小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本视频演示了一种利用磁珠分离和荧光激活细胞分选技术来分离并进行表型表征造血祖细胞的实验方案。首先，从小鼠身上解剖取出后肢、股骨、胫骨和脊髓，并进行匀浆处理以制备骨髓细胞悬液。随后，使用磁性微珠富集表达 c-kit 的细胞群体。

对富集细胞群体的流式细胞分析表明，该方法可获得高度纯化的造血系细胞、祖细胞及造血干细胞，可用于体外和体内功能研究。与现有的骨髓冲洗等方法相比，该技术的主要优势在于能够更高效、更快速地回收骨髓细胞。该技术的应用前景涵盖炎症、自身免疫、免疫缺陷、退行性疾病、代谢紊乱以及癌症免疫模型的治疗或诊断，因为它能够实现对造血祖细胞的表型鉴定及体外功能分析。

因此，该方法可为不同生理和病理条件下造血过程的监测提供见解。它还可用于研究不同前体细胞亚群中的细胞生物学信号转导及发育调控的基因表达。首先将已处死的小鼠置于不锈钢托盘中。

用70%乙醇喷洒小鼠腹部和背部，以采集将用于获取细胞的骨骼。使用剪刀在后肢处的皮肤上剪出两个小切口，在镊子的辅助下脱位股骨，然后将小鼠倒置，沿纵轴剪开皮肤。暴露脊柱后，取出脊柱。

然后使用尖头剪刀，仔细清除脊柱上的所有软组织残留物。用纱布去除股骨和胫骨上的软组织残留物。

然后将骨骼放入含有30毫升添加补充物的RPMI培养基的50毫升锥形管中。在无菌研钵中放入数个四分之五的无菌滤膜。接着用镊子将骨骼转移至研钵中，并用另一层滤膜覆盖，以形成摩擦表面。

接下来，将一个40微米的细胞筛滤器放入50毫升的锥形管中。然后使用研杵研磨骨骼，直至获得均一的细胞悬液。再使用移液器将悬液转移至细胞滤器中。

接着，向研钵中加入 5 mL 新鲜的完全 RPMI 培养基，冲洗并收集剩余细胞，反复吹打。然后将 RPMI 培养基加入含有滤膜的离心管中。重复上述两个步骤，直至匀浆后的骨骼呈现透明状。

待溶液通过滤膜后，将其转移至新的50毫升离心管中，再次过滤并重复此过程以去除残留的组织碎片。离心：在4摄氏度下以500 × g离心5分钟，然后小心地通过吸除法移去上清液。注意不要扰动细胞沉淀。

该实验步骤的下一步是表征造血祖细胞的表型。首先，将每只小鼠的细胞沉淀用15毫升PBS加2%FBS重悬。然后在4°C条件下以500×g离心5分钟，并小心地通过抽吸去除上清液。

不要扰动沉淀。将沉淀重悬于5 mL PBS和2% FBS中，并使用血细胞计数仪计数细胞。确定细胞浓度后，将六分之一的细胞转移至96孔圆底板的每孔中。

然后以500 × g离心5分钟。在离心过程中，用PBS和2% FBS配制针对此处所列表面标志物的单克隆抗体混合液，用于细胞染色。离心结束后，通过倒置培养板弃去上清液，并向每孔加入50 µL抗体混合液。

然后使用多通道移液器反复吹打，使细胞解离成单细胞悬液。将细胞在4°C避光孵育20分钟，孵育后用150 µL PBS加2% FBS洗涤细胞两次。然后以500 × g离心5分钟。

然后通过倒置培养板弃去上清。接着，向每孔加入50 µL用含2% FBS的PBS稀释至1:300的AP三抗（大小为七的链霉亲和素标记抗体），并通过移液将细胞重悬为单细胞悬液。将细胞在4°C避光孵育10分钟，孵育结束后进行后续操作。

用 150 微升 PBS 和 2% FBS 将细胞洗涤两次，离心后弃去上清液 S，再将细胞重悬于 100 微升 PBS 和 2% FBS 中，通过流式细胞术分析样品。接下来，为了分选特定的造血细胞亚群，对骨髓细胞进行磁珠富集，以富集分泌阳性细胞。将来自至少 10 只小鼠的骨髓细胞沉淀重悬于 1 毫升缓冲液中，缓冲液中含有与 PC 偶联的 C kit 单克隆抗体，按 1:50 比例稀释。

孵育结束后，在4摄氏度避光条件下孵育细胞20分钟。用40毫升缓冲液洗涤细胞两次。离心后，通过抽吸小心去除上清液。

然后每只小鼠直接向沉淀中加入50 µL抗A PC磁珠。充分混匀，在4°C避光孵育20分钟。孵育后，像之前一样洗涤并离心细胞。然后每三只小鼠用4 mL缓冲液重新悬浮细胞沉淀，将最多LS柱置于合适的大容量分离器的磁场中。

用四升缓冲液冲洗柱子以进行准备。然后上样细胞悬液，并收集穿流而过的未标记细胞至收集管中。用缓冲液洗涤柱子三次，每次使用规定体积的缓冲液。

当柱子的储液槽排空后，加入新的缓冲液。待所有溶液流尽后，弃去流出液，将柱子从分离器上取下，分别置于15毫升锥形管上。立即向每根柱子中加入4毫升缓冲液，通过推动柱塞将磁标记细胞快速洗脱下来。

将离心管在500 × g条件下离心5分钟。小心地通过抽吸去除上清液。用1毫升缓冲液重悬每个沉淀，并将所有沉淀合并至一个15毫升的锥形离心管中。

在富集海克特阳性细胞群后，通过流式细胞术对细胞进行染色和分选。根据本视频所述，利用磁珠富集骨髓悬液中的海克特阳性细胞，并根据表面分子的表达情况分选长期造血干细胞（LT HSC）和短期造血干细胞（THSC）。该图展示了对常见淋巴样祖细胞（linin）进行电子门控分析的一个示例。

观察白细胞介素-7受体低表达的阳性细胞。Lin⁻ CD34⁺ SCAR1⁺ 以及 Lin⁻ CD34⁺ SCAR1⁺。来自CD34⁺门控的低表达细胞。

共同髓系祖细胞被鉴定为 FC gamma R.Low CD34 阳性细胞。此外，从 C-kit 阳性的粒细胞-单核细胞祖细胞被鉴定为 FC gamma 高表达、CD34 阳性细胞，而巨核细胞-红细胞祖细胞则被鉴定为 FC gamma 低表达、CD34 阴性细胞。LKS+细胞中的 L-T-H-S-C 和 S-T-H-S-C 分别被鉴定为 CD34 阴性和 CD34 阳性细胞。因此，获得了两种富集且高度纯化的细胞群体，这些细胞在生理状态下数量较少，可用于研究对照小鼠和炎症性肠病小鼠中自身免疫对造血作用的影响。

使用KI 67抗体和DPI进行染色，结果如图所示。在健康对照组的LKS CD34阴性造血干细胞区室中，几乎无法检测到处于细胞周期中的细胞。相比之下，在炎症性肠病（IBD）期间，相同细胞亚群显著增加，并且在细胞周期的S期和G2/M期可检测到大量造血干细胞。

因此表明，T细胞介导的慢性炎症决定了造血干细胞（HSCs）进入细胞周期。为了评估储存在囊泡中的ATP是否存在，对来自健康小鼠的CD34阴性细胞使用核酸结合化合物奎宁以及核红进行染色，并通过活细胞共聚焦显微镜分析，结果显示，在HSCs中可见细胞质内存在奎宁阳性囊泡，而在粒-单核前体细胞（GMPs）中则不可见。为进一步确定HSCs是否对细胞外ATP有反应，对经Fura-2负载并分选的造血干细胞施加ATP和离子霉素刺激，分析其钙离子反应，结果如图所示。单细胞钙离子升高轨迹表明，通过激活特异性的P2受体，长周期造血干细胞（LT-HSC）的胞质钙离子浓度增加。

当暴露于ATP时，由于细胞质内钙离子浓度升高会诱导囊泡释放ATP。本实验表明，ATP可能调控其自身从HSCs中的释放，并证明该方法可用于HSCs的功能研究。观看本视频后，您应能充分理解如何分离神经元顶端干细胞及谱系定向的祖细胞，以进行功能检测。在此操作基础上，还可进一步开展其他方法，例如对未辐照受体小鼠进行重建实验，以回答更多科学问题，如从静止状态或炎症环境中纯化的造血干细胞的重建潜能。