通过比较Cr51释放实验与xCELLigence系统确定人HER2/neu特异性CD8 T细胞的最佳细胞毒活性

以下实验的总体目标是通过比较基于阻抗的EXOGEN系统方法与铬释放实验，来确定细胞毒性T细胞的活性。第一步是利用fial从全血中分离外周血单个核细胞。接下来，将PBMC与肽抗原、人重组IL-2以及经辐照的PBMC一同加入到孔板中，以生成抗原特异性的CD8 T细胞。

在两种检测中，抗原特异性的CD8+ T细胞随后与肿瘤细胞共培养，以诱导肿瘤细胞死亡。通过阻抗法和铬释放实验均可获得结果显示肿瘤细胞的裂解百分比。与现有的铬释放实验等方法相比，该技术的主要优势在于基于阻抗的系统可采集实时数据，且所需细胞数量更少，无需进行任何标记。本实验方案中，正常健康HLA-A*02阳性供体的血液在遵循试剂盒制造商操作说明的条件下，可作为外周血单个核细胞（PBMC）的来源。

使用F型细胞分选PA plus试剂从血液中分离P BMCs。随后将约400万个P BMCs加入六孔板中，每孔加入2毫升培养基。每孔加入HLAA二聚体结合肽，使其终浓度为每毫升培养物10微克。

每隔一天更换培养基，以促进T细胞的刺激与扩增。加入含有重组人IL-2的新鲜培养基，使其终浓度为每毫升50单位。一周后，制备自体PBMC培养物，对细胞进行照射处理，并用相同的HLA肽段脉冲刺激两小时。

每毫升含10微克的双结合肽，通过向每个样本中加入一毫升经照射的自体外周血单个核细胞来重新刺激培养物。再过一周后，每隔一天继续添加补充了IL-2的新鲜培养基，并以相同方式第二次重新刺激培养物。培养再持续六天后，细胞即可用于后续实验。

将智能阻抗检测仪置于5%二氧化碳环境中，于37摄氏度平衡至少1小时，以准备使用。用0.25%胰蛋白酶消化并结合离心法收集75%融合度的人肿瘤细胞。使用血细胞计数板对肿瘤细胞进行计数，并将其重悬于RPMI培养基中。

肿瘤培养基浓度为每微升7,500个细胞。接下来，Excel代理软件设置带有孔板布局的页面。设置时间表页面，要求在40小时期间内每5分钟采集一次阻抗读数；在前18小时内，Xceligent系统仅采集肿瘤细胞的阻抗读数。

然后每孔加入 100 µL RPMI 肿瘤培养基。在未接种细胞的情况下，通过测量阻抗获取 EPLs 的背景读数。加入肿瘤细胞后，将培养板放入 thence 站点并开始采集读数。

肿瘤细胞将立即开始黏附到EPLs上。培养约18小时后，肿瘤细胞已附着于EPLs，并增殖至每孔15,000个肿瘤细胞。此时，通过轻柔刮取并振荡离心收集已准备好的T细胞。

将T细胞重悬于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，并使用血细胞计数板进行计数。确定细胞密度后，制备T细胞的两倍系列稀释液，使得当加入200微升T细胞悬液至肿瘤细胞时，最高浓度为每肿瘤细胞对应40个T细胞。系列稀释的最后一个梯度应达到每肿瘤细胞对应1.25个T细胞。

暂停 EXOGEN 仪器，使用移液器取出 EPL。吸除孔中的培养基，然后使用稀释系列中的所有浓度加入 200 微升 T 细胞作为阴性对照。使用纯培养基，将 EPL 放回仪器，继续运行程序直至实验结束。

标准化结果。在使用铬51及铬51标记的靶细胞时，务必遵循机构的辐射安全规程，并使用屏蔽装置以减少辐射暴露。首先，将肿瘤细胞以每毫升100万个细胞的浓度与每毫升10微升的新鲜铬51共同孵育，脉冲2小时。

接下来，用 10 毫升含 10% FBS 的 RPMI 培养基洗涤肿瘤细胞，离心后重悬于相同培养基中，调整细胞浓度至每毫升 100 万个细胞。然后向 96 孔圆底培养板中每孔加入 100,000 个肿瘤细胞，用于计算自发释放率。

在其中六个孔中不添加任何物质，而在另外六个孔中加入100微升Triton X-100以裂解细胞，从而计算最大释放量。使用先前配制的系列稀释液将T细胞加入到培养板中。

将培养板孵育5小时后，从每个孔中收集50 µL上清液样品，在室温下于通风橱中过夜干燥培养板后，将样品加样至luma板中。使用γ计数器检测T细胞和SKBR3癌细胞的每分钟计数（CPM）。癌细胞在X智能板上进行培养，并测定细胞指数，该指数反映的是培养板的阻抗，因为T细胞增殖无需贴壁。

在40小时的培养过程中，它们对阻抗的影响可忽略不计。单独培养的癌细胞显示出阻抗测量值逐渐升高。然而，在18小时加入T细胞后，这一趋势被打破。

该事件在加入T细胞后需要进行软件归一化处理，并将在下一个实验中进一步研究。当SK BR 3细胞与不同浓度的T细胞共培养时，阻抗的降低表现出明显的剂量依赖性；数据在三次重复实验中每五分钟采集一次，直至10小时时间点。在T细胞浓度范围内，细胞指数符合二阶多项式变化趋势，表明Exogen系统能够实时监测CD8+ T细胞介导的SK B 3肿瘤细胞死亡过程，即通过细胞指数下降来判断T细胞是否特异性地引起SK BR 3细胞阻抗降低。

将SK KBR三个细胞与HLA A2阳性的流感特异性T细胞进行共培养，这些T细胞不识别HER2/neu。结果显示，这些细胞的裂解活性显著较低。为了进一步确定HER2/neu特异性T细胞是否以抗原特异性方式杀伤靶细胞，我们在共培养体系中加入了抗Fas配体抗体。然而，该抗体并未降低HER2/neu P360-9特异性T细胞的裂解活性。

然而，对于通过抗 CD3 和 CD28 磁珠非特异性激活的 T 细胞，该抗体确实抑制了裂解作用，以确定杀伤是否以 HLA I 类分子依赖的方式发生。在共培养体系中分别加入抗 HLA I 类抗体或同型对照抗体。结果有力地支持了这一假设。

随后将T细胞以1比5的比例与其它癌细胞共培养。HLA-A2阴性的肿瘤细胞系BT-20被用作阴性对照。结果显示，该方法适用于多种靶向贴壁肿瘤细胞。

将HER2新P3609特异性T细胞与经铬51标记的靶细胞进行共培养，随后进行CRA分析。该检测方法在分析一致性方面表现出更高的敏感性。批内变异系数通过计算每个细胞比例（1:40至1:5）下的变异百分比得出。

在最低细胞比例下，该值低于15%。然而，变异系数（CV）较高或不可预测。此外，还检测了不同P3609特异性T细胞系与SK-BR-3细胞共培养时对T细胞溶解作用的变异性。

数据相隔30天生成。实验均设三个重复，结果非常相似。观看本视频后，您应能充分理解如何利用基于阻抗的方法，通过抗原特异性的CD8 T细胞和肿瘤细胞来测定细胞毒性T细胞的活性。