通过表面等离子共振检测毒素向宿主细胞胞质的转位

本实验的总体目标是检测并定量进入细胞质的毒素量。为实现这一目的，首先将毒素在 4 摄氏度条件下结合至宿主细胞表面。随后去除未结合的毒素，并将细胞升温至 37 摄氏度，促使毒素进入内膜系统，并进一步转运至宿主细胞质。之后使用 digitonin 选择性地对细胞质膜进行通透处理，以实现细胞渗透。

采用差速离心法作为最后一步，将细胞提取物分离为膜组分和胞质组分。通过将胞质组分灌注到包被抗毒素抗体的表面等离子共振（SPR）传感器上，利用SPR技术检测并定量毒素进入胞质的过程。该方法将有助于解答毒素生物学领域中的关键问题，例如毒素进入胞质的效率与动力学特征、进入胞质的毒素量，以及药物对毒素向胞质转运的潜在抑制作用。在本方案开始之前，按照书面方案所述，经hela细胞过夜培养后，制备用于细胞中毒实验的hela细胞。

将培养基更换为含有100纳克/毫升神经节苷脂GM1的1毫升DMEM，于37摄氏度孵育1小时。此步骤可增加霍乱毒素结合位点的数量。由于GM1是毒素的受体，其会插入暴露于GM1溶液的细胞的质膜中。

孵育一小时后，吸出含培养基的 GM，并用 DMEM 洗涤细胞两次。然后加入 1 毫升含 1 微克/毫升霍乱毒素的 DMEM，将细胞置于 4°C 环境中 30 分钟。吸出含毒素的培养基，并用 DMEM 洗涤细胞两次。

然后将细胞在 37 摄氏度下，用 1 毫升 DMEM 培养基孵育所需时间。每个追踪时段结束时，用 PBS 洗涤细胞，随后每孔加入 250 微升含 0.5 毫摩尔 EDTA 的 PBS 溶液进行孵育。在冰上孵育 10 分钟后，使用 P1000 移液器剧烈吹打，从六孔板中收集细胞。

收集完一个孔的细胞后，将其与同一条件下的第二和第三个孔的细胞合并。接着，将来自这三个重复孔的合并细胞悬液转移至一个微型离心管中。然后，将该微型离心管放入台式微型离心机中离心五分钟。

在所有条件下，应获得大小大致相同的细胞沉淀，离心力为 5,000 ×g。弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于 100 µL 预先配制并预冷的 0.04% 洋地黄毒苷工作溶液中。将细胞悬液置于冰上 10 分钟，使用台式微量离心机以 16,000 ×g 离心 10 分钟，沉淀洋地黄毒苷及通透化细胞。

将含有上清液的细胞质部分转移至新的微量离心管中，并保留含有细胞器的沉淀部分。SPR 毒素标准品用 HCN 缓冲液配制，浓度分别为 100、10、1 和 0.1 纳克/毫升；样品通过将含有上清液的细胞质部分用 HCN 缓冲液稀释至 1 毫升的终体积来制备。样品体积至少需 1 毫升，以确保在进样前将 500 微升样品环中的空气完全排出；含有细胞器的沉淀部分用 1 毫升含 1% Triton X-100 的 HCN 缓冲液重悬。

添加去垢剂对于释放被膜包裹的毒素池是必要的。同时，为验证分离步骤的可靠性，应平行制备细胞质组分和细胞器L组分作为对照实验；将细胞质组分重悬于20微升4×上样缓冲液中，将细胞器L组分重悬于120微升1×上样缓冲液中，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组分等体积样品，并采用Western印迹分析，以证明细胞质蛋白分布于上清组分，而可溶性内质网相关蛋白则分布于沉淀组分。在准备SPR芯片时，首先将带有自组装单分子层的镀金玻璃芯片置入SPR仪器中。

通过以每分钟41微升的流速在载玻片上灌注E-D-C-N-H-S溶液10分钟来激活传感器载玻片。所有后续灌注步骤均使用相同的流速。用含有0.05% Tween 20的PBS洗涤5分钟，以去除E-D-C-N-H-S激活缓冲液。

由于被 E-D-C-N-H-S 溶液脱保护，该板现在含有具有反应活性的 MI 连接臂。接下来，将抗 CTA 抗体以 1:20,000 的稀释比例溶于 20 毫摩尔的醋酸钠溶液中，对已活化的传感器载玻片进行孵育，持续 15 分钟。由于 pH 值变化，折射率单位（简称 RIU）将首先出现下降。

随后，由于抗体被酰胺反应性连接臂捕获，折射率单位（RIU）将随之上升。在传感器载玻片上，使用 PBST 缓冲液清洗五分钟，以去除未结合的抗体。被捕获的抗体所产生的 RIU 信号将趋于平稳并稳定下来，形成一个新的基线信号。

在芯片制备的最后一步，将1摩尔乙醇胺以灌注方式作用于传感器芯片5分钟。此步骤可封闭并使传感器芯片上任何未结合的连接分子失活。随后，以PBST缓冲液灌注抗体包被的传感器芯片5分钟，RIU信号将上升并建立基线读数。

然后将实验样品或毒素标准品在传感器上灌注 300 秒。从缓冲液中去除配体，并用 PBST 在传感器上灌注 200 秒。任何仍结合在传感器上的毒素通过 pH 5.0 的 PBST 进行第 102 次洗涤去除。

这将使信号恢复至初始基线读数，从而允许在同一传感器上处理下一个样品。在加载新样品之前，推动少量空气通过样品环路，以排出前一样品的任何残留液体。采集完成后。

数据可使用scrubber two软件进行分析，图形制备可使用Igor软件。百日咳毒素是一种AB型毒素，在其A链进入细胞质之前，会从细胞表面转运至内质网。PTs one进入细胞质。

基于 SPR 的转位检测法能够检测到中毒的 CHO 细胞胞质中的 PTs。未中毒细胞的胞质未产生任何信号，这证实了抗 PTs 的特异性。该抗体不与宿主胞质中的任何组分发生交叉反应。

在存在 felden 的情况下，经毒素处理的细胞所获得的细胞质组分同样未能产生阳性信号。BFA 可阻止毒素向内质网（ER）易位位点的转运，从而抑制 H 链向细胞质的递送。Chole toin 是另一种 AB 型内质网易位毒素。

在霍乱毒素处理的Hela细胞的胞质组分中检测到了CTA1，这表明该方法适用于多种细胞类型，并可应用于任何具有可用抗链抗体的毒素。当用霍乱毒素处理细胞的胞质组分流过涂有抗CTB抗体的SPR传感器时，未检测到信号，从而证明与CTA1亚基不同，负责细胞结合的CTB五聚体不会进入胞质。

在涂有抗CTA抗体的SPR传感器上发生大量结合后，细胞器组分的信号相比细胞质组分的较弱信号超出量程。这与已知的CT向内质网转运位点运输效率低下相符，从而限制了毒素到达细胞质的量。

还可以监测转位至细胞质的毒素随时间的累积情况。在细胞于4摄氏度暴露于CT后，升温至37摄氏度15分钟时，细胞质中未检测到毒素。

在37摄氏度下孵育30分钟后，检测到少量细胞质毒素，而在45分钟和60分钟的追踪间隔后，检测到的细胞质毒素量逐渐增多。这表明与细胞相关的毒素持续长期递送至宿主细胞质中。该检测方法还可检测毒素向细胞质转位的抑制作用：用10% DMSO处理的细胞与未处理的中毒对照细胞相比，表现出较低水平的类似细胞质的CT A1片段，提示毒素未发生解折叠。

一条完整的链是易位到胞质溶胶的先决条件，因此DMSO诱导的CT A链稳定化相应地阻止了其从内质网向胞质溶胶的移动。为了定量DMSO诱导的毒素易位阻断效应，采用由已知毒素浓度生成的标准曲线，计算出未处理细胞的胞质溶胶中cta一浓度为每毫升0.3纳克，DMSO处理细胞中为每毫升0.1纳克。DMSO对CT A一去折叠的抑制，从而导致CTA一从内质网向胞质溶胶易位减少了三倍。

通过该实验步骤，我们将能够采用其他技术，例如中毒测定法，以建立细胞质中毒素含量与毒素活性之间的直接关联。