记录神经反应和注射示踪剂一个清醒小鼠的制备
June 26th, 2012
重要的是理解大脑功能和指导安置途径示踪染料神经反应的电特性。然而，许多研究都在麻醉动物。理解没有麻醉药的脑功能，我们开发了一种方法来记录神经元的反应特性，并在清醒小鼠注入染料。
该程序的总体目标是记录清醒小鼠中单个神经元的反应。这是通过首先用 isof 氟吸入麻醉小鼠，将小鼠置于啮齿动物立体定位框架中并暴露颅骨来实现的。第二步是使用立体定位坐标定位感兴趣的大脑区域，并标记该区域以进行后续的开颅手术。
接下来，将定制的头柱安装在颅骨上，并将头柱放置在连接到立体定位装置上的微型纵器的安装杆中。最后一步是进行开颅手术，将电极插入大脑。一旦鼠标从手术中恢复过来，鼠标就会被束缚在泡沫块中。
将头柱放回安装杆中并连接到定制的立体定位装置上，并且可以将微量移液器电极插入大脑。此程序允许隔离单个单元。可以在多天内从同一大脑结构记录对刺激的强烈反应，并且痕迹可用于检查对生理识别区域的上升或下降投射，或者不会影响麻醉剂的反应。
与现有方法相比，该技术的主要优点是神经元的反应特性不受麻醉剂的影响。演示此程序的是我实验室的研究生 Zachary Mako准备头枕，首先，通过在 15 毫米、三个超过 32 英寸的不锈钢杆上钻孔来组装定制的头柱。然后将 20 毫米不锈钢擀面杖垂直插入孔中。
要形成十字敲击，请将垂直杆的一端接受 1 72 号螺钉，如图所示。接下来，准备好安装杆。该装置由一根长约 90 毫米、宽 5 到 10 毫米的较长黄铜或铝棒和一根较短的 15 毫米长的棒组成，该棒以 45 度连接到长棒的末端。
较短的杆在底部切出一个凹槽，一个跨宽度的较短凹槽将头柱安装到这些凹槽中，横杆嵌套在较短的凹槽中。安装块是两块铝，用螺丝装在一起，形成一个大约 30 毫米 x 30 毫米 x 25 毫米的块，带有一个切口来固定安装杆，将安装杆插入平行于桌面的安装块中的切口中。将安装块安装到微型机械手上，以便可以沿中线和边缘准确放置头柱的位置。
最后，将直径为 0.01 英寸的钨棒切割成大约 5 毫米长，其中大约 1 毫米以 45 度弯曲。该杆用作接地引脚。将动物置于含 5% 氟冰的诱导室中后，通过进行脚趾捏并检查是否没有反应来确保动物完全麻醉。
完全麻醉后，将鼠标放入装有鼠标适配器的啮齿动物立体定向框架中，首先将牙齿放入咬合杆的孔内，然后轻轻拧紧鼻夹直至其紧贴。以确保动物保持麻醉状态。将一块乳胶手套制成的面罩放在小鼠的鼻子上，并保持 5% 的氟，直到呼吸频率约为每秒一次呼吸。
之后，将氟的 isof 降低到 1.5% 至 2%现在通过将耳栏轻轻放入每个耳道来固定头部。在小心不要刺穿耳膜的同时，固定耳条使其紧贴，但不要太深地渗透到耳道中。在鼠标下方放置一个凝胶加热垫。
然后轻轻涂抹眼药膏以防止眼睛干燥。使用小剃须刀或细尖剪刀。去除耳朵之间到眼睛的毛发。
现在用洗必泰或 Betadine 磨砂膏清洁和消毒头皮，然后用酒精冲洗，重复 3 次。沿着从后脑勺到眼睛的中线做一个切口。如果需要，用手术刀将骨膜刮到切口的边缘。
用镊子小心地缩回颈部后部的肌肉组织，同时让肌肉沿着滑道撕裂，以减少出血。在头皮组织下方涂抹凝胶泡沫，以尽量减少水分并防止皮肤在颅骨上移动。然后用 isop profile 酒精润湿棉头涂抹器并擦干颅骨表面，以增强颅骨标志的可视化。
动物准备好后，插入一个细尖。将锋利的金属棒等探针插入电极支架，并将其连接到立体定位微纵器上。在 bgma 和 Lambda 之间来回移动探头，确保每个位置的外侧内坐标相差不超过 50 微米。
根据需要使用耳杆轻轻重新定位头部。验证 Bgma 和 Lambda 的背腹高度相差不超过 50 微米。如有必要，调整鼻夹的高度以使颅骨的倾斜度水平，可能还需要调整耳杆的高度。
使用小鼠大脑的图谱来识别目标靶标相对于 bgma 的坐标。使用印度墨水在将进行开颅手术的目标上方标记颅骨。首先，通过在表面上涂抹牙科蚀刻凝胶并擦洗约 10 秒钟来清洁颅骨。
然后用水清洗并完全干燥。接下来，将牙科粘接剂的粘合剂底漆涂在颅骨表面。使用涂覆器，然后使用新的涂覆器涂抹胶粘剂，用紫外光枪的一个周期固化胶粘剂。
确定目标站点远端的位置。对于接地针的安装，请使用 65 号迷你刀片手术刀的尖端小心地在颅骨上钻一个小孔。此时，孔应足够宽，以容纳接地引脚的短端。
插入接地针，使其靠在脑膜上。确保销的方向使其指向远离 bgma 和头柱连接部位。现在，移动微型纵器，使头柱位于刚好接触头骨的 bgma 上。
头柱的底部应平放在颅骨上。然后使用解剖探针在头柱和接地针周围涂抹少量牙科粘接剂。向下按压粘接剂以确保与颅骨良好接触。
然后用紫外光枪进行三到四个循环固化。最后，涂抹第二轮水泥，在头柱周围建立基础，并覆盖头柱的凹槽并固化我们。首先找到开颅手术参考标记之前，该参考标记将被引物部分遮挡。
然后使用 65 号迷你刀片手术刀在该部位周围标记一个 3 毫米 x 3 毫米的正方形。滴一滴利多卡因溶液以降低敏感性。现在在正方形的每一边做多个分数，小心不要切开骨头进入大脑。
一旦骨瓣松动，用手术刀的尖端将其撬起，保持硬脑膜完好无损。然后用骨蜡覆盖该区域。手术完成后，关闭 iso fluorine 并将鼠标从立体定位框架中释放。
将利多卡因涂抹在裸露的皮肤上，然后进行新孢子膏抹，按照兽医的指示进行术后镇痛，然后将小鼠放回家笼。24 小时后，鼠标可用于电生理记录。该图表明，成功安装头柱使实验者能够记录清醒小鼠在多天内的单单位和多单位反应。
约束系统允许对大脑中的单个神经元进行稳定的电生理记录。可以在多天内从同一大脑结构中记录单个单元的出色分离和对刺激的强烈反应。例如，在为期两天的小鼠下丘中，左图显示了从第一天获得的记录，右图显示了从第二天获得的记录，以评估从听觉中脑到听觉脑干的下降投影，使用 Dino Benadine 可视化的生物素化、dextra 和胺，因为色原可以注射到小鼠下丘中，如图所示，在电生理学识别注射部位的神经元反应特性后，以及组织处理后。
对侧耳蜗背核中的顺行标记可以可视化和绘制，如图所示。还可以获得更高分辨率的照片显微照片，以查看先前大量标记的轴突和末端。观看此视频后，您应该对如何记录单个神经元的响应特性以及注射染料或示踪剂以在清醒的小鼠中进行神经解剖学研究有很好的了解。
这种制剂消除了麻醉剂对神经反应特性的影响，并允许对同一只动物进行多天的实验。该程序的关键是确保头柱牢固地安装在头骨上，并且鼠标得到很好的约束。虽然该视频说明了如何使用此程序从听觉系统中的单个神经元进行记录，但可以使用此技术研究大脑的其他区域。
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概述
本文介绍了一种在清醒小鼠中记录神经元反应的方法，这对于理解大脑功能至关重要。该程序包括初始麻醉，然后进行手术准备，以便将电极插入大脑。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 神经解剖学
背景
- 电生理学特性对于研究大脑功能至关重要。
- 许多研究在麻醉状态下进行，这可能会影响神经元活动。
- 在清醒动物中进行记录可以提供更准确的神经元反应数据。
- 该方法允许注射染料以进行通路追踪。
研究目的
- 开发一种在清醒小鼠中记录神经元反应的技术。
- 便于注射染料以追踪神经通路。
- 在没有麻醉的干扰下增强对大脑功能的理解。
使用的方法
- 用异氟烷吸入麻醉小鼠。
- 将小鼠放置在立体定位架中并暴露头骨。
- 使用立体定位坐标定位感兴趣的大脑区域。
- 在手术恢复后进行开颅术以插入电极。
主要结果
- 成功记录清醒小鼠的神经元反应。
- 有效的染料注射以进行通路追踪。
- 展示了该方法在未来研究中的可行性。
- 在没有麻醉剂影响下对神经元活动的洞察。
结论
- 该方法允许更准确地研究神经元反应。
- 在清醒小鼠中记录增强了我们对大脑功能的理解。
- 该技术可以应用于各种神经科学研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Recording neural responses in awake animals eliminates anesthetic confounds that distort physiological measurements, improving target validation confidence in neuroscience discovery. This method enables longitudinal electrophysiological studies combined with anatomical tracing, supporting mechanistic de-risking of CNS targets. The approach enhances predictive value by linking functional responses to structural pathways in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating single neuron responses without anesthetic artifacts.
- Operational Value: Supports biological de-risking through stable, multi-day recordings from the same brain structure.
- Scientific Value: Facilitates functional target validation by correlating electrophysiological properties with anatomical pathways via tracer injection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline neuronal response properties.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent head restraint and electrode positioning.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative measurements of neural responses over time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by allowing study of neural circuits in awake, behaving conditions.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through combined electrophysiological and anatomical readouts.
- Scientific Value: Promotes risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing functional and anatomical data on neural targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via single-unit recordings and tracer-based pathway mapping.
- Screening: Enables assay readiness through stable, reproducible single-unit isolation over multiple days.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements such as firing rates, thresholds, and frequency specificity for comparative analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling pathway tracing from physiologically identified sites.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for chronic neural recording and tracing across multiple study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by removing anesthetic confounds from neural response measurements.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through fixed head post restraint and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in CNS target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through longitudinal data on target engagement and circuit effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery, neural recording, and histological tracer techniques.
- Depends on specialized instrumentation including stereotaxic frames, micro manipulators, and electrophysiological recording systems.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, electrophysiology, and histology teams for consistent results.
- Involves adaptation considerations across brain regions and animal strains for optimal head post placement and recording stability.
- Includes practical limitations such as postoperative recovery time and the need for skilled animal handling to maintain wakefulness during recording.
