Name: 表面等离子体共振检测到宿主细胞质的毒素易位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解表面等离子体共振技术如何检测和定量宿主细胞质中的毒素易位。该方法利用SPR传感器实时监测毒素进入细胞质的动力学过程，为毒素生物学研究和药物开发提供重要数据支持。

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本工作由NIH基金R01 AI073783资助，项目负责人为K. Teter。我们感谢Shane Massey博士在亚细胞分级分离方案开发过程中提供的帮助，以及Helen Burress对稿件的审阅意见。

1. 原生质体酶的制备
<ol>
	<li>向一个微量离心管中加入 500 μL 的 100% 乙醇，并将其置于 80 °C 的加热块中孵育 10 分钟。</li>
	<li>将 2.5 mg 的皂苷素溶解于 250 μL 预热的乙醇中，制备成 1% 的皂苷素储备液。</li>
	<li>为配制 0.04% 的皂苷素工作液，取 40 μL 皂苷素储备液加入 960 μL 的 HCN 缓冲液（50 mM Hepes pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM CaCl2、10 mM N-乙基马来酰亚胺和蛋白酶抑制剂混合物）中。</li>
</ol>
2. 细胞中毒与通透化
我们的转位实验可应用于多种毒素和细胞系。以下，我们提供了霍乱毒素（CT）检测的详细方案。图1给出了该实验流程的概览。
<ol>
	<li>在6孔板中接种HeLa细胞，每孔加入1 mL添加10%胎牛血清和抗生素-抗真菌剂的DMEM培养基，于37 °C过夜培养后使每孔细胞数达到1×106个。为获得足够量的胞质毒素以实现可重复检测，每种实验条件需设置三个重复孔。</li>
	<li>过夜培养后，弃去原培养基，每孔加入1 mL含100 ng/mL神经节苷脂GM1的DMEM培养基。此举可增加霍乱毒素（CT）的结合位点，因为GM1作为CT的受体，可插入暴露于GM1溶液的细胞质膜中。</li>
	<li>在37 °C孵育1小时后，移除含GM1的培养基，用DMEM洗涤细胞两次，然后在含1 μg/mL CT的1 mL DMEM中将细胞置于4 °C孵育30分钟。</li>
	<li>移除含毒素的培养基，用DMEM洗涤细胞两次，随后在37 °C下用1 mL DMEM继续培养细胞，孵育时间为所需的时间间隔。</li>
	<li>每个追踪时间点结束后，用PBS洗涤细胞，每孔加入250 μL含0.5 mM EDTA的PBS溶液。室温静置10分钟后，使用P1000移液器剧烈吹打使细胞脱离培养板。收集一个孔的细胞后，将其与同组条件下的第二、第三孔细胞合并。也可使用细胞刮刀收集细胞。</li>
	<li>将三个重复孔合并的细胞悬液（总体积750 μL）转移至一个微量离心管中，在台式微量离心机中以5,000 × g离心5分钟。所有实验条件下的细胞沉淀应大小相近。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 μL 0.04%的皂苷工作液中，冰上放置10分钟。</li>
	<li>将经皂苷透化的细胞在台式微量离心机中以16,000 × g离心10分钟。将含胞质成分的上清液转移至新的微量离心管中，保留含细胞器的沉淀部分。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>含细胞质的上清组分用 HCN 缓冲液稀释至终体积为 1 mL。样品体积至少需 1 mL，以确保进样前将 500 μL 样品环中的空气排尽。</li>
	<li>含细胞器的沉淀组分在含有 1% Triton X-100 的 1 mL HCN 缓冲液中重新悬浮。添加去垢剂是释放膜包被毒素库所必需的。</li>
	<li>在 HCN 缓冲液中配制浓度分别为 100、10、1 和 0.1 ng/mL 的毒素标准品。</li>
	<li>为验证组分分离程序的可靠性，需平行制备细胞质组分和细胞器组分用于对照实验。按照第 2 节所述方法制备的组分，分别重悬于 20 μL 4x 上样缓冲液（细胞质组分）或 120 μL 1x 上样缓冲液（细胞器组分）。取等体积的各组分进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，并通过蛋白质印迹分析检测，以证明细胞质蛋白分布于上清组分中，而可溶性内质网驻留蛋白分布于沉淀组分中16-19。</li>
</ol>
4. SPR 芯片制备
<ol>
	<li>Reichert SR7000 SPR 折光仪用于 SPR 实验。</li>
	<li>将带有自组装单分子层的镀金玻璃片放入 SPR 仪器中。为激活传感器片，以 41 μL/min 的流速在玻璃片上灌注 0.4 M EDC 与 0.1 M NHS 的 1:1 (v:v) 混合溶液，持续 10 分钟。后续所有灌注步骤均使用相同的流速。</li>
	<li>使用含 0.05% Tween 20 的 PBS（PBST）清洗芯片 5 分钟，以去除 EDC:NHS 激活缓冲液。此时芯片表面因 EDC:NHS 溶液去封闭而形成具有反应活性的酰胺键连接臂。</li>
	<li>将抗 CTA 抗体以 1:20,000 的稀释比例溶于 20 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中，灌注至已激活的传感器片表面，持续 15 分钟。由于 pH 变化，折射率单位（RIU）会出现初始下降。随后，随着抗体被传感器片表面的酰胺反应性连接臂捕获，RIU 将逐渐上升。</li>
	<li>用 PBST 洗涤 5 分钟，去除传感器片上未结合的抗体。被捕获抗体所产生的 RIU 信号将趋于平稳并稳定下来，形成新的基线信号。</li>
	<li>以 1 M 乙醇胺（pH 8.5）溶液灌注传感器片 5 分钟，以封闭并失活传感器片上残留的未结合连接臂。</li>
</ol>
5. 样品的 SPR 分析
<ol>
	<li>为建立基线读数，用 PBST 对抗体包被的传感器灌注 5 分钟。</li>
	<li>将实验样品或毒素标准品溶液灌注过传感器，持续 300 秒。随后从缓冲液中去除配体，并用 PBST 继续灌注传感器 200 秒。</li>
	<li>每次灌注后，使用 pH 5.0 的 PBST 对传感器进行 100 秒的清洗，以去除传感器上结合的毒素。此步骤可使信号恢复至初始基线水平，从而允许在同一传感器上处理下一个样品。</li>
	<li>在加载新样品前，推动少量空气通过样品环路，以排出前一样品残留的液体。采用 5.2–5.4 节所述步骤，我们已在同一张芯片上连续运行多达 12 个样品，且基线信号未出现明显衰减。</li>
	<li>数据分析使用 Scrubber 2 软件完成，图形制作则使用 Igor 软件。</li>
</ol>
6. 典型结果
百日咳毒素（PT）是一种AB型毒素，可从细胞表面转运至内质网，随后其A亚单位（PTS1）进入细胞质3, 12。如图2所示，我们基于表面等离子共振（SPR）的转位检测方法能够检测到中毒CHO细胞细胞质中的PTS1。未中毒细胞的细胞质组分未产生任何信号，这证实抗-PTS1抗体不会与宿主细胞质中的任何组分发生交叉反应。在存在布雷菲德菌素A（BfA）的情况下中毒的细胞，其细胞质组分也未能产生阳性信号。BfA可阻止毒素向内质网转位位点的运输6-8, 12, 20-25，从而抑制A亚单位向细胞质的递送。每次运行结束后，传感器芯片表面结合的毒素均被剥离。这使得多个样品可在同一传感器芯片上进行检测，从而实现了不同实验条件下所得结果的直接比较。
CT 是另一种 AB 型、可进入内质网转运的毒素4。在图 3A 中，可在 CT 处理的 HeLa 细胞的胞质组分中检测到 CTA1。这表明我们的方法适用于多种细胞类型，并可应用于任何已有抗 A 链抗体的毒素。当将 CT 处理细胞的胞质组分流经涂覆有抗 CTB 抗体的 SPR 传感器时，未检测到信号（图 3B），从而证明只有 CTA1 亚基而非负责细胞结合的 CTB 五聚体进入胞质。图 3C 显示，与较弱的胞质组分信号相比，细胞器组分的信号超出量程。这与已知的 CT 向内质网转运位点运输效率较低的现象一致6,7，后者进而限制了能够到达胞质的毒素量。此外，细胞器组分中既包含完整的 CT 全毒素，也包含定位于内质网的 CTA1，因此细胞器组分的 SPR 信号因全毒素相关 CTB 五聚体的额外质量而被放大。因此，将细胞器组分与胞质组分的数据绘制在同一张传感器图上并不合理。
我们的检测方法可监测易位至细胞质的毒素随时间推移而积累的过程（图4）。将细胞暴露于CT并在4 °C条件下孵育，该温度允许毒素结合质膜，但阻止与细胞结合的毒素发生内化。在去除未结合的毒素后，将细胞升温至37 °C。在此温度下，毒素可转运至内质网，同时A亚基可从内质网转位至细胞质。升温至37 °C后15分钟内未检测到细胞质中的毒素，这反映了以下过程所需的滞后时间：（i）全毒素向内质网的运输；（ii）内质网中A/B亚基的解离；以及（iii）A链向细胞质的输出。在37 °C孵育30分钟后可检测到少量位于细胞质的毒素，而在45分钟和60分钟的追踪孵育后，检测到的细胞质毒素量逐步增加。在5小时的追踪孵育后检测到更高水平的细胞质毒素17，表明与细胞结合的毒素持续且长期地递送至宿主细胞质中。
我们的检测方法还可检测毒素向细胞质转位的抑制作用（图5）。用10%二甲基亚砜（DMSO）处理的细胞中，细胞质内的CTA1水平较低，相比之下未处理的对照细胞则较高；DMSO是一种化学伴侣分子，可防止分离的CTA1亚基发生热变性（T. Banerjee 和 K. Teter，未发表观察结果）。毒素A链的去折叠是其转位至细胞质的先决条件16-18，因此DMSO诱导的CTA1稳定性阻碍了其从内质网向细胞质的转移。
表面等离子共振（SPR）实验测得的结合速率常数（ka）与灌注缓冲液中配体的浓度成正比14, 15, 26。因此，可通过绘制已知浓度毒素标准品的 ka 值随毒素浓度变化的标准曲线，来确定细胞质中毒素的浓度。该方法被用于定量分析图5中DMSO诱导的毒素转位阻断效应：利用已知浓度毒素建立的标准曲线，计算得出未处理细胞的细胞质CTA1浓度为0.3 ng/mL，DMSO处理细胞的CTA1浓度为0.1 ng/mL（图6）。因此，DMSO对CTA1去折叠的抑制作用导致CTA1从内质网向细胞质的转位减少了3倍。
<img alt="生物传感器操作示意图，展示蛋白质结合的逐步过程及SPR图谱分析。" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验流程概述。（A）将细胞与AB毒素在4 °C下孵育，该温度允许毒素结合细胞表面，但阻止其内吞作用。毒素的A亚基和B亚基分别用红色和蓝色圆圈表示。（B）去除未结合的毒素后，将细胞升温至37 °C，以促进全毒素的内吞作用及其逆行转运至内质网（ER）。全毒素在ER中解离，释放出的A链可通过ER膜上的蛋白质转运通道进入细胞质。（C）用皂苷（digitonin）处理细胞，选择性地通透化细胞质膜。（D）通过离心将细胞分为细胞质组分和细胞器组分。细胞质内容物经digitonin形成的孔隙被挤出，存在于上清液中；完整且具有膜结构的细胞器则存在于沉淀组分中。（E）为检测已转位至宿主细胞质中的毒素A链，将上清液组分流经固定有抗A链抗体的SPR传感器芯片表面。
<img alt="PTS1 蛋白相互作用图；传感器图分析；浓度依赖性响应曲线。" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 检测 PTS1 向宿主细胞胞质中的转位。CHO 细胞在 4 °C 条件下用 1 μg/mL 的 PT 脉冲标记 30 分钟。随后，细胞在 37 °C 下于不含毒素且未添加其他成分（中毒）或含 5 μg BfA/mL（+BfA 中毒）的培养基中继续培养 3 小时。通过皂苷对质膜进行透化处理，将细胞提取物分为细胞器组分和胞质组分。使用包被了抗-PTS1 抗体的 SPR 传感器检测未经处理或经 BfA 处理细胞中的胞质 PTS1 池。将 PTS1 标准品流经传感器作为阳性对照，而未中毒细胞的胞质组分则作为阴性对照流经传感器芯片。每次运行结束后，从传感器芯片上去除已结合的样品。
<img alt="显示随时间变化的细胞质和细胞器组分中蛋白质相互作用的图表；实验结果。" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. CTA1 转位至宿主细胞质的检测。HeLa 细胞在 4 °C 条件下用 1 μg/mL 的 CT 进行脉冲标记，随后在不含毒素且无添加物（中毒）或含 5 μg BfA/mL（+BfA 中毒）的培养基中于 37 °C 追踪培养 2 小时。通过皂苷对质膜进行透化处理，将细胞提取物分离为细胞器组分和细胞质组分。（A）将细胞质组分灌注至 SPR 传感器表面，该传感器涂覆有抗 CTA 抗体。已知量的 CTA 用作阳性对照，未中毒细胞的细胞质用作阴性对照。（B）将未添加 BfA 条件下中毒细胞的细胞质组分灌注至涂覆有抗 CTB 抗体的 SPR 传感器表面。纯化的 CTB 五聚体作为阳性对照灌注至芯片表面。（C）细胞器组分在灌注至涂覆有抗 CTA 抗体的 SPR 传感器前，用 1% Triton X-100 溶解。为便于比较，来自同一细胞提取物的细胞质组分（最终体积 1 mL）以及 CTA 标准品也同时灌注至传感器表面。所有图谱中，每次运行结束后均将结合的样品从传感器表面洗脱去除。
<img alt="显示浓度和持续时间效应的微RIU随时间变化的色谱图。" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. CTA1进入细胞质的动力学。HeLa细胞在4 °C下用1 μg/mL的CT脉冲标记后，在无毒素培养基中于37 °C分别追逐15、30、45或60分钟。为检测已转位的毒素部分，将经皂苷（digitonin）透化的细胞的细胞质组分流经固定有抗CTA抗体的SPR传感器。同时将CTA标准品也流经该传感器。每次运行结束后，从传感器芯片上剥离已结合的样品。
<img alt="CTA 结合反应图，微折射率单位 vs. 时间；中毒与未中毒样本分析。" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. DMSO 对 CTA1 转位的抑制作用。HeLa 细胞在 4 °C 条件下用 1 μg/mL 的 CT 脉冲标记后，在不含毒素的培养基中于 37 °C 追踪孵育 2 小时，培养基中不添加任何成分（中毒）或添加 10% DMSO（+DMSO 中毒）。为检测毒素的胞质转位量，将经皂苷透化的细胞所得的胞质组分流经 SPR 传感器，该传感器表面包被有抗 CTA 抗体。CTA 标准品（100、10、1 和 0.1 ng/mL）流经传感器作为阳性对照；出于比例显示目的，图中仅展示 1 和 0.1 ng/mL 标准品。未中毒细胞的胞质组分作为阴性对照。每次检测结束后，从传感器载片上剥离已结合的样本。
<img alt="CTA浓度与结合速率（ka）的相关性图；带趋势线的数据点。" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 胞质CTA1浓度的计算。将图5中CTA标准品的ka值对其毒素浓度作图，得到标准曲线。利用该标准曲线，根据图5中实验样品的ka值，确定未经处理及DMSO处理细胞中胞质CTA1的浓度。毒素标准品以实心圆表示；未处理的胞质以空心方块表示；DMSO处理的胞质以空心圆表示。数据展示两次独立实验的平均值±范围。

未声明任何利益冲突。

与现有方法的比较
基于 SPR 的转位检测方法是一种快速、灵敏且定量的检测毒素进入宿主细胞胞质的方法。该技术无需对毒素进行放射性标记或其他修饰，且适用于任何可获得抗毒素 A 链抗体的毒素。目前监测毒素进入胞质的方法依赖于亚细胞分级分离方案，将细胞裂解物分离为胞质和膜组分11, 23, 27, 28。这些方法采用 Western 印迹或放射性标记来检测胞质中的毒素。前者最多仅为半定量，且灵敏度相对较低。即使是放射性标记方法，由于到达胞质的毒素水平极低，也可能需要数周时间才能获得结果。虽然使用放射性标记毒素的定量分析可确定进入胞质的细胞相关毒素的相对百分比，但该方法无法直接确定胞质中毒素分子的确切数量。因此，将 SPR 检测毒素的灵敏度与放射性标记检测进行比较存在困难，因为 SPR 可以计算胞质毒素的数量，而放射性标记则不能。
其他易位检测方法绕过了上游的毒素运输步骤，利用基于质粒的表达系统或体外转录/翻译系统，直接将毒素A链递送至内质网29-38。对于这两种方法，N端信号序列均可引导A...

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Acros Organics</td><td>61509-0010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>神经节苷脂 GM1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7641</td><td></td></tr><tr><td>CTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2398</td><td></td></tr><tr><td>PTS1</td><td>List</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22981</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td>Medicago</td><td>09-8903-100</td><td></td></tr><tr><td>抗CTA抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-80747</td><td></td></tr><tr><td>抗CTB抗体</td><td>Calbiochem</td><td>227040</td><td></td></tr><tr><td>抗PTS1抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-57639</td><td></td></tr><tr><td>折光仪</td><td>Reichert</td><td>SR7000, SR7000DC</td><td></td></tr><tr><td>SPR传感器芯片</td><td>Reichert</td><td>13206060</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>780200C</td><td></td></tr></tbody></table>

通过表面等离子共振检测毒素向宿主细胞胞质的转位

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB 毒素由具有酶活性的 A 亚基和负责细胞结合的 B 亚基组成1。这些毒素被分泌到细胞外环境中，但其作用靶点位于真核细胞的胞质溶胶内。某些 AB 毒素通过囊泡载体从细胞表面转运至内质网（ER），然后进入胞质溶胶2-4。在内质网中，催化性的 A 链从毒素其余部分解离，并经由一种蛋白质转运通道进入胞质溶胶以作用于其靶标5。由于毒素向内质网的转运过程效率极低，转位至胞质溶胶的 A 链难以被检测到：大多数内吞的毒素被定向转运至溶酶体进行降解，仅有少量结合于细胞表面的毒素能够到达高尔基体和内质网6-12。

为了监测毒素从内质网向培养细胞胞质溶胶的转位过程，我们将亚细胞分级分离方案与高灵敏度的表面等离子体共振（SPR）检测方法相结合13-15。用皂苷选择性地通透化毒素处理细胞的质膜，从而收集胞质溶胶组分，随后将其流经涂有抗毒素A链抗体的SPR传感器。该抗体包被的传感器可捕获并检测皮克每毫升（pg/mL）量级的胞质毒素。利用该方案，可追踪毒素进入胞质溶胶的动力学过程，并表征对转位事件的抑制效应。通过已知浓度A链标准品在传感器上流经后生成的标准曲线，还可计算胞质溶胶中毒素的浓度。本方法是一种快速、灵敏且定量的检测系统，无需对目标毒素进行放射性标记或其他修饰。

在本报告中，我们描述了如何利用表面等离子共振技术检测毒素进入宿主细胞胞质的过程。这种高灵敏度的方法可提供关于胞质内毒素含量的定量数据，并可应用于多种毒素的研究。

AB毒素由具有酶活性的A亚基和负责细胞结合的B亚基组成1。这些毒素被分泌到细胞外环境中，但其作用靶点位于……

本实验的总体目标是检测并定量进入细胞质的毒素量。为实现这一目的，首先将毒素在 4 摄氏度条件下结合至宿主细胞表面。随后去除未结合的毒素，并将细胞升温至 37 摄氏度，促使毒素进入内膜系统，并进一步转运至宿主细胞质。之后使用 digitonin 选择性地对细胞质膜进行通透处理，以实现细胞渗透。采用差速离心法作为最后一步，将细胞提取物分离为膜组分和胞质组分。通过将胞质组分灌注到包被抗毒素抗体的表面等离子共振（SPR）传感器上，利用SPR技术检测并定量毒素进入胞质的过程。该方法将有助于解答毒素生物学领域中的关键问题，例如毒素进入胞质的效率与动力学特征、进入胞质的毒素量，以及药物对毒素向胞质转运的潜在抑制作用。在本方案开始之前，按照书面方案所述，经hela细胞过夜培养后，制备用于细胞中毒实验的hela细胞。将培养基更换为含有100纳克/毫升神经节苷脂GM1的1毫升DMEM，于37摄氏度孵育1小时。此步骤可增加霍乱毒素结合位点的数量。由于GM1是毒素的受体，其会插入暴露于GM1溶液的细胞的质膜中。孵育一小时后，吸出含培养基的 GM，并用 DMEM 洗涤细胞两次。然后加入 1 毫升含 1 微克/毫升霍乱毒素的 DMEM，将细胞置于 4°C 环境中 30 分钟。吸出含毒素的培养基，并用 DMEM 洗涤细胞两次。然后将细胞在 37 摄氏度下，用 1 毫升 DMEM 培养基孵育所需时间。每个追踪时段结束时，用 PBS 洗涤细胞，随后每孔加入 250 微升含 0.5 毫摩尔 EDTA 的 PBS 溶液进行孵育。在冰上孵育 10 分钟后，使用 P1000 移液器剧烈吹打，从六孔板中收集细胞。收集完一个孔的细胞后，将其与同一条件下的第二和第三个孔的细胞合并。接着，将来自这三个重复孔的合并细胞悬液转移至一个微型离心管中。然后，将该微型离心管放入台式微型离心机中离心五分钟。在所有条件下，应获得大小大致相同的细胞沉淀，离心力为 5,000 ×g。弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于 100 µL 预先配制并预冷的 0.04% 洋地黄毒苷工作溶液中。将细胞悬液置于冰上 10 分钟，使用台式微量离心机以 16,000 ×g 离心 10 分钟，沉淀洋地黄毒苷及通透化细胞。将含有上清液的细胞质部分转移至新的微量离心管中，并保留含有细胞器的沉淀部分。SPR 毒素标准品用 HCN 缓冲液配制，浓度分别为 100、10、1 和 0.1 纳克/毫升；样品通过将含有上清液的细胞质部分用 HCN 缓冲液稀释至 1 毫升的终体积来制备。样品体积至少需 1 毫升，以确保在进样前将 500 微升样品环中的空气完全排出；含有细胞器的沉淀部分用 1 毫升含 1% Triton X-100 的 HCN 缓冲液重悬。添加去垢剂对于释放被膜包裹的毒素池是必要的。同时，为验证分离步骤的可靠性，应平行制备细胞质组分和细胞器L组分作为对照实验；将细胞质组分重悬于20微升4×上样缓冲液中，将细胞器L组分重悬于120微升1×上样缓冲液中，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组分等体积样品，并采用Western印迹分析，以证明细胞质蛋白分布于上清组分，而可溶性内质网相关蛋白则分布于沉淀组分。在准备SPR芯片时，首先将带有自组装单分子层的镀金玻璃芯片置入SPR仪器中。通过以每分钟41微升的流速在载玻片上灌注E-D-C-N-H-S溶液10分钟来激活传感器载玻片。所有后续灌注步骤均使用相同的流速。用含有0.05% Tween 20的PBS洗涤5分钟，以去除E-D-C-N-H-S激活缓冲液。由于被 E-D-C-N-H-S 溶液脱保护，该板现在含有具有反应活性的 MI 连接臂。接下来，将抗 CTA 抗体以 1:20,000 的稀释比例溶于 20 毫摩尔的醋酸钠溶液中，对已活化的传感器载玻片进行孵育，持续 15 分钟。由于 pH 值变化，折射率单位（简称 RIU）将首先出现下降。随后，由于抗体被酰胺反应性连接臂捕获，折射率单位（RIU）将随之上升。在传感器载玻片上，使用 PBST 缓冲液清洗五分钟，以去除未结合的抗体。被捕获的抗体所产生的 RIU 信号将趋于平稳并稳定下来，形成一个新的基线信号。在芯片制备的最后一步，将1摩尔乙醇胺以灌注方式作用于传感器芯片5分钟。此步骤可封闭并使传感器芯片上任何未结合的连接分子失活。随后，以PBST缓冲液灌注抗体包被的传感器芯片5分钟，RIU信号将上升并建立基线读数。然后将实验样品或毒素标准品在传感器上灌注 300 秒。从缓冲液中去除配体，并用 PBST 在传感器上灌注 200 秒。任何仍结合在传感器上的毒素通过 pH 5.0 的 PBST 进行第 102 次洗涤去除。这将使信号恢复至初始基线读数，从而允许在同一传感器上处理下一个样品。在加载新样品之前，推动少量空气通过样品环路，以排出前一样品的任何残留液体。采集完成后。数据可使用scrubber two软件进行分析，图形制备可使用Igor软件。百日咳毒素是一种AB型毒素，在其A链进入细胞质之前，会从细胞表面转运至内质网。PTs one进入细胞质。基于 SPR 的转位检测法能够检测到中毒的 CHO 细胞胞质中的 PTs。未中毒细胞的胞质未产生任何信号，这证实了抗 PTs 的特异性。该抗体不与宿主胞质中的任何组分发生交叉反应。在存在 felden 的情况下，经毒素处理的细胞所获得的细胞质组分同样未能产生阳性信号。BFA 可阻止毒素向内质网（ER）易位位点的转运，从而抑制 H 链向细胞质的递送。Chole toin 是另一种 AB 型内质网易位毒素。在霍乱毒素处理的Hela细胞的胞质组分中检测到了CTA1，这表明该方法适用于多种细胞类型，并可应用于任何具有可用抗链抗体的毒素。当用霍乱毒素处理细胞的胞质组分流过涂有抗CTB抗体的SPR传感器时，未检测到信号，从而证明与CTA1亚基不同，负责细胞结合的CTB五聚体不会进入胞质。在涂有抗CTA抗体的SPR传感器上发生大量结合后，细胞器组分的信号相比细胞质组分的较弱信号超出量程。这与已知的CT向内质网转运位点运输效率低下相符，从而限制了毒素到达细胞质的量。还可以监测转位至细胞质的毒素随时间的累积情况。在细胞于4摄氏度暴露于CT后，升温至37摄氏度15分钟时，细胞质中未检测到毒素。在37摄氏度下孵育30分钟后，检测到少量细胞质毒素，而在45分钟和60分钟的追踪间隔后，检测到的细胞质毒素量逐渐增多。这表明与细胞相关的毒素持续长期递送至宿主细胞质中。该检测方法还可检测毒素向细胞质转位的抑制作用：用10% DMSO处理的细胞与未处理的中毒对照细胞相比，表现出较低水平的类似细胞质的CT A1片段，提示毒素未发生解折叠。一条完整的链是易位到胞质溶胶的先决条件，因此DMSO诱导的CT A链稳定化相应地阻止了其从内质网向胞质溶胶的移动。为了定量DMSO诱导的毒素易位阻断效应，采用由已知毒素浓度生成的标准曲线，计算出未处理细胞的胞质溶胶中cta一浓度为每毫升0.3纳克，DMSO处理细胞中为每毫升0.1纳克。DMSO对CT A一去折叠的抑制，从而导致CTA一从内质网向胞质溶胶易位减少了三倍。 通过该实验步骤，我们将能够采用其他技术，例如中毒测定法，以建立细胞质中毒素含量与毒素活性之间的直接关联。

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免疫学与感染

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