Name: 网站特定的细菌染色体工程:ΦC31整合介导的盒式交换（IMCE） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 了解利用ΦC31整合酶介导的盒式交换技术进行细菌染色体位点特异性DNA整合的方法。该技术通过接合转移和工程化着陆垫菌株实现高效基因修饰，适用于合成生物学与代谢工程研究。

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感谢 Margaret C.M. Smith 慷慨提供整合酶克隆 
资金支持来自： 
Genome Canada/Genome Prairie 
NSERC 发现项目和战略性项目资助

1. 培养物的制备
<ol>
 <li>制备无菌液体培养基：TY10（每升含 5 克胰蛋白胨、3 克酵母提取物、0.44 克二水合氯化钙），以及 LB11（每升含 10 克胰蛋白胨、5 克酵母提取物、5 克氯化钠，pH 7）。</li>
 <li>从单菌落接种：将 SmUW227（S. meliloti LP 菌株：构建方法将在别处描述，构建细节可应要求提供）接种至 5 ml 含 50 μg/ml 链霉素的 TY 培养基中；将以下菌株分别接种至 5 ml LB 液体培养基中，并添加相应抗生素：含 pJC2（整合酶表达质粒）的 E. coli DH5α12，添加 10 μg/ml 四环素；E. coli MT61613（辅助菌株），添加 10 μg/ml 氯霉素；含 pJH110（供体质粒盒）的 E. coli DH5α，添加 5 μg/ml 庆大霉素。</li>
 <li>将 E. coli 菌株在 37 °C 条件下振荡培养过夜。将 S. meliloti 菌株在 30 °C 条件下振荡培养两天。若使用较大接种量（饱和培养物按 1:500 比例转接），也可在过夜培养中获得 S. meliloti 培养物。</li>
</ol>
2. 培养物的制备与混合
<ol>
 <li>每种菌株取1.5 ml培养物，于17,000 × g离心30秒收集菌体沉淀，用1 ml无菌0.85% NaCl重悬，洗涤一次；重复该步骤一次。</li>
 <li>将菌体沉淀重悬于100 μl无菌0.85% NaCl中。</li>
 <li>将每种菌株洗涤后的培养物各取10 μl，分别点样于普通TY琼脂平板上。这些点样位置为对照点。</li>
 <li>除携带pJC2的E. coli DH5α12外，将其他各菌株40 μl加入无菌离心管中，混匀，取120 μl该混合液点样于普通TY琼脂平板上。此点样位置为无整合酶阴性对照。</li>
 <li>将每种菌株各取40 μl加入无菌离心管中，混匀，取160 μl该混合液点样于普通TY琼脂平板上。此点样位置为IMCE接合点样位点。</li>
 <li>将点样后的平板置于超净工作台中晾干。</li>
 <li>密封平板，于30 °C过夜培养。</li>
</ol>
3. 转整合子的分离
<ol>
 <li>
 将对照菌株和IMCE菌株划线接种至添加了200 μg/ml链霉素（SmUW227基于Rm1021构建，后者携带赋予高水平链霉素抗性的突变14）和30 μg/ml庆大霉素的TY琼脂平板上。</li>
 <li>为计算IMCE效率，将约四分之一的IMCE接合斑块重悬于500 μl无菌0.85% NaCl溶液中。进行10倍系列稀释至10-7。取10-2至10-5稀释液涂布于添加200 μg/ml链霉素和30 μg/ml庆大霉素的TY琼脂平板，用于筛选转整合子。取10-3至10-7稀释液涂布于添加200 μg/ml链霉素的TY琼脂平板，用于筛选转整合子及潜在受体菌，即总受体菌数。</li>
 <li>为分离无标记转整合子，将约四分之一的IMCE接合斑块重悬于500 μl无菌0.85% NaCl溶液中。进行10倍系列稀释至10-6。取10-4至10-6稀释液涂布于四块添加200 μg/ml链霉素和200 μg/ml X-gluc的TY琼脂平板。</li>
 <li>将平板在30 °C下培养3天。</li>
 <li>在绿光（525 nm）照射下并通过红色滤光片（>610 nm）观察RFP转整合子15。</li>
 <li>以转整合子菌落形成单位（CFU）与总受体菌CFU之比计算IMCE效率百分比。约一半的转整合子会发生真正的盒式交换，表现为白色菌落且对壮观霉素敏感。</li>
 <li>为筛选无标记转整合子（当供体质粒不含Gmr，如pJH110时），挑选白色菌落（延长培养时间，在室温下额外培养1–2天，可增强X-gluc对菌落的显色区分效果，这在S. meliloti SmUW227中是必要的），并通过在不含抗生素的TY琼脂平板和含100 μg/ml壮观霉素的TY琼脂平板上进行抗性检测，确认该菌落对壮观霉素敏感。</li>
</ol>
4. 代表性结果
在添加链霉素和庆大霉素的TY培养基上培养三天后，对照组划线区域应无任何生长。IMCE划线区域应在第一道划线上呈现融合生长，第二道划线上出现大量菌落，如图2所示。转座整合效率（以转座整合子占总受体菌的比例表示）应在0.5%左右。约一半的转座整合子对壮观霉素敏感且菌落呈白色，表明其已发生真正的盒式交换。含有来自pJH110质粒的测试用rfp供体盒的转座整合子，在绿色光（525 nm）照射下并通过红色滤光片（>610 nm）观察时，应显示出可辨别的RFP荧光15。
<img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="基因转移过程示意图；通过pJH110和pJC2进行质粒供体方法；染色体整合。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 接合混合物示意图：在pRK600表达的转移基因辅助下，所有质粒在细胞间随机转移。该转移导致混合物中产生转整合子，即LP菌株获得了进行IMCE所必需的两种质粒——整合酶（int）辅助质粒pJC2和供体质粒pJH110。通过ΦC31整合酶的作用，非复制型供体质粒（pJH110）上的供体盒与染色体上LP盒的标记发生交换，结果导致LP标记（Spr 和 uidA）丢失，而供体盒（rfp 和 Gmr）则保留在最终形成的转整合子中。
<img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="培养皿细菌生长实验；菌落分割，抗生素抗性检测。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. A：非选择性 TY 平板上的接合斑点平板，显示琼脂表面干燥的细胞混合物。B：在链霉素-庆大霉素-X-半乳糖平板上划线的接合斑点，从左上角顺时针依次为：无整合酶对照、IMCE 插入 S. meliloti、含 pJC2 质粒的 E. coli DH5α 对照、含 pJH110 质粒的 E. coli DH5a 对照、E. coli MT616 对照，以及 S. meliloti UW227 对照。C：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-X-半乳糖琼脂平板。D：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-庆大霉素-X-半乳糖琼脂平板（蓝色菌落为单个重组子，白色菌落发生了真正的盒式交换）。E：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-X-半乳糖琼脂平板，显示无荧光。F：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-庆大霉素-X-半乳糖琼脂平板，显示两种水平的荧光（较亮的菌落对应蓝色菌落，rfp 表达更高，推测是由于载体序列中启动子的通读所致；而发生真正盒式交换的菌落仅保留 RFP 及其紧邻的启动子，载体中的 lac 启动子缺失，因此无通读现象）。

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
<li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li>
<li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li>
<li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li>
<li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li>
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<li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li>
<li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

IMCE 技术可将单个两侧带有 attB 的 DNA 破碎片段高效整合到已构建菌株的 LP 位点。一旦目标构建体被克隆至 rfp 的位置以形成供体片段，该技术便无需后续的 DNA 纯化与转化步骤，因而具有很高的稳健性。必须设置适当的生长对照，以确保抗生素抗性的确源于顺式整合子的形成，而非其他因素。
IMCE 以大约 0.5% 的效率产生跨整合子。相比之下，通过同源重组发生的双交换频率约为 10-6。通过 λ-red16 进行的重组工程是另一种基于噬菌体的系统，需要特定的同源序列，且在 E. coli17 以外的生物中效果差异较大。另一种选择 Tn7 位点特异性重组需要 attTn7 位点18，而这些位点在 γ-变形菌以外的生物中极为罕见。ΦC31 整合酶已在多种不同宿主中表现出高效的活性4,19。尽管使用 ΦC31 整合酶需要预先对宿主进行改造，但其应用不受特定门类的限制。IMCE 具有效率高和模块化的优势，因为任何供体...

<table><tbody><tr><td>链霉素</td><td>BioShop Canada</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>壮观霉素</td><td>BioShop Canada</td><td>&lt;a href=&quot;https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>BioShop Canada</td><td>GTA202</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>BioShop Canada</td><td>CLR201</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>BioShop Canada</td><td>TET701</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>BioShop Canada</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>细菌学级琼脂</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>BioShop Canada</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>X-gluc</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G1281C1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; MT616 菌株</td><td>可应要求提供</td><td></td><td>亦在本实验室以外使用</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;pJC2 菌株</td><td>本实验室自备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; pJH110 菌株</td><td>本实验室自备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmUW227 菌株</td><td>本实验室自备</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

位点特异性细菌染色体工程：φc31 整合酶介导的盒式交换（imce）

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

细菌染色体可用于稳定维持长达兆碱基范围的外源DNA1染色体整合可避免质粒复制、质粒稳定性、质粒不相容性以及质粒拷贝数变异等问题。该方法利用位点特异性整合酶 链霉菌属 噬菌体（Φ）C312,3ΦC31 整合酶催化两个特定 DNA 位点之间的直接重组： attB 和 attP （分别为34和39 bp）4该重组是稳定的，不会发生回复突变。5一个由壮观霉素抗性基因组成的“着陆平台”（LP）序列， aadA (SpR）以及 大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA两侧由 attP 位点已整合到染色体中 Sinorhizobium meliloti，Ochrobactrum anthropi 和 Agrobacterium tumefaciens 在基因间区域 ampC 位点，以及 tetA 位点，分别。 S. meliloti 在本方案中使用了包含可移动供体质粒的载体。 attB 侧翼位点，位于一个填充型红色荧光蛋白（rfp 基因和抗生素抗性基因也已被构建。在此示例中，使用的是庆大霉素抗性质粒 pJH110。 rfp 基因6 可使用所需的结构进行替换 Sph我与 PstI. 或者，可使用两侧带有合成结构的构建体 attB 位点可亚克隆至可移动载体（如pK19mob）中7ΦC31整合酶基因（克隆自pHS62）的表达8由 lac 启动子，位于可接合的广宿主范围质粒pRK7813上9.
采用四亲本杂交方法将供体质粒导入LP菌株，从而用供体质粒替换LP序列中的标记基因。这些细胞即为转整合子。转整合子的形成效率通常为0.5%。通过抗生素敏感性检测或利用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X-gluc）进行蓝白斑筛选，通常可在前500至1,000个菌落中鉴定出转整合子。本实验方案包含创建和分离转整合子的杂交与筛选步骤。

本文介绍了一种将目标外源DNA快速高效地整合到预制受体菌株（称为着陆垫菌株）中的方法。该方法通过接合及ΦC31整合酶的表达，实现DNA表达盒在特定工程化着陆垫位点上的定点整合。

位点特异性细菌染色体工程：φC31 整合酶介导的盒式交换（IMCE）

细菌染色体可用于稳定维持长达兆碱基范围的外源DNA1。整合至染色体可避免诸如……等问题

以下实验的总体目标是将目标DNA片段整合到细菌染色体的预定位置。该过程通过涉及四种经过基因改造的细菌菌株的接合实验方案实现。受体菌株的染色体中已整合有一个“着陆平台”序列，该序列包含一个链霉素抗性基因和大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶基因，两侧由ATP位点包围。P JH one 10 供体菌株携带一种质粒，该质粒在 B 位点两侧包含一个填充用的红色荧光蛋白基因以及一个抗生素抗性基因。PJC two 供体菌株携带一种质粒，该质粒包含来自链霉菌噬菌体 C 31 的位点特异性整合酶，其表达受 LAC 启动子调控。第四种菌株 MT 616 提供接合所必需的转移基因，可实现质粒在细胞间的转移，从而在受体菌株中产生转导子。获得整合酶介导的盒式交换所需的两种质粒。PJ H one 10 质粒上的供体盒与染色体上着陆垫盒的标记发生交换，导致产生的转化子中着陆垫标记 SPR 和 UIDA 丢失，而供体盒标记 RFP 和 GMR 得以保留。与同源重组等其他方法相比，该技术的主要优势在于操作简便且效率高。该方法还可转移至多种不同的细菌中。本视频中使用的受体菌株为 S. milli 菌株，在接合前两天，从单个菌落接种至 5 毫升添加了壮观霉素的 TY 培养基中，并将 S. milli 菌株在 30 摄氏度下振荡培养两天。在接合实验前一天，将以下每种大肠杆菌菌株分别接种至 5 毫升添加了相应抗生素的 LB 液体培养基中：携带整合酶表达质粒的 DH5α 菌株接种至含四环素的培养基中， mobilizer 中间菌株接种至含氯霉素的培养基中，以及携带供体质粒盒的 DH5α 菌株接种至含庆大霉素的培养基中。将三种大肠杆菌菌株在 37 摄氏度下持续振荡过夜培养，以准备接合实验用细胞。取每种培养物各 1.5 毫升转移至离心管中，在 17,000 × g 条件下离心 30 秒以收集菌体沉淀，弃去上清液，将每份菌体沉淀重悬于 1 毫升无菌 0.85% 氯化钠溶液中。再次离心后弃去上清液，用移液器将每份菌体沉淀分别重悬于 100 微升无菌 0.85% 氯化钠溶液中。将每种菌株的洗涤后培养物各取 10 微升，分别点样于普通 TY 琼脂平板上。这些位点为对照位点。接下来，取每种菌株各40微升，排除含有Pjc2的E. coli DH5α，加入无菌离心管中，通过移液器吹打混匀，然后取120微升该混合液点加到普通TY琼脂平板上。此位点为无整合酶阴性对照。最后，取四种菌株各40微升，加入无菌离心管中混匀，取160微升该混合液点样于同一TDY琼脂平板上。此点样区域即为整合酶介导的盒式交换交配点。将平板放入超净工作台中，静置约20分钟使菌斑干燥。密封平板，并在接合实验划线后的第二天于30摄氏度下过夜培养。将两个对照菌斑和IMCE接合菌斑接种至添加了链霉素和庆大霉素的TY琼脂平板上。S milli 受体菌株携带一种突变，可产生对链霉素的高度抗性，用于计算 IMCE 效率。将约四分之一的 IMCE 接合斑点重悬于 500 µL 无菌 0.85% 氯化钠溶液中，进行 10 倍系列稀释至 10⁻⁷。取稀释液从 10⁻² 至 10⁻⁵ 涂布于添加了链霉素、庆大霉素和 Xgl 的 TY 琼脂平板，以筛选转接合子。另取稀释液从 10⁻³ 至 10⁻⁷ 涂布于添加了链霉素和 Xgl 的 TY 琼脂平板，以同时筛选转接合子及潜在受体菌。总受体菌计数：将平板在 30°C 下培养三天。在绿光下通过红色滤光片观察RFP转导子，通过比较转导子菌落形成单位（CFU）与总受体菌CFU的数量，计算IMCE效率的百分比。经过在添加链霉素和庆大霉素的TY培养基上孵育三天后，约一半的转导子会发生真正的交换，表现为白色且无显色反应。以下对照菌株应无任何生长：无整合酶对照、s. milli latte UW227对照、E. coli MT616对照、含有PJH110质粒的E. coli DH5α对照，以及含有PJC2质粒的E. coli DH5α对照。相比之下，来自接合位点的IMCE划线应显示在头道划线上有融合生长，第二道划线上出现大量菌落。接下来这两张图像显示了接合位点经10⁻²稀释后在TY-链霉素-X-gal琼脂和TY-链霉素-庆大霉素-X-gal琼脂上的重悬菌液情况。蓝色菌落为单个重组子。在绿光下透过红色滤光片观察，白色菌落为发生真实盒式交换的转座整合子；当接种于TY链霉素-氯霉素-Xgl琼脂平板并进行两倍稀释的交配点重悬液培养时，其不显示荧光。相比之下，在TY链霉素-庆大霉素-Xgl琼脂平板上进行10⁻²稀释的交配点重悬液培养，则显示出两种水平的荧光。较亮的菌落对应于蓝色菌落，具有较高的RFP表达，这可能是由于载体中LAC启动子发生了通读效应。较暗的菌落对应于白色菌落，这些菌落发生了真正的盒式交换，其RFP仅保留了紧邻的启动子，而不受LAC启动子通读的影响。这些菌落还应表现为链霉素敏感。以迁移子占总受体菌比例表示的转座整合效率应为0.5%。观看本视频后，您应充分了解如何利用我们构建的工程菌株通过细菌接合将DNA构建体插入细菌染色体。

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