从小份人血样本中单核细胞和树突状细胞谱系特异性Toll样受体介导信号通路的定量成像

以下实验的总体目标是展示如何利用成像流式技术，对来自明确患者队列的原代免疫细胞的细胞机制进行定量分析。该目标首先通过从患者或健康志愿者的血液样本中分离外周血单个核细胞（pbmc）来实现。分离后，细胞被激活并进行荧光标记。

接下来，细胞通过流体动力学聚焦，用激光激发，并在时间延迟积分CCD相机上成像。最后，利用图像流式细胞仪获取图像，并对NF-κB进行定量分析。

使用 Ideas 软件对每张细胞图像进行转位分析。最终，通过分析点图、直方图和细胞图像，可以确定各受试组之间的差异。成像流式细胞术的优势在于它结合了定量数据与免疫荧光信息。

我们能够以谱系特异性的方式研究细胞信号通路，无论是单个细胞还是细胞群体，且仅需少量血液样本即可开始。该方法有助于通过定位和定量信号中间分子来解答知识领域的关键问题。例如，可用于研究由作用介导的转录因子核转位，或考察衰老对细胞生物学的影响。

我实验室的一名负责人将在分离自人类志愿者获取的外周血单个核细胞后，演示该技术。将获得的外周血单个核细胞以每0.6毫升培养基含3×10⁶个细胞的密度重悬，并将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。接着，使用一种激活剂（例如图中所示的TLR8激动剂LAR848）刺激部分细胞，然后将所有细胞置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育10至60分钟。

孵育结束后，在室温下以500 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，加入针对单核细胞或树突状细胞谱系的表面抗体混合物，在4摄氏度下标记细胞20分钟，同时设置仅标记单色偶联抗体的细胞管作为补偿对照。随后在室温下用4% PFA-PBS固定细胞10分钟。在室温下以500 × g离心10分钟后，将PBMC重悬于冻存缓冲液中，于-80摄氏度保存，直至检测当天进行分析。

将细胞在37摄氏度水浴中快速解冻，离心去除冻存缓冲液后，加入100微升BD破膜洗涤缓冲液进行破膜处理。然后在室温下用抗细胞内信号分子抗体（如本实验所示的抗NF-κB p65抗体）孵育20分钟。离心沉淀细胞后，将细胞重悬于含山羊抗兔IgG的100微升BD破膜洗涤缓冲液中。

使用 Alexa 647 标记，并在室温下再孵育 PBMC 20 分钟。成像前立即用核染料对细胞进行复染，首先启动 ImageStream 电源，然后运行 INSPIRE 软件。接着，单击“加载默认模板”，然后选择“初始化流路系统”。

然后点击图像库菜单并选择全部。现在按运行设置以开始对微珠成像，接着选择明场通道。当速度微珠开始运行后，在辅助选项卡下点击“全部开始”以校准并测试仪器。

在 ImageStream 系统完成校准后，按下冲洗、锁定并加载，将最亮的样本载入仪器。然后调节激光功率，使每种荧光染料在点图中测得的最大像素值介于 104,000 计数之间。随后设定细胞分类标准。

现在点击运行，采集以收集并保存实验数据文件，首先打开 Ideas 分析软件。使用分析软件创建补偿后的图像文件，然后根据正常的细胞核染料强度和较高的细胞核染料长宽比对事件进行设门。为了在 R1 设门中将单个细胞与碎片或多细胞事件区分开来，单核细胞位于 CD14 阳性细胞的设门区域内，而髓系树突状细胞则位于 R3 设门中，其特征为 CD11c 高表达、CD4 低表达以及 lin-1 标记物低表达。

最后，使用 Ideas 软件分析细胞质转录因子 NF kappa B 与核染料的共定位情况。NF kappa B 与核染料之间高度相关，表明两种标记物存在共定位，这反映在较高的相似性评分上，并提示细胞的活化程度。可通过比较不同处理组或患者群体间高相似性事件的百分比，来评估细胞功能活性的相对效率。

随后可使用软件显示来自群体直方图关键区段的细胞图像。ImageStream 可直接从外周血单个核细胞（pbmc）中设门分选细胞亚群，并对设门后但未分选的细胞群体进行细胞反应成像。此处定量分析了在基础状态下 TLR 信号对 lin one 阴性、CD four 弱阳性、CD 11 C 阳性髓系树突状细胞中 NF kappa BP 65 核转位的影响。

在未受刺激的细胞中，观察到有较高比例的细胞其转录因子NF kappa BP 65位于细胞质内。刺激后，经处理的细胞显示出NF Kappa BP 65与核染料PI之间显著更高的相似性评分，表明NF Kappa BP 65在刺激后转位进入细胞核。同时采集的未处理组或R 8 48刺激组细胞群体的数字图像展示了代表性细胞以及NF kappa B转入细胞核的强度。请注意，与未处理细胞相比，R 8 48刺激组中NF Kappa B和PI在细胞核内的染色强度更高。

我们已在来自不同年龄供体的细胞中应用了该技术，并揭示了TLR介导的NF-κB激活通路的差异。一旦掌握，该技术可在一天内完成，另需额外时间进行图像分析，从而同时获得多种定位图像和群体统计结果。此外，我们可直接对多个细胞群体的反应进行成像，而无需物理分离。成像流式技术可广泛应用于多种细胞机制研究，在转化医学研究中具有重要价值。