Name: 表型分析和分离小鼠造血干细胞和传承的承诺祖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习使用磁珠分选和流式细胞术从小鼠骨髓中分离和表征造血干细胞及祖细胞的方法。该技术可实现高纯度细胞的高效获取，适用于体外和体内功能研究。

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我们感谢 Nobuyuki Onai、Hitoshi Takizawa 和 Markus Manz 提供的宝贵建议。本工作由瑞士国家科学基金会、瑞士癌症联盟以及提契诺癌症研究基金会资助。

1. 从骨髓制备细胞悬液
<ol>
 <li>处死小鼠，将其置于不锈钢托盘中，并用70%乙醇喷洒其腹部和背部。采集后肢的股骨和胫骨，以及脊柱。</li>
 <li>用尖头剪刀仔细去除脊柱上的所有软组织残留物，用纱布去除腿骨上的软组织残留物。将骨骼置于含有30 mL RPMI培养基的50 mL Falcon离心管中，该培养基添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、50 μM β-巯基乙醇、100 μM MEM非必需氨基酸、1 mM MEM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素。</li>
 <li>用无菌滤纸覆盖预先灭菌的研钵底部。</li>
 <li>将骨骼转移至研钵中，并用一层滤纸覆盖，以形成摩擦表面。</li>
 <li>准备一个配有Falcon滤器的50 mL Falcon离心管。</li>
 <li>借助研杵捣碎骨骼，直至获得均一的细胞悬液。</li>
 <li>将悬液转移至离心管中。</li>
 <li>向研钵中加入5 mL新鲜的完全RPMI培养基，以洗涤并收集残留细胞。</li>
 <li>重复最后两个步骤，直至匀浆后的骨骼呈透明状。</li>
 <li>将细胞悬液转移并过滤至新的离心管中，以去除残留的组织碎片。</li>
 <li>在1,500 rpm条件下离心5分钟，小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
</ol>
2. 表型分析
<ol>
 <li>用 15 mL 的 PBS 和 2% FBS 重悬并洗涤单只小鼠的细胞。</li>
 <li>以 1,500 rpm 离心 5 分钟，小心吸弃上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
 <li>将沉淀重悬于 5 mL PBS 和 2% FBS 中，并进行细胞计数。</li>
 <li>将 1×106 个细胞/孔转移至 96 孔圆底板中。</li>
 <li>以 1,500 rpm 离心 5 分钟。</li>
 <li>配制针对以下表面标志物的单克隆抗体混合液。按照说明用 PBS 和 2% FBS 稀释，用于细胞染色。
 <ul type="disc">
 <li>CD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、Gr1、Ter119、NK1.1-PE-Cy5，1:200</li>
 <li>c-Kit-APC，1:100</li>
 <li>Sca1-生物素，1:50</li>
 <li>CD34-FITC，1:50</li>
 <li>FcγR-PE，1:100</li>
 <li>IL-7R-PE-Cy7，1:100</li>
 </ul>
 </li>
 <li>弃去上清液，每孔加入 50 μL 单克隆抗体混合液，通过移液将细胞解离为单细胞悬液。</li>
 <li>在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
 <li>用 150 μL PBS 和 2% FBS 洗涤细胞两次。</li>
 <li>以 1,500 rpm 离心 5 分钟，通过倒置培养板弃去上清液。</li>
 <li>按照说明用 PBS 和 2% FBS 稀释链霉亲和素，用于细胞染色。
 <ul type="disc">
 <li>链霉亲和素-APC-Cy7，1:300</li>
 </ul>
 </li>
 <li>每孔加入 50 μL 染色液，通过移液将细胞解离为单细胞悬液。</li>
 <li>在 4 °C 避光孵育 10 分钟。</li>
 <li>用 150 μL PBS 和 2% FBS 洗涤细胞两次。</li>
 <li>以 1,500 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
 <li>将细胞重悬于 100 μL PBS 和 2% FBS 中。</li>
 <li>在流式细胞仪（FACS）上检测样品。</li>
</ol>
3. c-Kit+ 细胞的磁珠富集
<ol>
 <li>配制含有 PBS（pH 7.2）、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA 的缓冲液。</li>
 <li>将来自至少 10 只小鼠的骨髓细胞沉淀重悬于 1 mL 缓冲液中，该缓冲液中含有以 1:50 稀释的 APC 标记的 c-Kit 单克隆抗体（mAb）。</li>
 <li>在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
 <li>用 40 mL 缓冲液洗涤细胞两次。</li>
 <li>以 1,500 rpm 离心 5 分钟，并小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
 <li>重悬细胞沉淀，并为每只处死的小鼠直接向沉淀中加入 50 μL Anti-APC MicroBeads。</li>
 <li>充分混匀后，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
 <li>加入 40 mL 缓冲液洗涤细胞，然后以 1,500 rpm 离心 5 分钟，彻底吸除上清液。</li>
 <li>每处死三只小鼠，将细胞沉淀重悬于 4 mL 倍数的缓冲液中。</li>
 <li>将 MACS LS 柱置于合适的 MACS 分离器的磁场中。每处死三只小鼠使用一根柱子。</li>
 <li>用 4 mL 缓冲液冲洗柱子以进行预处理。</li>
 <li>将细胞悬液加至柱子上。</li>
 <li>收集未标记的流穿细胞，并用 4 mL 缓冲液洗涤柱子。洗涤步骤共进行三次，每次加入 4 mL 缓冲液。当柱子储液室排空后，再加入新的缓冲液。</li>
 <li>从分离器上取下柱子，并将每根柱子放置于 15 mL Falcon 管上方。</li>
 <li>向每根柱子中加入 4 mL 缓冲液，立即通过推动柱塞将磁性标记的细胞冲洗下来。</li>
 <li>以 1,500 rpm 离心 5 分钟，并小心吸除上清液。</li>
 <li>将每个沉淀用 1 mL 缓冲液重悬，并将所有沉淀合并至一个 15 mL Falcon 管中。</li>
</ol>
4. 造血干细胞与谱系定向祖细胞的分选
<ol>
 <li>准备针对以下表面标志物的单克隆抗体（mAb）混合物。按照指示将其稀释于500 μL PBS和2% FBS中，用于细胞染色。
 <ul type="disc">
 <li>CD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、Gr1、Ter119、NK1.1偶联PE-Cy5，1:200</li>
 <li>c-Kit偶联APC，1:100</li>
 <li>Sca-1偶联生物素，1:50</li>
 <li>CD34偶联FITC，1:50</li>
 <li>FcγR偶联PE，1:100</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将上一步骤中的离心管在1,500 rpm下离心5分钟，并通过抽吸小心去除上清液。</li>
 <li>将单克隆抗体混合液加入细胞沉淀中。通过移液将细胞重悬并解离为单细胞悬液。</li>
 <li>将细胞在4 °C避光孵育20分钟。</li>
 <li>用14 mL PBS和2% FBS洗涤细胞两次。</li>
 <li>将离心管在1,500 rpm下离心5分钟，并弃去上清液。</li>
 <li>按照说明将链霉亲和素稀释于500 μL PBS和2% FBS中，用于细胞染色。
 <ul type="disc">
 <li>链霉亲和素偶联APC-Cy7，1:300</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将溶液加入离心管中。通过移液将细胞解离为单细胞悬液。</li>
 <li>将细胞在4 °C避光孵育10分钟。</li>
 <li>用14 mL PBS和2% FBS洗涤细胞两次。</li>
 <li>将离心管在1,500 rpm下离心5分钟，并弃去上清液。</li>
 <li>将细胞重悬于500 μL PBS和2% FBS中。</li>
 <li>将细胞悬液转移并过滤至新的5 mL离心管中，以去除可能干扰分选过程的细胞团块。</li>
 <li>向细胞悬液中加入5 μL 7-AAD（使用时稀释1:100），以排除7-AAD+死细胞，确保分选群体的活性。</li>
 <li>使用BD FACSAria根据以下表型分选细胞：
 <ul type="disc">
 <li>LKS细胞：lin- c-Kit+ Sca-1+</li>
 <li>LT-HSCs：LKS CD34-</li>
 <li>ST-HSCs：LKS CD34+</li>
 <li>GMPs：lin- c-Kit+ Sca-1low FcγRhigh CD34+</li>
 <li>MEPs：lin- c-Kit+ Sca-1low FcγRlow CD34-</li>
 <li>CMPs：lin- c-Kit+ Sca-1low FcγRlow CD34+</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
5. 代表性结果
图1展示了电子门控方法的一个示例，用于鉴定常见的淋巴样祖细胞（CLPs），其表型为 Lin-/c-Kitlo/白细胞介素（IL）-7R+ 细胞；Lin-/c-Kit+/Sca-1+（LKS）细胞和 Lin-/c-Kit+/Sca-1lo（c-Kit+）细胞；从 c-Kit+ 门控中，常见的髓系祖细胞（CMPs）被鉴定为 FcγRloCD34+ 细胞，粒细胞/单核细胞祖细胞（GMPs）为 FcγRhiCD34+ 细胞，巨核细胞/红细胞祖细胞（MEPs）为 FcγRloCD34- 细胞；从 LKS 门控中，长周期造血干细胞（LT-HSC）和短周期造血干细胞（ST-HSC）分别被鉴定为 CD34- 和 CD34+ 细胞。该骨髓细胞悬液可通过磁珠法富集 c-Kit+ 细胞（图2）；随后可根据 CD34 的表达水平分选出 LT-HSC 和 ST-HSC，以及其他具有上述表型的祖细胞。
如图4所示，可通过活体成像共聚焦显微镜分析造血干细胞（HSCs），其中CD34-细胞使用核酸结合化合物奎纳克林11以及核红色荧光染料DRAQ5进行染色。在HSCs中可见细胞质内存在奎纳克林阳性囊泡，而在粒细胞-单核细胞前体细胞（GMPs）中则不可见12。此外，分选后的HSCs可用于功能实验，如图5所示，该图展示了长期造血干细胞（LT-HSC）在暴露于三磷酸腺苷（ATP）和离子霉素后，嘌呤能P2受体被激活，导致胞质内Ca2+浓度升高12。
<img alt="流式细胞术示意图；使用SSC-A、FSC-A、Sca-1、c-Kit标记进行细胞分选；造血分析。" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. Lin- 骨髓细胞的代表性点图分析。通过流式细胞仪进行电子门控，以鉴定和定量骨髓细胞悬液中的造血祖细胞和造血干细胞，细胞染色方法详见实验方案正文。
<img alt="c-Kit+ 细胞富集示意图、骨髓分离、磁珠分离、磁场应用。" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 从小鼠骨髓中选择性富集 c-Kit+ 细胞的示意图。
<img alt="流式细胞术示意图；细胞周期各时相 G0、G1、S/G2/M；Ki67 和 DAPI 染色分析。" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 健康对照组及炎症性肠病（IBD）小鼠中经电子门控的 LKS CD34- 造血干细胞（HSCs）的细胞周期分析，使用 Ki-67 抗体与 DAPI 染色。细胞经 Lyse/Fix 和 Perm 缓冲液固定和透化处理后，用 FITC 标记的 Ki-67 抗体和 1 μg/ml 的 DAPI 进行染色。在健康对照组的 LKS CD34- HSCs 群体中，几乎无法检测到处于增殖周期的细胞12。
<img alt="用Quinacrine和DRAQ5染色的HSC和GMP细胞分析的荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 经FACS分选的CD34-造血干细胞（HSCs）和粒细胞-单核细胞前体细胞（GMPs）经核酸结合化合物Quinacrine和核红色荧光染料（DRAQ5）染色后的活细胞共聚焦显微成像。右上角的小方框显示在HSCs的细胞质中检测到Quinacrine阳性囊泡，而在GMPs中未观察到。
<img alt="钙信号图，ATP 和离子霉素反应，荧光数据分析。" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图 5. 分选后的造血干细胞（HSCs）负载 Fura-2 后，经 ATP 和离子霉素刺激所引发的胞质 Ca2+ 升高。图中显示单个细胞的信号轨迹。所有细胞均对细胞外 ATP 产生反应，在加入 ATP 后胞质 Ca2+ 显著升高。

<ol><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+units+of+development%2C+units+of+regeneration%2C+and+units+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li>
<li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie2%2Fangiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li>
<li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li>
<li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li>
<li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+%28HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157(2007).</li>
<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine%2Fparacrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts%3A+contribution+of+vesicular+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li>
<li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li>
<li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li>
<li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方法可实现对单只小鼠造血过程的快速且准确的分析（图1）。该方法适用于多种实验条件，包括炎症、自身免疫、免疫缺陷、退行性疾病、代谢紊乱和癌症等小鼠模型，可用于研究病理状态对造血过程的影响。图3展示了通过Ki-67单克隆抗体和DAPI染色，对健康小鼠和炎症性肠病（IBD）小鼠经电子门控分选的LKS CD34-细胞进行的细胞周期活性分析13。结果显示，后者细胞周期S/G2/M期的细胞比例显著增加。该流式细胞术分析表明，T细胞介导的炎症会影响造血干细胞（HSC）的周期活性12。 
通过结合磁性标记富集表达c-Kit的骨髓细胞与流式细胞术分选，可获得高度纯化的造血谱系前体细胞和HSCs。所获得的细胞群体可用于多种实验，以研究细胞生物学（图4）、信号转导（图5）、发育调控的基因表达，以及不同细胞亚群的体外（in vitro）和体内（in vivo）功能潜...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>42401</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100X</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（PenStrep）</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 染色液</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>裂解/固定缓冲液（Lyse/Fix buffer）</td><td>BD Pharmingen</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>Perm buffer III</td><td>BD Pharmingen</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>BD Pharmingen</td><td>556026</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>150041</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>150081</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>150031</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>150452</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (6D5)</td><td>eBioscience</td><td>150193</td><td></td></tr><tr><td>Gr1 (RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>155931</td><td></td></tr><tr><td>Tre119 (TER-119)</td><td>eBioscience</td><td>155921</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1 (PK136)</td><td>eBioscience</td><td>455941</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit (2B8)</td><td>eBioscience</td><td>171171</td><td></td></tr><tr><td>Sca-1 (D7)</td><td>eBioscience</td><td>135981</td><td></td></tr><tr><td>CD34 (RAM34)</td><td>eBioscience</td><td>110341</td><td></td></tr><tr><td>Fc&amp;#947;R (2.4G2)</td><td>eBioscience</td><td>553145</td><td></td></tr><tr><td>抗 APC 微珠（Anti-APC MicroBeads）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱（LS Columns）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

骨髓是成年有机体中造血干细胞（HSCs）以及更成熟的血细胞谱系前体细胞定居和分化的首要场所。HSCs 是一类极少量的多能细胞群体，具有终生产生所有血细胞谱系的能力1。对骨髓中 HSCs 稳态的分子机制进行解析，在造血生物学、肿瘤学和再生医学领域具有重要意义。本文描述了使用荧光标记抗体进行标记以及在流式细胞术中进行电子门控的操作流程，用于分析单只小鼠中造血前体细胞亚群及 HSCs 的分布情况（图 1）。此外，我们还介绍了一种通过磁性富集表达 c-Kit 的细胞，从混合的骨髓细胞悬液中大规模富集造血前体细胞以及长期（LT）和短期（ST）重建能力的 HSCs 的方法。所获得的细胞样品可用于分选特定亚群，以开展体外和体内功能研究（图 2）。
骨小梁成骨细胞2,3和窦状内皮4共同构成了支持骨髓中造血干细胞（HSCs）的功能性微环境。在成骨细胞微环境中，多种机制共同决定HSCs的静息状态，包括一部分表达N-钙黏蛋白（N-cadherin+）的成骨细胞3，以及HSCs中表达的受体酪氨酸激酶Tie2与其配体血管生成素-1之间的相互作用5。骨髓中的“冬眠”状态对于保护HSCs免于过度增殖循环所导致的复制性耗竭至关重要6。来自先天免疫系统细胞的外源性刺激，例如Toll样受体配体7和干扰素-α6，也可诱导HSCs增殖并分化为特定谱系的前体细胞。最近已有研究描述了一群处于静息状态的小鼠HSCs，其属于lin-c-Kit+Sca-1+CD150+CD48-CD34-细胞群体8。如本文所述，通过CD34表达对富集造血前体细胞的悬浮液进行分选，可分离出具有自我更新能力的静息型长期造血干细胞（LT-HSCs）以及短期造血干细胞（ST-HSCs）9。此前已有类似方法报道，即通过去除谱系阳性细胞，并利用CD48和Flk2抗体分选LT-HSCs10。本报告中，我们提供了一种用于造血前体细胞表型鉴定及体外细胞周期分析的实验方案，可用于监测不同生理和病理条件下造血过程的变化。此外，我们还描述了一种HSCs的流式细胞分选（FACS）操作流程，可用于细胞生物学和信号转导实验中调控HSC自我更新、扩增和分化相关因子与机制的研究，亦可用于移植实验。

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。

骨髓是成年有机体中造血干细胞（HSCs）以及更成熟的血细胞谱系前体细胞驻留和分化的首要场所。HSCs ...

本视频演示了一种利用磁珠分离和荧光激活细胞分选技术来分离并进行表型表征造血祖细胞的实验方案。首先，从小鼠身上解剖取出后肢、股骨、胫骨和脊髓，并进行匀浆处理以制备骨髓细胞悬液。随后，使用磁性微珠富集表达 c-kit 的细胞群体。对富集细胞群体的流式细胞分析表明，该方法可获得高度纯化的造血系细胞、祖细胞及造血干细胞，可用于体外和体内功能研究。与现有的骨髓冲洗等方法相比，该技术的主要优势在于能够更高效、更快速地回收骨髓细胞。该技术的应用前景涵盖炎症、自身免疫、免疫缺陷、退行性疾病、代谢紊乱以及癌症免疫模型的治疗或诊断，因为它能够实现对造血祖细胞的表型鉴定及体外功能分析。因此，该方法可为不同生理和病理条件下造血过程的监测提供见解。它还可用于研究不同前体细胞亚群中的细胞生物学信号转导及发育调控的基因表达。首先将已处死的小鼠置于不锈钢托盘中。用70%乙醇喷洒小鼠腹部和背部，以采集将用于获取细胞的骨骼。使用剪刀在后肢处的皮肤上剪出两个小切口，在镊子的辅助下脱位股骨，然后将小鼠倒置，沿纵轴剪开皮肤。暴露脊柱后，取出脊柱。然后使用尖头剪刀，仔细清除脊柱上的所有软组织残留物。用纱布去除股骨和胫骨上的软组织残留物。然后将骨骼放入含有30毫升添加补充物的RPMI培养基的50毫升锥形管中。在无菌研钵中放入数个四分之五的无菌滤膜。接着用镊子将骨骼转移至研钵中，并用另一层滤膜覆盖，以形成摩擦表面。接下来，将一个40微米的细胞筛滤器放入50毫升的锥形管中。然后使用研杵研磨骨骼，直至获得均一的细胞悬液。再使用移液器将悬液转移至细胞滤器中。接着，向研钵中加入 5 mL 新鲜的完全 RPMI 培养基，冲洗并收集剩余细胞，反复吹打。然后将 RPMI 培养基加入含有滤膜的离心管中。重复上述两个步骤，直至匀浆后的骨骼呈现透明状。待溶液通过滤膜后，将其转移至新的50毫升离心管中，再次过滤并重复此过程以去除残留的组织碎片。离心：在4摄氏度下以500 × g离心5分钟，然后小心地通过吸除法移去上清液。注意不要扰动细胞沉淀。该实验步骤的下一步是表征造血祖细胞的表型。首先，将每只小鼠的细胞沉淀用15毫升PBS加2%FBS重悬。然后在4°C条件下以500×g离心5分钟，并小心地通过抽吸去除上清液。不要扰动沉淀。将沉淀重悬于5 mL PBS和2% FBS中，并使用血细胞计数仪计数细胞。确定细胞浓度后，将六分之一的细胞转移至96孔圆底板的每孔中。然后以500 × g离心5分钟。在离心过程中，用PBS和2% FBS配制针对此处所列表面标志物的单克隆抗体混合液，用于细胞染色。离心结束后，通过倒置培养板弃去上清液，并向每孔加入50 µL抗体混合液。然后使用多通道移液器反复吹打，使细胞解离成单细胞悬液。将细胞在4°C避光孵育20分钟，孵育后用150 µL PBS加2% FBS洗涤细胞两次。然后以500 × g离心5分钟。然后通过倒置培养板弃去上清。接着，向每孔加入50 µL用含2% FBS的PBS稀释至1:300的AP三抗（大小为七的链霉亲和素标记抗体），并通过移液将细胞重悬为单细胞悬液。将细胞在4°C避光孵育10分钟，孵育结束后进行后续操作。用 150 微升 PBS 和 2% FBS 将细胞洗涤两次，离心后弃去上清液 S，再将细胞重悬于 100 微升 PBS 和 2% FBS 中，通过流式细胞术分析样品。接下来，为了分选特定的造血细胞亚群，对骨髓细胞进行磁珠富集，以富集分泌阳性细胞。将来自至少 10 只小鼠的骨髓细胞沉淀重悬于 1 毫升缓冲液中，缓冲液中含有与 PC 偶联的 C kit 单克隆抗体，按 1:50 比例稀释。孵育结束后，在4摄氏度避光条件下孵育细胞20分钟。用40毫升缓冲液洗涤细胞两次。离心后，通过抽吸小心去除上清液。然后每只小鼠直接向沉淀中加入50 µL抗A PC磁珠。充分混匀，在4°C避光孵育20分钟。孵育后，像之前一样洗涤并离心细胞。然后每三只小鼠用4 mL缓冲液重新悬浮细胞沉淀，将最多LS柱置于合适的大容量分离器的磁场中。用四升缓冲液冲洗柱子以进行准备。然后上样细胞悬液，并收集穿流而过的未标记细胞至收集管中。用缓冲液洗涤柱子三次，每次使用规定体积的缓冲液。当柱子的储液槽排空后，加入新的缓冲液。待所有溶液流尽后，弃去流出液，将柱子从分离器上取下，分别置于15毫升锥形管上。立即向每根柱子中加入4毫升缓冲液，通过推动柱塞将磁标记细胞快速洗脱下来。将离心管在500 × g条件下离心5分钟。小心地通过抽吸去除上清液。用1毫升缓冲液重悬每个沉淀，并将所有沉淀合并至一个15毫升的锥形离心管中。在富集海克特阳性细胞群后，通过流式细胞术对细胞进行染色和分选。根据本视频所述，利用磁珠富集骨髓悬液中的海克特阳性细胞，并根据表面分子的表达情况分选长期造血干细胞（LT HSC）和短期造血干细胞（THSC）。该图展示了对常见淋巴样祖细胞（linin）进行电子门控分析的一个示例。观察白细胞介素-7受体低表达的阳性细胞。Lin⁻ CD34⁺ SCAR1⁺ 以及 Lin⁻ CD34⁺ SCAR1⁺。来自CD34⁺门控的低表达细胞。共同髓系祖细胞被鉴定为 FC gamma R.Low CD34 阳性细胞。此外，从 C-kit 阳性的粒细胞-单核细胞祖细胞被鉴定为 FC gamma 高表达、CD34 阳性细胞，而巨核细胞-红细胞祖细胞则被鉴定为 FC gamma 低表达、CD34 阴性细胞。LKS+细胞中的 L-T-H-S-C 和 S-T-H-S-C 分别被鉴定为 CD34 阴性和 CD34 阳性细胞。因此，获得了两种富集且高度纯化的细胞群体，这些细胞在生理状态下数量较少，可用于研究对照小鼠和炎症性肠病小鼠中自身免疫对造血作用的影响。使用KI 67抗体和DPI进行染色，结果如图所示。在健康对照组的LKS CD34阴性造血干细胞区室中，几乎无法检测到处于细胞周期中的细胞。相比之下，在炎症性肠病（IBD）期间，相同细胞亚群显著增加，并且在细胞周期的S期和G2/M期可检测到大量造血干细胞。因此表明，T细胞介导的慢性炎症决定了造血干细胞（HSCs）进入细胞周期。为了评估储存在囊泡中的ATP是否存在，对来自健康小鼠的CD34阴性细胞使用核酸结合化合物奎宁以及核红进行染色，并通过活细胞共聚焦显微镜分析，结果显示，在HSCs中可见细胞质内存在奎宁阳性囊泡，而在粒-单核前体细胞（GMPs）中则不可见。为进一步确定HSCs是否对细胞外ATP有反应，对经Fura-2负载并分选的造血干细胞施加ATP和离子霉素刺激，分析其钙离子反应，结果如图所示。单细胞钙离子升高轨迹表明，通过激活特异性的P2受体，长周期造血干细胞（LT-HSC）的胞质钙离子浓度增加。当暴露于ATP时，由于细胞质内钙离子浓度升高会诱导囊泡释放ATP。本实验表明，ATP可能调控其自身从HSCs中的释放，并证明该方法可用于HSCs的功能研究。观看本视频后，您应能充分理解如何分离神经元顶端干细胞及谱系定向的祖细胞，以进行功能检测。在此操作基础上，还可进一步开展其他方法，例如对未辐照受体小鼠进行重建实验，以回答更多科学问题，如从静止状态或炎症环境中纯化的造血干细胞的重建潜能。

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科研

JoVE Journal

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生物学

表型分析和分离小鼠造血干细胞和传承的承诺祖

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

本视频展示了如何从胚胎中显微解剖卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区域，并利用流式细胞术分选造血干细胞。...

从小鼠卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区分离早期造血干细胞

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。...

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。...

长期与短期造血干细胞的分离方法

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

学习使用磁珠分选和流式细胞术从小鼠骨髓中分离和表征造血干细胞及祖细胞的方法。该技术可实现高纯度细胞的高效获取，适用于体外和体内功能研究。

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

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