利用侧向层析技术检测血液系统恶性肿瘤患者中的侵袭性肺曲霉病

本实验的总体目标是演示如何使用侧向层析装置，快速检测人血清和支气管肺泡灌洗液中的曲霉诊断性抗原。首先将血清或支气管肺泡灌洗样本加入侧向层析装置的释放孔中，实现这一检测。第二步是让溶液沿膜迁移。

下一步是通过检测内对照线来确定测试是否有效。最后一步是通过检测测试线来解读测试结果。最终，侧向层析装置用于检测血清或支气管肺泡灌洗液中是否存在曲霉诊断抗原。

曲霉LFD可作为侵袭性肺曲霉病诊断的辅助检测方法。与现有的曲霉半乳甘露聚糖酶免疫分析、泛真菌、眼底β-葡聚糖检测以及曲霉PCR检测等方法相比，该技术的主要优势在于它是一种快速的即时检测诊断方法，仅需最少的实验室设备和培训。尽管LFD是为检测曲霉菌属而开发的，但侧向流动技术也可应用于其他感染性病原体的检测，例如枝孢霉属、镰刀菌属和里斯特菌属。

通过使用针对这些生物体的单克隆抗体，对该方法进行可视化展示至关重要。由于对侧向流动检测（LFD）结果的判读需要熟悉检测格式，因此在处理未经处理的血液样本以收集血清时，应将血液在4°C条件下静置使其凝固。血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）应在使用前分装保存于-20°C，分装保存可避免因重复冻融导致靶抗原降解。在准备血清和BAL样本进行检测时，先将样本在室温下解冻，然后置于冰上。充分涡旋混匀后，在14,000 RPM条件下离心1分钟。对于常规人源样本检测，可将血清用组织培养基按1:1比例稀释；或者，为使靶抗原从血清免疫复合物中解离，可将血清按1:2比例稀释于含4% EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在沸水浴中加热3分钟，随后在14,000 RPM条件下离心5分钟。

人支气管肺泡灌洗液无需预处理。支气管肺泡灌洗样本解冻后经涡旋振荡和离心，即可获得澄清样本，可直接用于侧向流动检测装置。检测时，侧向流动检测装置（LFD）储存于室温或23摄氏度条件下，在此条件下可稳定保存12个月。

开始检测时，从包装袋中取出设备，并将其放置在水平表面上。使用无菌移液器吸头，在数秒内向设备的释放孔加入 100 微升预处理后的血清。液体应通过毛细作用沿观察窗内的硝酸纤维素膜迁移。

以相同方式，将100微升未稀释的支气管肺泡灌洗（BAL）样本加入装置的释放口。在室温下反应15分钟，此时应记录检测结果。记录结果前，检测时间不得超过15分钟。

由于这可能影响结果的解读，因此延长孵育时间不会增强一周后的反应。LFD由塑料外壳上标有字母C的质控线和标有字母T的检测线组成。无论血清或支气管肺泡灌洗（BAL）样本中是否存在曲霉抗原，质控线均应始终出现。若血清或BAL样本中存在曲霉抗原，则质控线的出现表明检测已正确运行。

在加入样本后15分钟内，检测线也会出现。检测线的强度以及莱姆病反应的强度与血清和VAL样本中目标抗原的浓度成正比。该检测程序中最困难的部分是检测结果的判读。

LFD 结果应在 15 分钟时读取，并与此处所示的代表性示例进行比较。本图展示了使用支气管肺泡灌洗液（BAL）和血清样本获得的弱阳性、中等阳性及强阳性 LFD 结果的代表性示例。血清样本中无论强度如何，只要出现阳性检测线，即提示存在侵袭性曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA），这是由于血液中存在循环的曲霉抗原所致。BAL 样本中无论强度如何，只要出现阳性反应，即提示分生孢子已在肺部萌发并形成潜在致病性的菌丝（hyphae）。

在缺乏曲霉抗原的情况下，检测线不会出现，结果记录为阴性。本表格展示了使用急性髓系白血病或根据欧洲癌症研究与治疗组织及美国国家过敏与传染病研究所研究组诊断标准确诊的AML患者支气管肺泡灌洗液进行LFD检测的结果。表格中还包括每位患者的相应临床和影像学数据，以及ASPERRA特异性PCR检测结果。

根据2002年E-O-R-T-C-M-S-G指南，患者12、13和16因存在宿主因素及临床标准或GM阳性而被诊断为可能的侵袭性肺曲霉病（IPA）。根据修订后的2008年E-O-R-T-C-M-S-G指南，仅凭宿主因素和GM阳性，或仅凭宿主因素和临床标准，若无临床数据或真菌学方面的支持性证据，则不足以提示可能的侵袭性真菌感染。患者6因存在主要宿主因素、次要临床特征及GM阳性，依据2002年和2008年指南均被诊断为很可能的IPA。

最后需要注意的是，尽管目前LFD检测和PCR检测均未被纳入E-O-R-T-C-M-S-G指南中针对患者6号和12号支气管肺泡灌洗（BAL）样本的检测标准，但LFD检测与PCR检测结果之间，以及与商用半乳甘露聚糖检测在检测曲霉菌抗原和核酸方面的结果具有高度一致性。按照本操作流程，还可并行开展其他检测方法，如血清半乳甘露聚糖酶联免疫检测、泛真菌PCR、真菌β-葡聚糖检测或曲霉菌PCR检测，以进一步确认侵袭性真菌病的诊断。切记，处理人血清和支气管肺泡灌洗液具有极高的生物安全风险，操作人员应始终接种乙肝、结核病等疾病的疫苗。