Name: 记录神经反应和注射示踪剂一个清醒小鼠的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 学习在清醒小鼠中记录神经元反应和注射示踪剂的技术，使用立体定位手术和头柱固定方法。该技术可避免麻醉剂对神经活动的影响，实现多日稳定记录。

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由美国国家科学基金会（NSF）资助项目0920060、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DC004395、澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）资助项目1009482、新南威尔士州科学与医学研究办公室以及加内特·帕斯和罗德尼·威廉姆斯纪念基金会资助。

1. 头部固定概述
<ol>
	<li>组装定制的头柱时，将一根1/16英寸的不锈钢卷销垂直插入一根3/32英寸不锈钢杆上钻好的孔中，形成一个十字结构。头柱的垂直部分长度约为20 mm，水平横杆部分约为15 mm。在垂直杆的一端攻丝，以安装一颗#1-72螺钉。（图1）。</li>
	<li>在手术和记录过程中，头柱通过一颗#1-72螺钉固定在定制的黄铜或铝制安装条上（图2）。安装条的长段部分长度约为90 mm，宽度为5–10 mm。头柱插入安装条长段一侧延伸出的15 mm长、呈45度角的凸起部分上的凹槽中。为防止头部旋转，头柱的横杆部分嵌入安装条底部的一个小凹槽内。</li>
	<li>将安装条固定在定制的铝制安装块上（图3）。安装块尺寸约为30 mm × 30 mm × 25 mm。该安装块通过螺丝连接两部分组成，其中一块设有切口，允许安装条滑入并通过螺丝固定。安装块可连接至微操作器，以便精确地将头柱定位在中线位置及Bregma点。安装条与实验台表面保持平行。在记录过程中，将安装条固定于定制的立体定位架上（图4）。该立体定位架的设计可使安装条在记录时的位置与手术期间在安装块中的位置完全一致，从而确保小鼠在不同实验会话中始终与立体定位架对齐。</li>
	<li>截取一段直径为0.010英寸的钨棒，长度约为5 mm，并将其中约1 mm段弯曲成45°角。该钨棒用作接地针（图1）。</li>
</ol>
2. 开颅术的立体定位对齐
注意： 下述所有操作步骤均遵循标准的无菌外科技术，并已获得华盛顿州立大学动物护理与使用委员会以及加文研究所动物伦理委员会的批准。
<ol>
	<li>将小鼠置于含5%异氟烷的诱导室中进行麻醉。通过夹捏尾巴和/或脚趾无反应来确认动物已完全麻醉。</li>
	<li>将小鼠固定在配备小鼠适配器（Stoelting）的啮齿类立体定位仪上。为正确固定小鼠头部，将其门齿插入咬合杆的孔中，并拧紧鼻夹使其贴合。尽可能使小鼠在咬合杆和鼻夹中保持正直。用乳胶手套裁成的面罩覆盖小鼠鼻部，并维持异氟烷浓度为5%，直至小鼠呼吸频率降至约每秒1次，随后将异氟烷调至1.5–2.0%。使用耳棒固定头部，注意避免刺破鼓膜。耳棒应贴合但不可过深插入耳道。</li>
	<li>在小鼠身下放置加热垫。</li>
	<li>涂抹眼用软膏以防止眼睛干涩。</li>
	<li>使用小型剃刀或尖头剪刀将小鼠头皮从耳间区域向上剃至眼睛上方。</li>
	<li>用氯己定（或碘伏）擦洗液擦拭头皮，再以酒精冲洗，重复三次以清洁并消毒头皮。</li>
	<li>沿头部中线从后脑至眼睛处做切口，以去除颅顶皮肤。</li>
	<li>用手术刀将骨膜刮至切口边缘。如实验需要，可用镊子小心向后牵拉颈部后方的肌肉组织，使其沿肌束方向撕裂以减少出血。在头皮组织下方放置明胶海绵，以减少渗液并防止皮肤在颅骨上滑动。</li>
	<li>用蘸有异丙醇的棉签擦拭颅骨表面使其干燥，以增强颅骨解剖标志的可视性。</li>
	<li>根据标准立体定位坐标13调整颅骨位置。将细尖探针插入电极夹持器，并将其连接至立体定位微操纵器。一根磨尖的金属棒适用于此目的（图5）。</li>
	<li>使用该探针识别颅骨上的前囟（Bregma）（图5A）和后囟（Lambda）（图5B）。在两点之间来回移动探针，检查每个位置的内外侧坐标差异不超过50 μm。如有需要，可小心松开耳棒，横向移动头部和耳棒，再重新拧紧耳棒以调整头部位置。</li>
	<li>确认每个位置的背腹向高度差异不超过50 μm。必要时调节鼻夹高度，使颅骨围绕耳棒轴线旋转，以校正颅骨的俯仰角度。耳棒的高度也可能需要调整。</li>
	<li>参考图谱13确定目标脑区相对于前囟（Bregma）的立体定位坐标（图5C）。在即将进行开颅的位置上方标记颅骨（例如画“X”或用印度墨水在正方形四角点出标记）（图5D）。</li>
</ol>
3. 头部固定柱和接地钉安装
<ol>
	<li>使用蚀刻胶清洁颅骨。用涂抹工具在颅骨表面擦拭并均匀涂抹蚀刻胶（10秒）。用水冲洗并彻底干燥。使用涂抹工具将牙科水泥底漆涂于颅骨表面，再用新的涂抹工具均匀涂布粘合剂。用紫外光枪固化粘合剂（1个循环）。</li>
	<li>选择远离目标区域的地点作为接地钉位置。使用#65微型刀片手术刀的尖端小心地在颅骨上钻一个小孔，孔径仅需足够接地钉短端插入并接触脑膜。接地钉应朝远离前囟（Bregma）和未来头固定柱的方向放置（图6A）。</li>
	<li>将头固定柱固定在安装杆和固定块上，并连接至显微操作器。通过在三维空间内移动显微操作器，将头固定柱置于前囟（Bregma）上方，轻轻接触颅骨表面（图6B）。头固定柱的底部应平整贴合颅骨。</li>
	<li>使用解剖探针，在头固定柱和接地钉周围施加少量牙科水泥（图6C）。压紧水泥以确保其与颅骨良好接触。注意：水泥用量不宜过多，否则将无法均匀固化。使用紫外光枪从多个角度进行照射固化（3–4个循环）。</li>
	<li>施加第二层水泥，围绕头固定柱构建基座，并覆盖头固定柱的沟槽部分（图6D）。</li>
</ol>
4. 开颅术
<ol>
	<li>找到颅骨开窗的参考标记，该标记会被底漆部分遮挡。使用#65号手术刀在该位置周围标记一个3 mm × 3 mm的正方形，并滴加一滴利多卡因以降低敏感性并减少出血。</li>
	<li>在正方形的每一边上进行多次划痕（最多可达10次），注意不要切穿颅骨进入脑组织（图7A）。</li>
	<li>当骨瓣变得松动后，用手术刀尖将其撬起，保持硬脑膜完整无损（图7B）。</li>
	<li>用骨蜡覆盖创面。</li>
</ol>
5. 术后
<ol>
	<li>关闭气体麻醉，将小鼠从立体定位仪中取出。</li>
	<li>使用棉签在暴露的皮肤周围涂抹利多卡因软膏，以减轻伤口周围的痛觉。另取一根棉签将新霉素-多粘菌素B-杆菌肽（Neosporin）涂抹于暴露的皮肤上。根据各机构动物照护与使用委员会（IACUC）兽医的建议，注射酮洛芬（5 mg/kg，肌内或腹腔注射）作为术后镇痛药。小鼠通常在停止麻醉气体后数分钟内即可苏醒并开始活动。</li>
	<li>将小鼠置于温暖的笼盒中，并持续观察，直至其可返回动物饲养设施。</li>
	<li>动物术后恢复期间应至少每天检查一次。注意观察进食和/或饮水减少、精神萎靡等异常表现。若怀疑存在疼痛，应每24小时给予一次酮洛芬（剂量与术后即刻使用相同），直至症状缓解。若动物出现抓挠行为或不适迹象，可在伤口局部涂抹利多卡因。通常情况下，动物术后可顺利恢复，无并发症或明显疼痛。</li>
</ol>
6. 记录与染料注射
<ol>
	<li>在头固定手术后至少等待一天，再使用小鼠进行记录。</li>
	<li>将小鼠放入根据其体型定制的泡沫固定装置中。小鼠此前应已适应该装置，以减少其焦虑情绪。通常的适应方法是在断奶后每天进行抓取操作，并在手术和实验前约一周内，每天将小鼠放入泡沫装置中 1-5 分钟。将装置悬挂在立体定位仪框架上（图 4）。</li>
	<li>将头固定装置固定至安装杆上，该安装杆现已固定于立体定位仪框架上（图 4）。</li>
	<li>使用带有钝头 22 号皮下注射针头的导线连接接地针。</li>
	<li>清除颅骨开窗处的骨蜡。如有必要，使用微型刀片手术刀的尖端去除硬脑膜。</li>
	<li>将电极推进至正确的立体定位位置并开始记录（图 8）。对于仅进行电生理记录的情况，可使用多种类型的电极。电极的选择取决于所需记录的脑区位置和记录类型。清醒小鼠记录所用的电极应与研究者在麻醉小鼠中使用的电极相同。对于结合电生理记录与染料/示踪剂注射的实验，应使用微电极移液管10。微电极移液管内需填充所选染料/示踪剂，以便在电生理实验结束后通过离子电渗法注入。也可使用多通道电极，以实现药理学操控。多通道电极可安装在一个单通道记录微电极上（图 8）。这些技术在文献中已有标准描述，且在麻醉与清醒状态下的记录之间并无差异。</li>
	<li>可在连续 3-4 天内每天进行 4-5 小时的记录。</li>
	<li>在每次记录结束后，可进行染料/示踪剂注射。由于大脑中无痛觉感受器，通过离子电渗法将染料或示踪剂注入脑内通常不会引起不适。然而，在完成目标脑区电生理反应特性的表征后，可使用异氟烷麻醉动物以进行注射，从而消除任何潜在的不适感。由于染料/示踪剂已存在于微电极移液管中，只需将活动电极和接地电极从电生理记录装置切换至电流发生器，即可进行离子电渗注射。应根据电极内染料/示踪剂的类型采用相应的注射方案。随后将动物从头固定装置和身体固定装置中取出，并放回其饲养笼中。</li>
	<li>实验结束后，按照标准操作流程实施安乐死并进行组织处理，以回收注射位点并进行标记分析。</li>
</ol>
7. 典型结果
成功安装头固定装置后，实验者可在多天内对未麻醉的清醒小鼠进行单单位和多单位神经反应的记录。该固定系统可实现对脑内单个神经元稳定的电生理记录。在多个实验日中，可从同一脑区（例如小鼠下丘）持续获得单个神经元的良好分离信号以及对刺激的强反应（图9A，第一天；图9B，第二天）。通过良好的头固定装置安装，每只小鼠均可与立体定位仪及小鼠立体定位图谱13保持一致对齐，从而可靠地定位特定脑核。这种可靠的定位使得在多次记录后，可向特定结构注射染料或示踪剂。例如，为评估听觉中脑至听觉脑干的下行投射，可在电生理方法确定注射位点的神经元反应特性后（在图10A中，记录到一个最佳频率为51 kHz的神经元），向小鼠下丘注射生物素标记的葡聚糖胺（使用二氨基联苯胺作为显色剂进行可视化）（图10A），组织处理后可在对侧背侧耳蜗核中观察并绘制出顺行标记的神经纤维（图10B）。此外，还可获取更高分辨率的显微照片以观察顺行标记的轴突及其终末（图10C）。
<img alt="头部支架组件示意图；组件：头部支架螺丝、头部支架、接地针、头部支架底座。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 
<img alt="头部支架组件，带标签的示意图；包括安装杆、固定螺钉，用于结构搭建。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 
<img alt="用于实验室设备组装和校准的带铝块和铝条的安装装置。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图 3. 
<img alt="静力平衡装置；金属力学实验；力分布分析；物理学研究。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 
<img alt="立体定向手术示意图，颅骨上标有靶点位置，用于精确定位脑内注射。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5.
<img alt="外科颅骨植入物安装、光固化及操作顺序；步骤 A-D；生物医学研究方法。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 
<img alt="微针应用、皮肤穿透性比较；显微镜图像，皮肤科研究。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 
<img alt="用于电生理研究的带有扬声器、单管电极和多管电极的显微操作仪装置。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
图 8. 
<img alt="电生理信号图，时间 vs. mV，瞬态分析，神经活动比较。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
图9. 
<img alt="标注区域的组织学切片分析；显微镜检查、细胞结构、组织观察。" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 10"> 
图 10.

<ol><li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).</li>
<li>Young, E. D., Brownell, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+tones+and+noise+of+single+cells+in+dorsal+cochlear+nucleus+of+unanesthetized+cats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats.</a> J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).</li>
<li>Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+properties+of+neurons+in+two+parts+of+the+primary+motor+cortex+of+the+awake+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat.</a> Brain Res. , 333-3173 (1985).</li>
<li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+sensitive+to+combinations+of+information-bearing+elements+of+biosonar+signals+in+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat.</a> Science. 200, 778-781 (1978).</li>
<li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li>
<li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA%2FCaJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li>
<li>Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory%2C+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li>
<li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

头固定限制系统在小鼠电生理学和神经解剖学实验中的优势在于，可在未麻醉的清醒小鼠中进行实验，从而避免了麻醉药物可能带来的反应干扰。此外，该装置可在多天内重复使用，有助于更高效地利用实验动物。
头固定装置的大部分组件均可直接购买。只有头固定装置和安装装置需要定制，但这两部分都相对容易制作，并且可重复使用。如果所在机构没有机械加工车间，研究人员可以考虑使用<a href="http://www.emachineshop.com/" target="_blank">http://www.emachineshop.com/</a>来加工所需组件。
熟练的外科手术技能是必要的。外科医生必须精通精细的外科技术，其中一些操作最好在显微镜下完成。手术必须在无菌条件下进行。去除颅骨瓣是该手术过程中最精细的环节。通过在手术显微镜下观察，用手术刀沿矩形四边仔细而轻柔地多次划痕，可使颅骨瓣“弹脱”，出血极少，同时保持硬脑膜完整。熟悉下方的血管分布至关重要，因为在主要血管上方切割可能导致不必要的出血风险。由于我们的研究聚焦于听觉系统，因此我们避免使用钻头...

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;蚀刻凝胶&lt;/em&gt;，用于牙科水泥粘接前清洁颅骨</td><td>Henry Schein</td><td>101-5396</td><td>12支/包，含1.2 mL注射器</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;底涂剂&lt;/em&gt;，用于牙科水泥</td><td>Kerr Optibond</td><td>25881</td><td>8 mL瓶装</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;粘接剂&lt;/em&gt;，用于牙科水泥</td><td>Kerr Optibond</td><td>25882</td><td>8 mL瓶装</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;涂敷工具&lt;/em&gt;，用于牙科水泥</td><td>Kerr Optibond</td><td>24680</td><td>200支/包</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;牙科水泥&lt;/em&gt;</td><td>Charisma, Heraeus Kulzer</td><td>66000085</td><td>4克注射器补充装</td></tr><tr><td>钨棒（&lt;em&gt;接地针&lt;/em&gt;）</td><td>A-M Systems</td><td>717200</td><td>直径0.010&quot;</td></tr><tr><td>经济型&lt;em&gt;紫外固化灯&lt;/em&gt;</td><td>Henry Schein</td><td>CU-80</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;头固定柱&lt;/em&gt;</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;安装杆&lt;/em&gt;</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;安装块&lt;/em&gt;</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;立体定位仪&lt;/em&gt;</td><td>David Kopf Instruments</td><td>902</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;小鼠和新生大鼠适配器&lt;/em&gt;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;DeltaPhase等温垫&lt;/em&gt;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>39DP</td><td></td></tr></tbody></table>

清醒小鼠的制备以记录神经反应和注射示踪剂

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

众所周知，麻醉会显著改变大脑多个区域神经元的反应特性13。在听觉系统中，脑干神经元的基本反应特性，如阈值、频率特异性以及抑制性侧带，在麻醉状态下均会发生显著变化1-2。这些发现促使生理学家寻求在不受麻醉干扰的情况下记录单个神经元活动的方法。其中一种方法是采用去大脑准备，即在中脑水平完全横断脑干4。该方法的缺点包括手术难度大、前脑下行投射被消除，以及无法利用感觉刺激来研究中脑以上的结构。另一种策略是长期植入电极阵列，以在动物清醒和/或行为状态下记录单个神经元和多单元簇的活动5,6。然而，这些技术无法在首先通过电生理学手段对脑区进行表征后，再注射示踪染料。为了在记录单个神经元电生理反应特性的同时避免麻醉剂对神经反应特性的影响，我们借鉴了长期以来在蝙蝠中使用的一种头部固定技术7-9，并将其应用于小鼠10-12。利用该方法，我们能够在未麻醉的小鼠中进行持续数天的电生理记录。在记录结束后，我们可以注射染料以重建电极位置和记录位点，或注射示踪剂以确定记录位点的输入和输出通路。该方法实现了在多天内对单个神经元进行良好分离的记录，且无需使用麻醉剂。

神经元反应的电生理表征对于理解脑功能以及指导通路示踪染料的放置具有重要意义。然而，许多研究是在麻醉动物中进行的。为了在无麻醉条件下理解脑功能，我们建立了一种在清醒小鼠中记录神经元反应特性并注射染料的方法。

众所周知，麻醉会改变大脑多个区域的神经反应特性。在听觉系统中，基本反应……

本实验方案的总体目标是在清醒小鼠中记录单个神经元的反应。首先通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉，然后将小鼠置于啮齿类动物立体定位仪中并暴露颅骨。第二步是利用立体定位坐标确定目标脑区，并对该区域进行标记，以便后续实施开颅手术。接下来，将一个定制的头部固定装置安装到颅骨上，并将该装置置于固定在立体定位仪微操装置上的固定杆中。最后一步是进行开颅手术，以便将电极插入脑内。小鼠术后恢复后，将其固定在泡沫固定块中。将头部固定柱重新放回安装杆上，并连接至定制的立体定位装置，随后可将微移液电极插入大脑。该操作可实现单个神经元的分离记录。可在多天内从同一脑区记录到对刺激的强反应，还可利用该技术研究投射至生理学定位区域的上行或下行神经通路，且不会因使用麻醉剂而影响神经反应。与现有方法相比，该技术的主要优势在于神经元的反应特性不会受到麻醉剂的影响。演示此操作流程的是我实验室的研究生 Zachary Mako。准备头部固定装置时，首先通过在一根15毫米（3/32英寸）长的不锈钢棒上钻孔，组装一个定制的头部固定杆。然后将一根20毫米长的不锈钢圆柱销垂直插入该孔中。要制作一个十字接头，请将垂直杆的一端攻丝，以安装一个1号72螺钉，如图所示。接下来，准备安装支架。该装置由一根长约90毫米、宽约5至10毫米的较长黄铜或铝制杆，以及一根在长杆末端以45度角连接的15毫米短杆组成。较短的横杆底部切有一条凹槽，宽度方向上有一条较短的凹槽，将头柱插入这些凹槽中，使横杆部分嵌入较短的凹槽内。安装块由两块铝件通过螺丝固定组合而成，形成一个尺寸约为30毫米×30毫米×25毫米的方块，其上设有切口用于固定安装杆。将安装杆平行于台面方向插入安装块的切口中。将安装块连接至显微操作器，以便能够精确地将头柱置于中线及颅骨表面位置。最后，将一根直径为0.01英寸的钨棒切割成约五毫米长，并将其约一毫米的部分弯成45度角。此钨棒用作接地针。将动物放入含有5%氟烷的诱导室中后，通过捏压脚趾并检查是否无反应，确认动物已完全麻醉。完全麻醉后，先将小鼠的门齿放入咬杆的孔洞内，再轻轻拧紧鼻夹使其贴合，然后将小鼠置于配备小鼠适配器的啮齿类动物立体定位仪中。为确保动物持续处于麻醉状态，在小鼠鼻部覆盖由乳胶手套制成的面罩，持续给予5%异氟烷，直至呼吸频率降至每秒约一次。此后，将异氟烷浓度降低至 1.5% 至 2%。现在，轻轻将耳杆插入每侧耳道以固定头部。注意避免刺破鼓膜，调整耳杆使其贴合稳固，但不要过深插入耳道。将凝胶加热垫放置于小鼠下方。然后轻轻涂抹眼用软膏，以防止眼睛干涩。使用小型剃须刀或尖头剪刀，去除从耳朵之间至眼睛区域的毛发。现在使用氯己定或碘伏消毒液清洁并消毒头皮，随后用酒精冲洗，重复三次。沿头部中线从后脑至眼睛做切口。必要时，使用手术刀将骨膜刮至切口边缘。使用镊子小心地向后牵拉颈部后方的肌肉组织，同时让肌肉沿肌束方向撕裂，以尽量减少出血。在头皮组织下方放置明胶海绵，以减少水分并防止皮肤在颅骨上移动。然后用异丙醇润湿棉签，擦拭颅骨表面，使其干燥，以增强颅骨解剖标志的可见性。动物准备就绪后，插入一个尖细的探针。将如 sharpened metal rod 之类的探针插入电极固定器，并将其连接至立体定位显微操作器。在 bgma 与 Lambda 之间前后移动探针，确保每个位置的内外侧坐标差异不超过 50 微米。根据需要使用耳杆轻轻调整头部位置。确认 Bgma 和 Lambda 处的背腹高度差异不超过 50 微米。如有必要，调节鼻夹的高度以校正颅骨的俯仰角度，耳杆的高度也可能需要相应调整。使用小鼠脑图谱确定目标区域相对于bgma的坐标。使用绘图墨水在将要进行颅骨开窗的目标区域上方的颅骨处做标记。首先，通过在颅骨表面涂抹牙科酸蚀凝胶并刷洗约10秒来清洁颅骨。然后用水冲洗并彻底干燥。接着，将牙科粘固剂的粘合底涂剂涂布于颅骨表面。使用涂布工具，再用新的涂布工具均匀涂抹粘合剂，然后用紫外光枪照射一个循环以固化粘合剂。确定一个位于目标区域远端的位置。安装接地针时，使用65号微型刀片手术刀的刀尖小心地在颅骨上钻一个小孔。此时，该孔应足够宽，以容纳接地针的短端。插入接地针，使其置于脑膜之上。确保接地针朝向远离bgma和头部固定装置连接位置的方向。然后，移动显微操作器，使头部固定装置位于bgma上方，并刚好接触颅骨。头固定柱的底部应平贴于颅骨表面。然后使用解剖探针在头固定柱和接地钉周围涂抹少量牙科水泥。按压水泥以确保其与颅骨良好接触。然后使用紫外光枪进行三到四个循环的固化。最后，在头部螺钉周围再施加第二轮胶水，以构建基底并覆盖头部螺钉的沟槽，然后进行固化。首先确定颅骨开孔的参考标记，该标记会因底涂剂而部分被遮挡。然后使用65号微型刀片手术刀在该部位周围标记一个3毫米×3毫米的正方形区域。滴加一滴利多卡因溶液以降低敏感性。现在在正方形每侧进行多次划痕，注意不要切穿颅骨进入脑组织。当骨瓣变得松动后，使用手术刀的尖端将其撬起，注意保持硬脑膜完整。随后用骨蜡覆盖该区域。手术完成后，关闭异氟烷，将小鼠从立体定位仪中取出。将利多卡因涂抹于暴露的皮肤，随后涂抹新霉素软膏，根据兽医指示给予术后镇痛，并将小鼠放回饲养笼。24小时后，可将小鼠用于电生理记录。该图显示，成功安装头固定装置后，实验人员可在多天内对清醒小鼠进行单单位及多单位神经元反应的记录。该固定系统可实现对大脑中单个神经元的稳定电生理记录。可在多天内从同一脑区获得单个神经元单元的良好分离以及对刺激的强反应。例如，在小鼠下丘中，左图显示了第一天的记录结果，右图显示了第二天的记录结果，用于评估从听觉中脑到听觉脑干的下行投射。如图所示，可在电生理学鉴定注射位点神经元反应特性后，将生物素化右旋糖酐胺通过联氨苯二胺（Dino Benadine）作为显色剂显色后，注射至小鼠下丘，随后经组织处理进行观察。对侧背侧耳蜗核中的顺行标记可以如图所示进行可视化和绘制。还可以获得更高分辨率的显微照片，以观察被强烈标记的轴突和终末。观看本视频后，您应能充分理解如何在清醒小鼠中记录单个神经元的反应特性，并注射染料或示踪剂以进行神经解剖学研究。该制备方法消除了麻醉剂对神经反应特性的干扰，使得能够在同一动物上进行持续多天的实验。该操作的关键在于确保头固定装置牢固地安装在颅骨上，并且小鼠被良好地固定。尽管本视频展示了如何利用该技术记录听觉系统中单个神经元的活动，但该技术也可用于研究大脑的其他区域。

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来源：Moore, J. D., 等. 在清醒、头部固定的大鼠皮层下脑结构中对单个神经元进行细胞外邻近记录与定位. J. Vis. Exp.

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