄氏度下孵育60分钟。杂交完成后，向杂交混合物中加入1毫升SSC加Tween 20（即SSCT），以帮助细胞从黏稠的杂交溶液中释放出来。离心收集细胞后，向沉淀中加入200微升甲酰胺SSCT溶液，充分混匀。然后将样品置于65摄氏度的加热块中孵育30分钟。接着向混合物中加入1毫升SSCT溶液，再次离心收集细胞后，将细胞重悬于500微升SSCT溶液中，并将细胞悬液在加热块上孵育40分钟。离心后，向杂交细胞沉淀中加入200微升封闭缓冲液，然后在25摄氏度孵育30分钟。再次离心后，向沉淀中加入50微升去除了生物素和染料的溶液，并充分混匀以制备无染料对照。再加入50微升封闭缓冲液。将所有样品在25摄氏度下继续孵育12分钟，使用恒温混匀仪持续混匀，并用铝箔保护离心管避光。接着，用500微升SSCT缓冲液洗涤细胞一次，再用400微升含吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS + tween 20 或 PBST）洗涤一次。去除上清液后，加入100微升生物素化抗体、strippin及PBS，在25摄氏度下孵育30分钟，期间偶尔混匀；该抗体将结合上一步中引入的strippin DI偶联物。然后，将细胞用400 µL PBST离心沉淀并洗涤两次后，向细胞中加入50 µL去标记的亲和素-染料溶液，充分混匀，进行第二次染色。此步骤可提高未加染料对照样本中每个杂交的LNA探针的信号输出。再次仅加入50 µL封闭缓冲液，然后将所有离心管置于恒温混匀仪中，在25 °C下持续混匀孵育12分钟。加入染料溶液孵育后，先用500微升SSCT缓冲液再次洗涤细胞，第二次洗涤使用400微升PBST缓冲液。将细胞沉淀重悬于200微升PBST缓冲液中，并在4摄氏度保存，直至进行流式细胞术分析。对于较小的细菌细胞，将流式细胞仪的流速设为慢速，以减小液流核心尺寸。此外，对于具有前向散射光阈值截断功能的流式细胞仪，应将截断阈值设为尽可能低，以确保检测到微小的细菌细胞。在此流式细胞术散点图中，展示了使用上述条件时固定和透化效果良好的细胞示例。在透化处理后，细胞群体较小且均一，表明细胞聚集体较少。然而，当使用较高浓度的溶菌酶时，细胞更容易发生聚集，并表现出增高的前向散射值，提示存在较大的颗粒，如本散点图所示。此处展示了一次成功的LNA流式FISH实验的流式细胞术数据示例。该直方图显示了对目标sRNA的特异性检测，以及三个阴性对照。紫色的无染料阴性对照产生的荧光信号最少，其次是蓝色的无LNA阴性对照和红色的非表达sRNA阴性对照。最后，使用针对SRNA的LNA特异性探针的样本在黑色背景下产生的荧光最强。一旦掌握，若操作正确，该技术可在约六小时内完成。此外，该技术提供的信息更多，且比逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）更具成本效益。按照此步骤，可使用其他HAPS标记额外的探针，并在杂交步骤中加入，以实现多重RNA检测。I.

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

锁核酸流式细胞仪，荧光原位杂交（LNA流FISH）：细菌小RNA检测方法

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。...

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

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