网站特定的细菌染色体工程:ΦC​​31整合介导的盒式交换（IMCE）

描述一个快速和有效的方法融入预制受体菌株，称为停机坪株，外源DNA的利益。该方法允许进入工程着陆垫一个给定的应变轨迹的站点特定的DNA盒的整合，通过共轭ΦC31整合表达。

以下实验的总体目标是将所需的 DNA 构建体整合到预定基因座的细菌染色体中。这是通过涉及四种工程细菌菌株的交配方案实现的。受体菌株具有一个着陆垫序列，该序列由一个特异性霉素抗性基因和大肠杆菌 β 葡萄糖醛酸酶基因组成，两侧是整合到其染色体中的 ATP 位点。

P JH one 10 供体菌株携带一个质粒，该质粒位于 B 位点、填充剂、红色荧光蛋白基因和抗生素抗性基因的两侧。PJC 双供体菌株携带一个质粒，该质粒含有来自 LAC 启动子控制下的链霉菌噬菌体 C 31 的位点特异性整合酶。第四种菌株 MT 616 提供结合质粒在细胞之间转移所需的转移基因，导致通过受体菌株产生反式基因。

获得整合酶介导的盒交换所需的两种质粒。来自 PJ H one 10 质粒的供体盒与染色体上着陆垫盒的标记物交换导致着陆垫标记物、SPR 和 UIDA 的丢失以及供体盒 RFP 和 GMR 的维持所得的跨性别移民。与其他方法（如同源重组）相比，该技术的主要优点是方案的简便性和效率。

它还可以转移到多种细菌上。本视频中使用的受体菌株是交配程序前两天的 S milli 拿铁菌株，用于产生反式整合素，从单个菌落接种到 5 毫升 TY 培养基中，与奇观霉素一起，在 30 摄氏度下将 S milli 菌株孵育两天，在交配程序前一天摇动，将以下每种大肠杆菌菌株接种到 5 毫升补充的 LB 液体培养基中将含有整合酶表达质粒的适当抗生素 DH five alpha 放入含有四环素 MT 616 的培养基中，将含有氯霉素的动员剂中间体和 DH five alpha 含有供体盒质粒的培养基中，放入含有庆大霉素的培养基中，将三种大肠杆菌菌株在 37 摄氏度下孵育过夜，不断摇动，为交配程序准备细胞。将四种培养物各 1.5 毫升转移到试管中，以 17， 000 次 G 离心 30 秒以收集细胞沉淀，弃去培养基并将每个细胞沉淀重悬于一毫升无菌 0.85% 氯化钠中 弃去上清液后再次离心试管 Resus 使用移液管将每个沉淀悬浮在 100 微升无菌 0.85% 氯化钠中，每个沉淀单独点取 10 微升洗涤的培养物在普通 TY 琼脂平板上过滤。

这些点是控制点。接下来，在无菌管中加入每种菌株 40 微升，不包括含有 Pjc two 的大肠杆菌 DH 5 alpha，并通过在普通 TY 琼脂平板上上下吹打 120 微升该混合物进行混合。这个斑点是无整合酶阴性对照。

最后，在无菌管混合物中加入四种菌株中的每种 40 微升并点样。在同一 TDY 琼脂平板上加入 160 微升这种混合物。这个点是整合酶介导的盒交换交配点。

将板放入层流罩中，然后让斑点干燥约 20 分钟。密封板并在交配方案条纹后的第二天在 30 摄氏度下孵育过夜。两个对照点和 IMCE 交配点放在补充有链霉素和庆大霉素的 TY 琼脂平板上。

S milli 受体菌株携带突变，赋予对链霉素高水平的抗性，用于计算 IMCE 效率 复苏将大约四分之一的 IMCE 交配点悬浮在 500 微升无菌 0.85% 氯化钠中 将 10 倍连续稀释至 10 至负第七板 稀释度趋于负 2 至 10 至负 5 在补充链霉素的 TY 琼脂平板上， 庆大霉素和 XGL 为跨性别移民选择。在 TY 琼脂平板上，平板稀释液趋于负 3 到 10 到负 7，并辅以链霉素和 xgl，供跨性别移民和潜在受者选择。IE 总接受者在 30 摄氏度下孵育板 3 天。

在绿灯下查看 RFP 反式，并通过红色过滤器计算反式移民的 CFU 与总受者的 CFU 相比的 IMCE 效率百分比，大约一半的反式将经历真正的交换，使其在补充链霉素和庆大霉素的 Ty 上孵育三天后变得白色且不敏感，以下对照菌株不应生长， 无整合酶对照 s milli latte UW 2 27 对照 e 大肠杆菌 MT 616 对照 e 大肠杆菌 DH 5 α 含 P JH 1 10 对照和大肠杆菌 DH 5 α 含 PJC 2 对照。相比之下，来自交配点的 IMCE 条纹应该在头部条纹上汇合生长，在第二条条纹上有许多菌落。接下来的两张图片显示了 TY 链霉素 xgl 琼脂上交配点的 10 到负 2 稀释液，以及 TY 链霉素庆大霉素 xgl 琼脂上 TY 链霉素 xgl 琼脂上的复活悬液。

蓝色菌落是单个重组体。虽然白色菌落是在绿光下和通过红色滤光片观察时经历过真正盒交换的反式整合素，但在 TY strept cin xgl 琼脂上倾向于交配点复苏悬浮液的负 2 稀释缺乏荧光。相比之下，Ty 链霉素庆大霉素 Xgl 琼脂上的交配点复苏悬浮液的 10 到负 2 稀释液显示两个水平的荧光。

较亮的菌落对应于蓝色菌落，并且具有更高的 RFP 表达，这可能是由于促进了载体中 LAC 启动子的读穿。不太亮的菌落对应于白色菌落，白色菌落经历了真正的盒交换，并且仅包含 RFP，仅具有其直接启动子，没有来自 LAC 启动子的读取。这些趋势移民也应该对 specks mycin 敏感。

以跨式移民占总受者的百分比表示的反式整合效率应在 0.5% 的范围内观看此视频后，您应该对如何使用我们的工程菌株使用细菌偶联将 DNA 构建体插入细菌染色体有很好的了解。