微型计算机断层扫描成像制备小鼠冠状动脉血管逆行灌注和灌装

该程序的总体目标是用不透射线的染料填充冠状动脉脉管系统，为显微计算机断层扫描或显微 CT 成像做准备。首先，打开小鼠的腹腔，将腹主动脉插管。然后用血管舒张缓冲液灌注脉管系统，然后用 AFF 固定剂灌注。

然后连接血管以引导 PERFUSE 8，并堵塞潜在的泄漏点。最后，冠状动脉充满不透射线的染料。冠状动脉脉管系统的完全充盈可以通过心脏的视觉分析或通过显微 CT 成像和分析来评估。

尽管这种方法可以深入了解冠状动脉脉管系统、分支模式以及血管阻塞和其他冠状动脉疾病。它也可以应用于其他器官系统（如大脑、肾脏或后肢）中的其他血管网络。这种方法的视觉演示至关重要，因为血管连接步骤很难学习。

如果您不熟悉血管解剖结构，那么在周围组织中找到并系扎正确的血管也可能具有挑战性。在开始该程序之前，用血管扩张剂缓冲液填充压力灌注仪的一侧，用 PBS 中的 4% 多聚醛填充另一侧。接下来，用 29 号半英寸针头填充半 CC 胰岛素注射器，其中装有 0.1 毫升 1 至 100 肝素。

然后将针弯曲到大约 120 度角，斜面向上。最后，用 26 号半英寸针头填充 1 毫升注射器和 0.4 毫升饱和氯化钾溶液，然后将针头弯曲至 120 度，如刚才所示。麻醉小鼠并将动物腹侧向上固定在解剖盘上后，用乙醇喷洒动物，直到它们的毛发湿润。

然后用中线切口打开腹腔。缩回皮肤以露出器官，并将肠道移至一侧，以便可进入后静脉 CVA 或 PVC。根据需要清除所有脂肪或结缔组织，然后将准备好的肝素溶液注入 PVC。

当你拔出针头时。用棉签涂抹器盖住针孔以防止泄漏，并将涂抹器保持在原位几秒钟，直到 PVC 壁凝结并密封。等待 2 到 3 分钟让肝素在整个小鼠循环中分散后，解剖隔膜和肋骨，以便可以看到剧烈跳动。

然后将准备好的氯化钾溶液慢慢注入 PVC 中，直到心脏停止跳动。接下来，在隔膜水平附近切割 PVC，以便在后续步骤中易于定位靠近心脏的部分。然后切除隔膜下方的所有器官并切除小鼠的后部。

现在找到主动脉的切割端，将一根长长的六段零编织丝缝合线折叠回主动脉下方，距离切割端前方几毫米。剪断这根长缝合线，使主动脉下有两根。最后，将导管插入主动脉的切口端，并用双结打结每根缝合线，以将导管固定到位并防止主动脉内的任何背压泄漏。

首先将压力灌注仪连接到导管。然后将灌注仪泵送至 100 至 110 毫米汞柱的驱动压力，以用血管扩张缓冲液灌注血管。确认液体从 PVC 中流出，同时等待液体清澈，确保缓冲液通过冠状动脉

解剖肋骨并固定胸腔以露出心脏。暴露后，挤压将缓冲液从浸有缓冲液的纱布上滴到心脏上，以防止其变干。清除胸腺。

暴露主动脉弓 血管结扎是该程序中最困难的一个方面。对于初学者来说，找到附着在主动脉弓上的血管可能非常令人沮丧，但是一旦了解了血管的解剖结构，即使无法通过脂肪和其他结缔组织清楚地看到血管，人们也会学会相信血管就在那里。缝合需要耐心和稳定的手，但这项技能会随着练习而变得更容易。

然后使用 6 个零段编织丝缝合线，三个主要主动脉分支，以确保液体通过冠状动脉分流，而不是通过这些较大的低阻力血管。接下来，用固定剂灌注心脏 15 分钟。然后用血管舒张缓冲液冲洗至少两分钟。

同时，为防止注射后微填充物从心脏泄漏出，结扎第一前腔静脉，然后结扎第二前腔静脉。在 PVC 和主动脉周围缝合，但在填充之前不要拧紧它们。准备 microfill 并将其装入 1 毫升注射器后，用 F 水填充解剖托盘以覆盖导管。

现在，断开灌注仪与导管的连接并连接 microfill 注射器。将 microfill 注射到主动脉中。它首先会充满动脉，然后溢出到毛细血管中，导致组织与微填充物的颜色齐平。

请注意微填充物的疏水性如何导致它在从较小的容器中出来时最初显示为独立的球体。当微填充物在容器内连续并通过 PVC 流出时，完全填充是显而易见的。填充完成后，迅速拧紧 PVC 和主动脉周围的缝合线，以防止心脏组织的弹性将微填充物挤出血管。

在聚合过程中避免对心脏施加任何外部压力，例如抬起或转动心脏，以试图及早看到心脏后部充满的血管。然后将一些纱布浸泡在解剖盘中的水中，并用纱布盖住心脏以防止其变干。让心脏在室温下静置约 1 小时，直到 microfill 聚合。

最后，取出心脏并在 4 摄氏度下用 4% PFA 固定过夜。然后将心脏移入 70% 乙醇中并储存在 4 摄氏度。通过 microfill 有效灌注的血管将在整个血管中具有连续不间断的 microfill。

如第一张图所示，冠状动脉血管的充盈程度可以通过肉眼判断。叶脉位置清晰，很容易观察到，如箭头所示。心肌内更紧密的动脉也可以通过心脏表面看到，此处用箭头表示。

毛细血管充盈也很明显。观察这个图中心脏的毛细血管密集区域，如星星所表示。有时，阻塞可能会阻止部分血管床的填充。

因此，由于缺乏微填充，任何无法填充的血管网络都将很明显，如此处用箭头表示。Microfill 中可能会发生进一步的中断，例如，用星号表示。如果在 microfill 给药过程中使用的压力过小，也会导致填充不完全，因为 microfill 不会被迫进入所有毛细管网络。

请注意组织如何没有呈现 microfill 的黄色，表明 microfill 没有渗透到毛细血管中。相反，压力过大会导致毛细血管破裂并渗出微充盈到周围组织中，如箭头所示。在尝试此程序时，重要的是要记住不要太快或压力太大地注射微填充物，因为血管会破裂并破坏血管管型。

遵循显微 CT 扫描中的程序。可以进行其他方法，如免疫组织化学分析，以回答其他问题并更好地表征血管和周围组织。