Name: 定量成像小样本人体血液中单核细胞和树突状细胞系特定的Toll样受体介导的信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解如何使用ImageStream技术定量分析小样本人体血液中单核细胞和树突状细胞的Toll样受体介导信号通路。该方法结合流式细胞术与高分辨率成像，可在单细胞水平精确定量NF-κB核转位，为免疫学和转化医学研究提供有力工具。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）（N01 HHSN272201100019C、U19 AI 089992 和 NCRR/GCRC 项目 M01-RR00125）的支持。作者声明不存在竞争性财务利益，并感谢耶鲁大学细胞分选核心设施主任 Mark Shlomchik 博士。

1. 免疫细胞的分离与刺激
<ol>
	<li>根据当地机构审查委员会的指南，在获得健康志愿者书面知情同意后，采集 10–50 ml 肝素抗凝血。对于衰老或疾病发病机制的研究，必须明确界定每位志愿者或患者的纳入与排除标准。</li>
	<li>使用 CPT 管或 Ficoll-Paque Plus 分离人外周血单个核细胞（PBMCs），操作按照制造商说明进行（GE Healthcare, NJ），并在分离当天进行实验7（试剂，表 1）。</li>
	<li>将 PBMCs（每管 3 × 106 个细胞）置于 1.5 ml 管中，加入 0.6 ml 培养基单独孵育，或用 TLR 配体或其他激活剂刺激，例如 TLR7/8 配体 R848（0.6 ml 培养基加 0.6 μl 10 mM TLR7/8 配体 R848，终浓度为 10 μM），于 37 °C 孵育 10–60 分钟（InvivoGen, CA）9。</li>
</ol>
2. 细胞标记
<ol>
	<li>使用荧光标记的抗体对活细胞悬液中的细胞谱系及其他表面标志物进行标记。在1.5 ml离心管中，将3 × 106个PBMCs与单核细胞或树突状细胞谱系特异性表面抗体混合物（表2）在100 μl PBS/2% FBS中、4 °C条件下孵育20分钟。最佳抗体稀释比例可通过预实验确定，样品应分批处理以尽量减少批间差异。对于浓度为0.1 mg/ml的供应商抗体原液，使用5 μl抗体（1:20稀释）。另设单独的细胞管，仅用单一荧光标记的抗体染色，用于设定仪器的荧光通道。</li>
	<li>表面标记完成后，在室温下用4% PFA/PBS固定细胞10分钟。若需在检测前储存样品，则在500 × g条件下离心，将细胞重悬于冷冻保存液（含10% DMSO的90% FBS）中，并于-80 °C保存至检测当日。</li>
	<li>为进行分析，应将一组供体来源的未处理与刺激处理的细胞样本同时处理，以减少实验变异性。检测当天，将细胞在37 °C水浴中快速解冻，并在500 × g条件下离心以去除冷冻保存液。</li>
	<li>为通透细胞以检测细胞内细胞因子或其他标志物，将细胞悬液重悬于100 μl BD Perm/Wash缓冲液（BD Biosciences, NJ）中。使用例如1:20稀释的兔抗NF-κB（p65）抗体（终浓度10 μg/ml，SantaCruz Biotechnology, CA）在室温下孵育20分钟标记细胞内信号分子，随后在500 × g条件下离心，吸除上清液，再将细胞重悬于含1:250稀释的山羊抗兔IgG-Alexa647（Invitrogen, CA）的100 μl BD Perm/Wash缓冲液中，室温孵育20分钟。</li>
	<li>成像前立即使用DAPI（0.2 μg/ml，Invitrogen, CA）或碘化丙啶（PI；20 ng/ml，Invitrogen, CA）对细胞核进行复染。</li>
</ol>
3. ImageStream 分析
<ol>
	<li>使用 ImageStream 对批量样本进行成像，以减少人源样本之间的变异性。激光器功率的仪器设置如下：488 nm 激光为 200 mW，658 nm 激光为 10 mW，405 nm 激光为 250 mW。</li>
	<li>为分析数据文件（图 1），首先根据正常 PI 强度和高 PI 长宽比（宽度：高度比）设门，以将单细胞（R1）与碎片（PI 强度低）或多细胞事件（PI 强度高且长宽比低）区分开来。单核细胞位于 CD14 阳性细胞门内。mDCs 位于 CD11c 高表达、CD4 低表达的细胞门（R2）内，且 Lin-1 标志物表达水平低（R3）。</li>
	<li>使用 IDEAS 软件（Amnis, WA）对每个细胞的活化程度进行有效的定量评估。通过细胞质转录因子 NF-κB 与核染料 PI 的共定位（相似性）程度判断其向细胞核的转位情况（R4）。NF-κB 与 PI 定位的高度相关性表现为较高的相似性评分，反映细胞活化程度10。</li>
	<li>比较不同处理组或患者群体之间的相似性比率，以评估细胞相对功能效率。通过绝对值或倍数差异的统计学比较对样本间数据进行量化。使用 IDEAS 软件显示来自群体直方图关键区段的细胞图像（图 2）。</li>
</ol>
4. 典型结果
我们通过使用TLR7/8配体R848刺激外周血单个核细胞（PBMCs），量化了模型病毒配体诱导的信号通路（图1）。我们在样本组中同时采集了细胞定位图像和群体统计学数据（图2）。ImageStream技术使我们能够直接从PBMCs中设门分选细胞亚群，并对设门后但未经分选的细胞群体进行细胞反应成像。在此，我们量化了TLR信号对Lin1-、CD4弱表达、CD11c+髓系树突状细胞（mDCs）中NF-κB（p65）核转位的影响。在基础状态下，我们观察到大量未刺激细胞中转录因子NF-κB（p65）位于细胞质内。刺激后，处理组细胞中NF-κB（p65）与核染料PI的相似性评分显著升高，表明NF-κB（p65）在刺激后转入细胞核（中位相似性评分分别为1.52和3.01，图2）。在TLR5刺激的单核细胞中也观察到类似结果9。
<img alt="显示 CD4dimCD11c+ 和 mDC：Lin1-CD11c+ 分析及刺激比较的流式细胞术示意图" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 检测刺激对人源 mDC 影响的染色与设门策略。NF-κB 转录因子调控多种免疫系统相关基因的表达。本研究检测了一名代表性受试者在 TLR7/8 配体刺激后，mDC 中 NF-κB（p65）的核转位情况。通过选择 PI 阳性且核长宽比高的事件（R1）确定处于焦平面的单个细胞。在 R3 中设门获取 mDC（Lin1-、CD4dim、CD11c+）。NF-κB（p65）的核转位情况在 R4 中展示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="流式细胞术分析、直方图和荧光显微镜、蛋白质表达、R848刺激效应。" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 刺激后 mDCs 中 NF-κB 的转位。 图示未处理和经刺激（R4）后的 mDC 群体中 NF-κB（p65）向细胞核的转位情况；未处理样本的中位相似性评分为 1.52，刺激样本为 3.01（A）。同时采集的未处理或 R848 刺激细胞群体的数字图像展示了代表性细胞及 NF-κB 转位至细胞核内的强度（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。

<ol><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li>
<li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
<li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li>
<li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li>
<li>Kong, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li>
<li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在使用ImageStream进行转化研究时，关键步骤包括选择相关的对照组，以及优化和验证抗体的特异性。通过直方图和细胞图像，可以清晰地观察到不同受试组之间标记靶标的差异。结合对相关受体和信号通路变化的深入分析，这些数据将为特定人群中免疫失调机制提供有价值的见解。该技术的局限性在于针对特定靶标、具有足够亲和力的特异性抗体的可获得性。此外，该仪器最适合多用户共享平台使用，且其分析软件需要一定时间才能熟练掌握。
该技术是人类疾病转化研究的一种强大手段。基因组测序和芯片技术的进步使得许多疾病相关变异得以被识别，但通常难以明确所涉及基因的作用机制。我们的研究为个体层面的转化研究提供了范例，例如刺激后NF-κB的核质分布比例分析。通过少量血液样本，即可在个体自身细胞中以谱系特异性的方式识别出差异性信号处理或信号传导。利用该方法，我们已对大量年轻与老年受试者的单核细胞进行了细胞反应的定量分析，并证实了衰老过程中细胞信号通路的改变9。ImageStream技术可更广泛地应用于多种研究场景，例如区分治疗应答者与非应答者的关键细胞机制，或用于个体在治疗前后的比较，以及疾病发作期与...

从小份人血样本中单核细胞和树突状细胞谱系特异性toll样受体介导信号通路的定量成像

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

免疫状态的个体差异决定了机体对感染的反应，并影响疾病的严重程度和结局。随着年龄增长，机体对病毒和细菌感染的易感性增加，对疫苗的应答能力下降，这与体液免疫和细胞介导免疫反应的显著衰退密切相关1,2。我们近期研究了衰老对Toll样受体（TLRs）的影响，TLRs是先天免疫系统的关键组分，能够识别微生物感染并启动宿主抗微生物防御反应3。在一项针对大量健康人类供体的研究中，我们发现老年人外周血单核细胞中某些TLRs的表达和功能降低4，且树突状细胞（DCs）中也存在类似的TLR水平下降和信号转导反应减弱；树突状细胞作为抗原呈递细胞，在连接先天性免疫与适应性免疫中起关键作用5。我们还发现，老年供体来源的巨噬细胞中TLR3表达失调，其树突状细胞在西尼罗河病毒感染后产生干扰素（IFN）的能力降低6,7。
深入了解免疫衰老以及进行治疗干预的关键在于，明确响应免疫刺激的特定细胞类型及其信号转导机制。传统的免疫反应研究主要依赖于对原代细胞的成像分析，以及通过流式细胞术（FACS）或免疫印迹法检测细胞标志物，这些方法极大地推动了该领域的进展。然而，这些技术通常受限于患者样本量较小，且难以在多个个体样本上同时开展复杂的实验操作。ImageStream 技术结合了定量流式细胞术与同步高分辨率数字成像，从而能够同时分析多个细胞群体，高效地捕捉患者的免疫易感性差异。本文中，我们展示了利用 ImageStream 技术在树突状细胞（DCs）中评估 TLR7/8 激活所诱导的关键转录因子 NF-κB 的磷酸化水平升高及其向细胞核的转位过程，该过程可启动多种对免疫应答至关重要的基因转录8。利用该技术，我们近期还发现老年供者单核细胞中 TLR5 信号通路及 NF-κB 通路存在此前未被识别的功能改变，这可能与衰老过程中免疫应答能力的改变有关9。

我们介绍了ImageStream技术（<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>）的应用，该技术结合了定量流式细胞术与同步高分辨率数字成像，用于量化来自明确定义的患者队列的原代免疫细胞的细胞机制。我们的研究为转化研究提供了蓝图，可用于量化来自受试者队列小样本中谱系特异性的细胞反应。

从小份人血样本中单核细胞和树突状细胞谱系特异性Toll样受体介导信号通路的定量成像

个体免疫状态的差异决定了对感染的反应，并影响疾病的严重程度和结局。衰老与……

以下实验的总体目标是展示如何利用成像流式细胞技术，对来自明确患者队列的原代免疫细胞的细胞机制进行定量分析。该目标首先通过分离来自患者或健康志愿者血液样本的外周血单个核细胞（pbmc）来实现。细胞分离后，进行激活并进行荧光标记。接下来，细胞通过流体动力学聚焦，用激光激发，并在时间延迟积分CCD相机上成像。最后，利用成像流式细胞仪获取图像，并对NF-κB进行定量分析。使用ideas软件对每张细胞图像中的转位进行分析。最终，通过分析点图、直方图和细胞图像，可以确定各受试组之间的差异。图像流式细胞术的优势在于其能够结合形态学信息与免疫荧光数据。我们能够以谱系特异性的方式研究细胞信号通路，无论是单个细胞还是细胞群体，且仅需少量血液样本即可开始。该方法有助于通过定位和定量信号中间分子来解答知识领域的关键问题。例如，可用于研究由作用介导的转录因子核转位，或考察衰老对细胞生物学的影响。我实验室的一名负责人将在分离自人类志愿者的外周血单个核细胞后，演示该技术。将回收的外周血单个核细胞以每0.6毫升培养基含3×10⁶个细胞的浓度重悬，然后将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。接着，用一种激活剂（例如此处所示的TLR8激动剂R848）刺激部分细胞，随后将所有细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中，于37°C孵育10至60分钟。孵育结束后，在室温下以500 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，加入针对单核细胞或树突状细胞谱系的表面抗体混合物，在4摄氏度下标记细胞20分钟，同时设置仅标记单色偶联抗体的细胞管作为补偿对照。随后在室温下用4% PFA-PBS固定细胞10分钟。在室温下以500 × g离心10分钟后，将pbmc重悬于冻存缓冲液中，并将细胞储存于负80摄氏度，直至检测当天进行分析。将细胞在37摄氏度水浴中快速解冻，离心去除冻存缓冲液后，加入100 µL BD破膜洗涤缓冲液进行破膜处理。然后在室温下用抗细胞内信号组分抗体（如本实验所示的抗NF-κB p65抗体）孵育20分钟。离心沉淀细胞后，将细胞重悬于含 goat anti-rabbit IgG 的100 µL BD破膜洗涤缓冲液中。加入Alexa 647，室温下再孵育PBMC 20分钟。成像前立即用核染料对细胞进行复染：首先启动ImageStream仪器，然后运行Inspire软件。接着，点击加载默认模板，然后选择初始化流体系统。然后点击图像库菜单并选择全部。接着按运行设置以开始对微珠进行成像，然后选择明场通道。待速度微珠开始运行后，点击“辅助”选项卡下的“全部启动”以校准并测试仪器。在完成 ImageStream 系统的校准后，按下冲洗、锁定并加载按钮，将最亮的样本载入仪器。然后调节激光功率，使每种荧光染料在点图中测得的最大像素值介于 104,000 计数之间。随后设定细胞分类标准。现在点击运行，采集以收集并保存实验数据文件，以便首先分析数据文件，打开分析软件。创建补偿后的图像文件，然后根据正常的细胞核染料强度和高细胞核染料长宽比对事件进行设门。为了在R1门中将单个细胞与碎片或多细胞事件区分开，单核细胞位于CD14阳性细胞门内，而髓系树突状细胞（CD11c高表达、CD4低表达且lin1标记物阴性）位于R3门内。最后，使用 Ideas 软件分析细胞质转录因子 NFκB 与核染料的共定位情况。NFκB 与核染料之间高度相关，表明两种标记物共定位，反映为较高的相似性评分，提示细胞的活化程度。可通过比较不同处理组或患者群体间高相似性事件的百分比，评估细胞功能活性的相对效率。然后可以使用软件显示来自群体直方图关键区段的细胞图像。ImageStream 可直接从外周血单个核细胞（pbmc）对细胞亚群进行设门，并对设门后但未分选的细胞群体进行细胞反应成像。此处定量分析了 TLR 信号转导对 lin one 阴性、CD four、微弱表达 CD 11 C 阳性髓系树突状细胞中 NF kappa BP 65 核转位的基线水平影响。在未受刺激的细胞中，观察到有较高比例的细胞其转录因子NF kappa B p65位于细胞质内。刺激后，经处理的细胞显示出NF kappa B p65与核染料PI具有显著更高的相似性评分，表明NF kappa B p65在刺激后转位进入细胞核。同时采集的未处理组或R848刺激组细胞群体的数字图像展示了代表性细胞以及NF kappa B转入细胞核的强度。请注意，与未处理细胞相比，R848刺激组中NF kappa B和PI在细胞核内的染色强度更亮。我们已在来自不同年龄供体的细胞中应用了该技术，并揭示了TLR介导的NF-κB激活通路的差异。一旦掌握，该技术可在一天内完成，另需额外时间进行图像分析，从而同时获得多种定位图像和群体统计结果。此外，我们可直接对多个细胞群体的响应进行成像，而无需物理分离。成像流式技术可广泛应用于多种细胞机制研究，在转化医学研究中具有重要价值。

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免疫学与感染

定量成像小样本人体血液中单核细胞和树突状细胞系特定的Toll样受体介导的信号

树突状细胞摄取抗原后迁移至免疫器官，将加工后的抗原呈递给T细胞。量子点纳米晶体标记可提供持久且稳定的荧光信号，从而可通过荧光显微镜追踪树突状细胞在不同器官中的分布。...

小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

在本报告中，我们展示了在新鲜全血上进行表型分析实验的染色与分析步骤，以计数主要的天然免疫和适应性白细胞群体。我们重点强调了在多中心临床试验背景下开展这些操作时的注意事项。...

使用全血表型分析法对多中心临床试验中主要外周血白细胞群体进行计数

本方案描述了在真核细胞上应用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）的方法。在此，我们通过分析巨噬细胞对其微环境刺激所产生的多种活化状态，展示了该技术的准确性。...

完整细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是一种准确且快速分析巨噬细胞不同活化模式的方法

本研究比较了两种不同的人单核细胞分离方法，以获得 体外...

通过成像流式细胞术表征人单核细胞来源的树突状细胞：两种单核细胞分离方案的比较

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

本文介绍了一种用于分析人原代T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的定性和定量完整工作流程。该方法基于成像流式细胞术，可在相对较短的时间内获取并分析数千个细胞的图像。...

利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内...

量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

我们描述了一种用于测量单核细胞穿过人内皮单层并进一步成熟为泡沫细胞的跨内皮迁移实验方案。该方法可灵活评估来自不同疾病状态个体的单核细胞的致动脉粥样硬化特性，并可用于评价血液中可能增强这种倾向的各类因素。...

慢性炎症状态下单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成的定量分析

本文介绍一种单细胞蛋白质组学方法，通过质谱流式细胞术分析外周全血样本中免疫表型及功能（细胞内细胞因子诱导）的变化。...

通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

本文介绍了一种通过全血流式细胞术对单核细胞亚群进行表征的实验方案。内容包括如何设门圈定各亚群、检测其表面标志物的表达水平，并以检测M1型（促炎）和M2型（抗炎）标志物的表达为例进行说明。...

通过全血流式细胞术分析表征人单核细胞亚群

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。...

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

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