位点特异性细菌染色体工程：φC31 整合酶介导的盒式交换（IMCE）
2012年3月16日
本文介绍了一种将目标外源DNA快速高效地整合到预制受体菌株（称为着陆垫菌株）中的方法。该方法通过接合及ΦC31整合酶的表达，实现DNA表达盒在特定工程化着陆垫位点上的定点整合。
以下实验的总体目标是将目标DNA片段整合到细菌染色体的预定位置。该过程通过一种涉及四种经过基因改造的细菌菌株的接合实验方案实现。受体菌株的染色体中已整合有一个“着陆平台”序列，该序列包含一个链霉素抗性基因和大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶基因，两侧由ATP位点包围。
P JH one 10 供体菌株携带一种质粒，该质粒在 B 位点两侧包含一个填充型红色荧光蛋白基因以及一个抗生素抗性基因。PJC two 供体菌株携带一种质粒，该质粒含有来自链霉菌噬菌体 C 31 的位点特异性整合酶，该酶受 LAC 启动子调控。第四种菌株 MT 616 提供接合所必需的转移基因，即质粒从一个细胞转移到另一个细胞的过程，从而在受体菌株中产生转接合子。
获得整合酶介导的盒式交换所需的两种质粒。PJ H one 10 质粒上的供体盒与染色体上着陆平台盒的标记发生交换后，导致着陆平台标记 SPR 和 UIDA 丢失，而在最终的转化子中保留供体盒标记 RFP 和 GMR。与同源重组等其他方法相比，该技术的主要优势在于操作简便且效率高。
该方法还可适用于多种多样的细菌。本视频中使用的受体菌株为 S. milli 菌株，在接合前两天，从单个菌落接种至 5 毫升添加了壮观霉素的 TY 培养基中，并将 S. milli 菌株在 30 摄氏度下振荡培养两天。在接合实验前一天，将以下每种大肠杆菌菌株分别接种至 5 毫升添加了相应抗生素的 LB 液体培养基中：携带整合酶表达质粒的 DH5α 菌株接种至含四环素的培养基中，MT616（辅助菌株）接种至含氯霉素的培养基中，以及携带供体质粒盒的 DH5α 菌株接种至含庆大霉素的培养基中。将这三种大肠杆菌菌株在 37 摄氏度下持续振荡培养过夜，以准备用于接合实验。取每种培养物各 1.5 毫升转移至离心管中，在 17,000 × g 条件下离心 30 秒以收集菌体沉淀，弃去上清液，将每份菌体沉淀重悬于 1 毫升无菌 0.85% 氯化钠溶液中。再次离心后弃去上清液，再用移液器将每份沉淀分别重悬于 100 微升无菌 0.85% 氯化钠溶液中。将每种菌株的洗涤后培养物各取 10 微升，分别点样于普通 TY 琼脂平板上。
这些位点为对照位点。接下来，取每种菌株各40微升，排除含有Pjc2的 大肠杆菌 DH5α，加入无菌离心管中，通过移液器吹打混匀，然后取120微升该混合液点加到普通TY琼脂平板上。此位点为无整合酶阴性对照。
最后，取四种菌株各40 µL，加入无菌离心管中混匀，取160 µL该混合液点样于同一TDY琼脂平板上。此点样区域即为整合酶介导的盒式交换交配点。
将平板放入超净工作台中，静置约20分钟使菌斑干燥。密封平板，并在接合实验划线操作的次日，于30摄氏度下过夜培养。将两个对照菌斑和IMCE接合菌斑接种至添加了链霉素和庆大霉素的TY琼脂平板上。
S菌株携带一种突变，可赋予其对链霉素的高度抗性，用于计算IMCE效率。将约四分之一的IMCE接合斑块重悬于500微升无菌0.85%氯化钠溶液中，进行10倍系列稀释至10⁻⁷。取10⁻²至10⁻⁵稀释液涂布于添加了链霉素、庆大霉素和X-Gl的TY琼脂平板，用于筛选转接合子。取10⁻³至10⁻⁷稀释液涂布于添加了链霉素和X-Gl的TY琼脂平板，用于同时筛选转接合子及潜在受体菌。将平板在30摄氏度下培养三天以计数总受体菌。
在绿光下并通过红色滤光片观察RFP转导子，通过比较转导子菌落形成单位（CFU）与总受体菌CFU的数量，计算IMCE效率的百分比。经过在添加链霉素和庆大霉素的TY培养基上孵育三天后，约有一半的转导子会发生真正的交换，从而呈现白色且无显色反应。以下对照菌株应无任何生长：无整合酶对照、s milli latte UW 2 27对照、e coli MT 616对照、含有P JH one 10质粒的e coli DH five alpha对照，以及含有PJC two质粒的e coli DH five alpha对照。相比之下，来自接合位点的IMCE划线应显示在头道划线上有融合性生长，并在第二道划线上出现多个菌落。接下来的两幅图像显示了接合位点经10⁻²稀释后在TY-链霉素-X-gal琼脂和TY-链霉素-庆大霉素-X-gal琼脂上的重悬菌液情况，其中TY-链霉素-庆大霉素-X-gal琼脂上的结果尤为明显。
蓝色菌落为单个重组子。在绿光下通过红色滤光片观察时，白色菌落为发生真实盒式交换的转座整合子，其在TY strept cin xgl琼脂上接种的交配点重悬液的负二次稀释不显示荧光。相比之下，该交配点重悬液在Ty链霉素-庆大霉素-Xgl琼脂上的10负二次稀释显示出两个水平的荧光。
较亮的菌落对应于蓝色菌落，具有较高的RFP表达，推测是由于载体中LAC启动子发生了通读。较暗的菌落对应于白色菌落，这些菌落发生了真正的盒式交换，仅含有RFP及其自身的直接启动子，而不受LAC启动子的通读影响。这些菌落还应表现为链霉素敏感。
以迁移子占总受体菌比例表示的转座整合效率应为0.5%。观看本视频后，您应充分了解如何利用我们构建的工程菌株通过细菌接合将DNA构建体插入细菌染色体。
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概述
本文介绍了一种利用经过基因工程改造的着陆位点菌株，实现外源DNA在细菌染色体上特定位点整合的方法。该技术通过接合转移和ΦC31整合酶来促进DNA的整合过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因工程
- 微生物学
- 生物技术
背景
- 将DNA整合到特定基因组位点对于基因工程中的多种应用至关重要。
- 着陆位点菌株为DNA整合提供了多功能的平台。
- ΦC31整合酶是用于位点特异性重组的常用工具。
- 接合转移是细菌间传递遗传物质的有效方法。
研究目的
- 开发一种快速高效的方法，将DNA片段整合到细菌染色体中。
- 利用基因工程菌株实现精确的遗传修饰。
- 增强微生物系统中基因工程的操作能力。
使用的方法
- 在接合实验中使用了四种经过基因改造的细菌菌株。
- 受体菌株包含带有抗生素抗性基因的着陆序列。
- 供体菌株携带含有整合酶和荧光蛋白基因的质粒。
- 接合作用促进了质粒的转移及其在受体菌株中的整合。
主要结果
- 成功将DNA构建体整合到着陆位点基因座。
- 该方法在生成基因修饰菌株方面表现出高效性。
- 荧光标记证实了成功的整合事件。
- 该策略可应用于多种基因构建体以用于研究目的。
结论
- 所述方法为细菌中的DNA整合提供了一种可靠的策略。
- 构建的着陆平台菌株可用于多种基因工程应用。
- 该技术扩展了可用于微生物基因改造的工具集。
常见问题
行业重要性概述
将大型DNA构建体稳定、特异性地整合到细菌染色体中，可解决生物制药研发中在可重复性、拷贝数控制和遗传稳定性方面的关键挑战。ΦC31整合酶介导的盒式交换（IMCE）技术能够实现精确的基因组编辑，支持稳健的菌株构建和平台标准化。该技术能力对于需要可靠遗传操作的早期发现、筛选及转化研究工作流程至关重要。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够精确插入功能性结构，用于通路解析和机制研究。
- 通过在特定基因座实现稳定、单拷贝整合，支持生物学风险降低。
- 有助于对工程菌株在靶点验证中的性能进行可预测性评估。
筛选与检测方法开发
- 提供遗传稳定的菌株，用于可重复的检测方法开发和化合物筛选。
- 减少质粒拷贝数和不相容性带来的变异性，提高检测标准化水平。
- 可规模化生成报告基因或筛选标记菌株，适用于高通量工作流程。
转化与临床前研究
- 通过在染色体环境中维持基因构建体，支持从发现到临床前验证的连续性。
- 在与疾病模型相关时，使工程菌株与转化生物标志物策略保持一致。
- 降低在长期临床前研究过程中发生遗传不稳定的風險。
流程与工作流整合
IMCE 技术通过实现稳健的菌株工程，支持假设验证、筛选和转化研究，从而融入从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology：促进以假设为驱动的遗传元件插入，用于通路和靶标研究。
- Screening：提供可重复、单拷贝报告基因菌株，实现定量检测结果的输出。
- Analytics：支持菌落水平的读出（如荧光、抗生素抗性），用于高效筛选与定量分析。
- Translational Research：保持构建体的稳定性，以支持下游与疾病相关模型的开发。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的平台，实现跨项目的迭代菌株工程。
运营与企业影响
- 科学价值：提高工程化细菌系统的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：标准化基因整合流程，提升研发团队间的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提供稳定可靠的遗传工具，支持在早期评估阶段做出科学的决策。
- 项目组合影响：通过减少后期生物变异性，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细菌遗传学、接合转化实验方案和筛选标记分析方面的专业知识。
- 需要具备标准微生物学仪器设备，以及荧光或比色筛选能力。
- 要求不同团队在菌株构建和筛选标准方面实现统一规范化。
- 可适用于具有相容性接合转化和重组系统的多种细菌物种。
- 每种新构建体或宿主的效率和标记选择均需通过实验验证。
