Name: 艾滋病毒的成像1信封引起的病毒学突触信号合成脂双层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 了解利用全内反射荧光显微镜可视化HIV-1包膜诱导的病毒学突触形成的方法。该技术通过合成脂双层模拟感染细胞表面，帮助研究者分析信号分子的定位与LCK蛋白的招募机制。

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本工作获得美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI071815（C.E.H.）和路线图纳米医学发展中心奖项 PN2EY016586（M.L.D.）的支持。

1. GP120标记
本方案中使用的荧光染料能够有效结合蛋白质，具有足够的光稳定性以用于显微成像，并且与我们显微镜所配备激光器的激发波长相匹配。在选择用于标记蛋白质的荧光分子时，必须满足这三个标准。
<ol>
	<li>使用离心过滤装置（30 kDa 截留分子量）将 His6-标签 gp120 DH12（由爱荷华州立大学 Michael Cho 博士惠赠）蛋白缓冲液置换为无菌 PBS。确保 gp120 浓度不超过 1 mg/ml。注意：其他 X4 或 R5 嗜性毒株的 His6-标签 gp120 蛋白也已进行过测试，目前可从 Immune Technologies 商业购得。</li>
	<li>向蛋白溶液中加入 pH 9.0 的碳酸氢钠，使终浓度为 50 mM 碳酸氢钠，pH 值约为 8.5。</li>
	<li>加入胺基反应性 Alexa Fluor 488（AF488）荧光染料（以水溶解，摩尔过量 10 倍），避光室温孵育 1–2 小时。</li>
	<li>为去除未结合的染料，使用前述离心过滤装置，并向滤柱中加入新鲜无菌 PBS。重复此步骤直至完全去除游离染料（用 4 ml PBS 洗涤 3–4 次）。离心浓缩至 gp120 浓度约为 1 mg/ml。注意：仅当染料可溶于水时，透析或离心过滤装置才可用于去除游离染料；否则可采用凝胶过滤法。</li>
	<li>为测定标记蛋白每分子蛋白的荧光强度（F/P），需分别测定荧光染料在相应波长下的浓度（例如 AlexaFluor 488 在 488 nm）和蛋白浓度（我们使用 NanoDrop 分光光度计的“蛋白质与染料”模式），然后将两个浓度值相除，得到 F/P 比值。该方法同样适用于其他蛋白与染料组合，如 ICAM-1 与 Cy5。注意：若无 NanoDrop，也可使用其他类型的分光光度计测定蛋白浓度和荧光染料浓度，以计算 F/P 比值。</li>
</ol>
2. 流动池组装与双层膜制备
流动池和双层膜制备的一般步骤此前已有详细描述14。本文重点介绍在Bioptech流动池上制备含有His6标签gp120 DH12双层膜的具体方案。对于涉及传染性病毒或感染细胞的研究，以及因试剂有限而需使用小体积的情况，可采用一次性Ibidi流动腔（sticky Slide I 0.2 Luer），并按照第2.4–2.9步相同的双层膜制备流程进行操作。有关Ibidi流动腔的更多信息可从公司网站获取：<a href="http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf">http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf</a>。
<ol>
	<li>配制Pirhana溶液（45 ml 痕量金属级98%硫酸和15 ml 30%过氧化氢）14。使用塑料夹将盖玻片浸入Pirhana溶液中15分钟。</li>
	<li>将盖玻片转移至盛有超纯水的烧杯中，每片在流动水下冲洗2分钟（每面各1分钟）。置于支架上晾干。</li>
	<li>按照先前所述方法组装Bioptechs FCSII腔室14。</li>
	<li>使用含有12.5% Ni2+螯合脂质的脂质体混合物，用于在双层膜表面捕获并呈递His6-gp12016。将1 μl脂质体混合物液滴加到微流道载玻片上，注意不要让移液枪头接触玻璃表面。为在每个流动池中制备最多5个双层膜，重复加样最多4次，共形成5个1 μl液滴，如先前所示14。</li>
	<li>将盖玻片覆盖在脂质上。用不锈钢夹具底座覆盖白色密封环，将整个装置翻转并密封。用记号笔标记双层膜的位置。室温孵育10分钟。</li>
	<li>如视频所示，将带有二通旋塞的管路连接至左侧灌流管。使用三通旋塞在管路末端形成正弯月面（该管路先前已充满含人血清白蛋白（HSA）的HEPES缓冲盐水（HBS/HSA：50 ml 10x HBS [10x HEPES缓冲盐水：200 mM HEPES，pH 7.2，1.37 M NaCl，50 mM KCl，7 mM Na2HPO4，60 mM D-葡萄糖]，20 ml 25x HSA，500 μl 1 M CaCl2，1 ml 1 M MgCl2，加dH2O至总体积500 ml，并用0.22 μm滤膜过滤），且无气泡）。将管路连接至右侧灌流管，并轻轻推动缓冲液通过流动池。</li>
	<li>用约300 μl含100 μM NiCl2的酪蛋白溶液封闭双层膜：将溶液装入1 ml注射器，并连接至三通旋塞的开口端。轻轻推动缓冲液，然后在卸下注射器前关闭两个旋塞。室温孵育30分钟。</li>
	<li>加入His6标签的AF488标记gp120（浓度按先前文献16所述确定）。我们使用约250个gp120分子/μm2，以模拟HIV-1病毒颗粒表面Env簇的局部密度17。类似地，如先前报道14，我们在双层膜上使用约250个分子/μm2的ICAM-1。加样方式与酪蛋白相同。室温避光孵育30分钟（用铝箔覆盖）。相同步骤可用于将其他蛋白（如His12标签的Cy5标记ICAM-1）整合至双层膜上。</li>
	<li>用5 ml缓冲液洗涤双层膜。</li>
</ol>
3. 通过荧光漂白恢复技术对双层膜进行质量控制
双层膜中的蛋白质必须具有侧向扩散能力。在将细胞添加到双层膜之前，必须确认所制备的双层膜中蛋白质的流动性。本文介绍一种荧光漂白后恢复（FRAP）方法3，该方法可在大多数采用物镜照明的全内反射荧光（TIRF）、宽场落射荧光或激光扫描共聚焦显微镜上手动完成。实验目标是成像脂质双层中完全均匀的荧光区域，对某一区域进行漂白，并监测未淬灭分子重新进入漂白区域的过程。若在2分钟内恢复50%，可视为可接受。所有主要显微镜制造商（Leica、Nikon、Olympus、Zeiss）均提供适用于此应用的物镜照明TIRF系统。尽管各公司在TIRF照明方式及其他操作功能上存在差异，但成像质量基本相同。
<ol>
	<li>使用较低的激发强度以尽量减少光漂白。使用高数值孔径的物镜，例如数值孔径（N.A.）1.3至1.45的40倍、60倍或100倍物镜。当使用标准荧光显微镜或全内反射荧光（TIRF）显微镜时，为降低光照强度，可在激发光路中加入中性密度滤光片。大多数激光系统可通过将声光可调滤波器（AOTF）或声光偏转器（AOBS）设置为低电压来实现低照明显微。</li>
	<li>记录“漂白前”图像。若使用冷却CCD相机，为补偿低光条件，可设置2×2或4×4像素合并，增益调高，或采用较长曝光时间（例如数秒量级）。若使用共聚焦显微镜，可打开针孔光阑，增益调高，并采用慢速扫描或图像平均。</li>
	<li>漂白一个区域。若使用标准荧光显微镜或TIRF显微镜，应移除所有中性密度滤光片以实现最大激发强度，关闭视场光阑，并对样品照射数秒。若使用激光扫描共聚焦显微镜，应将激光功率设为最大，并将放大倍数调高约4至8倍以漂白一个区域。共聚焦使用警告：切勿过度放大，以免因光子过于集中而损伤脂双层。</li>
	<li>每隔10至15秒，使用与步骤3.1和3.2相同的照明和成像参数记录图像。通常在2至3分钟内，该区域的荧光强度应恢复至接近“漂白前”图像的水平。快速恢复是脂双层具有良好流动性的标志。若该区域仍保持黑暗，尤其是边缘仍具有高对比度，则表明荧光蛋白在脂双层中无法移动，不应用于后续实验。</li>
</ol>
注意： 在我们目前使用的显微镜中，可将 0.9 mW 的 641 nm 光照射到面积为 240 μm2 的圆形区域，可在不到 4 秒的时间内漂白典型浓度下的荧光 ICAM。读者会发现，只要对 Hg 或 Xe 灯进行关键对准，且漂白时间少于 30 秒，就足以以可重复的方式完成该检测。有关更多细节，我们建议参考文献3。
4. 细胞注射与免疫荧光染色
<ol>
	<li>将流动池预热至 37 °C（可在 37 °C 培养箱中无 CO2 条件下进行约 30 分钟）。</li>
	<li>用 1 ml 注射器将活化的人 CD4+ T 细胞（2–5×106/流动池）加入 HBS/HSA 缓冲液中，总体积约 400 μl。将细胞放入 37 °C 培养箱中孵育约 45 分钟，使其贴附于脂双层表面。若使用 Ibidi 培养小室，每 15–20 分钟补充一次缓冲液。</li>
	<li>注入 2% 多聚甲醛固定细胞，并在 37 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 1 ml 室温 PBS 缓冲液洗涤 3 次。加入 0.1% Triton X-100，在室温下孵育 5 分钟以通透细胞。</li>
	<li>用 1 ml 室温 PBS 缓冲液洗涤 3 次（当检测磷酸化蛋白时，可在 PBS 中加入终浓度为 1 mM 的钒酸钠或其他磷酸酶抑制剂，以防止处理过程中磷酸基团被去除）。使用含 5% 山羊血清的酪蛋白在室温下封闭 25 分钟。所用动物血清类型取决于二抗来源。</li>
	<li>用 1 ml 室温 PBS 缓冲液洗涤 3 次。每流动池加入约 300 μl 缓冲液稀释的一抗，室温孵育 30 分钟至 1 小时。为检测初始的膜近端激活信号，我们使用针对磷酸化 Lck（pLck）、总 Lck 或 Fyn 的特异性抗体。</li>
	<li>用 1 ml 室温 PBS 缓冲液洗涤 3 次。加入适当荧光标记的二抗（操作方式与一抗相同）。在本实验中，我们使用 Alexa Fluor 568 标记的山羊抗兔二抗。室温孵育 20 分钟，再用 1 ml PBS 缓冲液洗涤 3 次。</li>
	<li>注意：必须设置仅使用二抗（不加一抗）的对照脂双层。按照步骤 4.1–4.5 操作，跳过步骤 4.6，然后进行步骤 4.7。该对照用于评估二抗的非特异性结合水平。或者，也可使用直接标记的一抗。</li>
</ol>
5. 通过全内反射荧光显微镜进行图像采集
全内反射荧光显微镜（TIRF）可将荧光信号的激发范围限制在玻璃基质与细胞界面处约250 nm或更薄的光学平面内。这确保了所采集的图像仅来源于脂双层以及紧邻的细胞膜结构，因此仅能观察到位于突触部位的分子。由于TIRF仅对细胞底部靠近膜的区域进行成像，那些被内吞或重新分布至细胞背侧膜的蛋白质将无法被检测到。因此，可能需要额外采用标准宽场显微镜或共聚焦显微镜进行成像，以比较并确定目标蛋白在突触区域与其他细胞区域内的累积或分布情况。
所有主要的显微镜制造商（Leica、Nikon、Olympus、Zeiss）均提供配备物镜照明的全内反射荧光（TIRF）系统，适用于本应用。尽管各公司提供的TIRF照明方式及其他操作功能存在差异，但成像质量基本相同。每种TIRF显微镜在操作细节上各有不同，但以下通用规则适用于获取高分辨率图像。
<ul>
	<li>光照强度应保持较低，以避免荧光漂白。</li>
	<li>相机应具有线性响应。</li>
	<li>相机应能够对宽动态范围成像且不发生饱和。</li>
	<li>所有设置应保持恒定，以进行定量分析。</li>
</ul>
6. 数据分析
为了研究CD4+ T细胞在病毒突触（VS）处与gp120相互作用所激活的细胞内信号通路，需对全内反射荧光（TIRF）显微图像进行定量分析，以确定Lck和Fyn等细胞内信号分子是否被激活并募集到突触部位15。本文介绍一种适用于大多数图像分析软件包（如ImageJ和Metamorph）的简便方法。本实验中我们采用可在Windows、Macintosh和Linux系统上运行的ImageJ软件进行分析12。
在 分析 &gt; 设置测量值 选项卡中，勾选 面积 和 平均灰度值 对应的复选框。当您在图像上创建一个感兴趣区域（多边形或手绘闭合形状），并执行 分析 &gt; 测量 操作时，软件会将此次测量的数据记录到结果表格中。面积的单位为像素数量或 μm2。平均灰度值表示以任意单位计的平均强度，需从中减去背景强度。将（平均灰度值减去背景强度）乘以面积，即可得到以任意单位表示的蛋白整合强度。
 
<ol>
	<li>将测量参数设置为平均值（Mean）和面积（Area）。</li>
	<li>打开一个实验条件下的图像。</li>
	<li>针对每个细胞，勾画并测量目标区域（mean），同时勾画并测量目标区域外的一个区域作为背景（background）。</li>
	<li>完成一个实验条件的测量后，可将数据复制粘贴至 Excel 或其他电子表格程序，或直接保存测量结果。</li>
	<li>对每个实验条件重复执行步骤 6.2。</li>
	<li>完成所有测量后，计算结果。计算公式如下： 
	平均强度 = 目标区域平均值 - 背景值 
	总强度 = 平均强度 × 面积</li>
</ol>
7. 代表性结果
为了检测由于gp120在病毒突触（VS）处相互作用而引起的初始膜近端信号分子Lck和Fyn的活化与募集，将原代人CD4+ T细胞接种到含有gp120和ICAM-1的双层膜上15。将细胞接种至仅含ICAM-1的双层膜作为对照，以确定信号的本底水平。对于在含gp120和ICAM-1双层膜上的细胞，测量其gp120接触区域内的特异性荧光强度；而对于与仅含ICAM-1双层膜相互作用的细胞，则测量其整个接触区域的荧光强度。平均荧光强度的增加表明信号分子向病毒突触（VS）的募集和活化增强。这一点将通过总荧光强度的相应升高得到进一步证实。然而，如果总荧光强度没有变化，则提示信号分子发生了重新分布。
当细胞与含有gp120和ICAM-1的双层膜相互作用后，总Lck蛋白和磷酸化Lck(Y394)被募集至病毒突触（VS）界面，并与gp120共定位（图1和图2）。总Lck的平均强度（图1）在同时含有gp120和ICAM-1的双层膜上高于仅含ICAM-1的双层膜，但整合强度水平（图1）相似，提示在CD4+ T细胞与gp120结合后，Lck被重分布至中央簇状区域。然而，对pLck(Y394)的定量分析（图2）显示，在含有gp120和ICAM-1的双层膜上，其平均强度高于仅含ICAM-1的双层膜，且整合强度在同时含有gp120和ICAM-1的双层膜上也更高。这表明，尽管在结合gp120和ICAM-1的细胞与仅结合ICAM-1的细胞中，界面处总Lck的水平相似，但gp120的结合增强了Lck激活环上Y394位点的磷酸化。相比之下，Fyn未被募集至VS（图3），因为在仅含ICAM-1的双层膜上，细胞接触区域中的Fyn含量高于同时含有gp120和ICAM-1的双层膜。因此，我们得出结论：在HIV-1 gp120诱导的VS中，Lck而非Fyn是发挥活性的激酶。
图示：HIV-1 gp120诱导的免疫突触（VS）中膜近端信号转导。图中显示了在gp120+ICAM-1双分子层（上图）和ICAM-1双分子层（下图）上的代表性细胞图像。单个细胞的荧光强度在人工勾画的细胞投影区域内部进行定量分析，如图1中黄色线条标记的区域所示。左侧和右侧图表分别展示了通过全内反射荧光显微镜（TIRF）检测到的平均强度和总积分强度的定量结果。每种条件下共分析了30至350个细胞。标尺 = 5 μm。数据来自三次重复实验中的一次。
<img alt="显微镜图像及强度图中分析gp120和ICAM-1与总Lck的共定位。" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 将CD4+ T细胞加入含有gp120和ICAM-1或仅含ICAM-1的双层膜上，孵育45分钟后固定并进行总Lck染色。
<img alt="gp120 与 ICAM-1 在细胞中的共定位；荧光显微镜；pLck(Y394) 分析；图示曲线。" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 将 CD4+ T 细胞加入含有 gp120 与 ICAM-1 或仅含 ICAM-1 的双层膜上，孵育 45 分钟后，固定并进行 pLck(Y394) 染色。
<img alt="gp120 和 ICAM-1 共定位；免疫荧光、强度图、统计分析。" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 
图 3. 将 CD4+ T 细胞加入含有 gp120 和 ICAM-1 或仅含 ICAM-1 的双分子层上，孵育 45 分钟后固定并用总 Fyn 抗体染色。

<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

先前的研究已在细胞-细胞共轭系统中观察到病毒突触（VS），但这些研究未能提供足够高分辨率的图像以观察突触处的超分子结构。在我们的实验室中，我们利用玻璃支撑的平面双层系统来模拟感染细胞表面，该表面表达病毒包膜蛋白gp120和细胞黏附分子ICAM-1。结合全内反射荧光（TIRF）显微镜技术——该技术可高信噪比地检测距双层表面100–200 nm范围内的荧光信号——我们能够观察到gp120与ICAM-1在病毒突触处的超分子分离现象。此外，标准免疫染色方法也可应用于该双层系统，本文中即利用该方法检测并量化了活性Lck分子特异性募集至病毒突触处的gp120接触区域，而Fyn则未被募集15。因此，平面双层系统为通过TIRF显微镜以及宽场或共聚焦照明方法在二维平面上对突触界面进行高分辨率成像提供了实验平台。然而，该系统也存在局限性，例如无法重现配体流动性调节、膜的非平面弯曲以及生物膜的波动等特性。此外，该系统属于体外（in-vitro）模型，因而还存在其他局限性，例如缺乏感染细胞表面本应存在的其他膜分子以及调控分子流动性和细胞运动性的细胞骨架系统。同时，分子的动力学行为及其分布状态（例如gp120三聚体与单体的比例）在双层膜上的呈现可能并不完全符合生理状态。尽管如此，即使存在上述局限，该系统在研究病毒-细胞或细胞-细胞相互作用方面仍具有重要价值，且这些方法可为希望获得高分辨率图像以揭示传统细胞-细胞共轭系统中无法分辨的超分子结构的研究人员提供有益参考。

<table><tbody><tr><td>His标签HIV gp120</td><td>由Dr. Cho惠赠</td><td></td><td>DH12</td></tr><tr><td>His标签HIV gp120</td><td>Immune Technology</td><td></td><td>多种X4或R5嗜性</td></tr><tr><td>HSA</td><td>Williams Medical Company</td><td>521302</td><td>人血清白蛋白 25%</td></tr><tr><td>Amicon Ultra离心滤膜</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC803024</td><td>Ultracel-30K</td></tr><tr><td>Lck兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2787</td><td></td></tr><tr><td>p-Lck兔多克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-101728</td><td>Tyr 394</td></tr><tr><td>Fyn兔单克隆抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>04-353</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 2&amp;#x00B0; 抗体</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A11034</td><td>山羊抗兔IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A-20000</td><td>羧酸琥珀酰亚胺酯</td></tr><tr><td>FCS2腔室</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>微流道载玻片</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>30mm圆形带孔玻片</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>厚度0.75mm</td></tr><tr><td>矩形垫圈</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-250</td><td>14×24，厚度0.25mm</td></tr><tr><td>Tygon导管</td><td>Bioptechs</td><td>20202275</td><td>1/16&quot; (25英尺)</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Bio-Rad</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>二通旋塞阀</td><td>Bio-Rad</td><td>7328102</td><td></td></tr><tr><td>Sticky Slide I &lt;sup&gt;0.2&lt;/sup&gt; Luer</td><td>Ibidi</td><td>80168</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>1ml注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>DOGS-NTA</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>790404C</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td>40mm</td></tr><tr><td>TIRF显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

在合成脂双层上成像hiv-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染最有效的传播途径是通过细胞间的直接传播2,10,11。CD4+ T细胞之间的这种细胞间转移涉及病毒突触（virological synapse, VS）的形成，该结构是一种依赖F-肌动蛋白的细胞间连接，当感染细胞表面的HIV-1包膜糖蛋白gp120与靶细胞上的CD4分子以及趋化因子受体（CKR）CCR5或CXCR4结合时即可形成8。除了gp120及其受体外，其他膜蛋白，特别是黏附分子LFA-1及其配体ICAM家族，在VS的形成和病毒传播中也发挥重要作用，因为它们不仅存在于病毒感染的供体细胞和靶细胞表面，也存在于HIV-1病毒颗粒的包膜上1,4,5,6,7,13。VS的形成还伴随着由gp120与其受体结合所触发的细胞内信号转导事件。事实上，我们最近的研究表明，CD4+ T细胞与gp120相互作用可诱导TCR信号体相关信号分子的募集和磷酸化，这些分子包括Lck、CD3ζ、ZAP70、LAT、SLP-76、Itk和PLCγ15。
本文介绍了一种用于可视化病毒突触（VS）形成过程中发生的超分子排列及膜近端信号事件的方法。我们利用玻璃支撑的平面双层系统作为简化模型，以模拟携带病毒包膜蛋白gp120和细胞黏附分子ICAM-1的HIV感染细胞表面。该实验方案详细描述了监测HIV-1 gp120诱导的VS组装及信号激活事件的一般步骤，包括：i）在流动池中制备和组装双层膜；ii）注入细胞并进行免疫荧光染色，以检测与双层膜上的HIV-1 gp120和ICAM-1相互作用的细胞内信号分子；iii）通过全内反射荧光（TIRF）显微镜获取图像；以及iv）数据分析。该系统能够获得比传统细胞-细胞体系更高分辨率的VS界面图像，因为它可检测到VS各个分子组分形成的 distinct clusters，以及被招募至这些亚结构域的特定信号分子。

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染最有效的传播途径是通过细胞间传播2,10,11。这种细胞间的转移过程发生在……

该方法可构建模拟感染细胞表面的脂质双层。为了研究与人原代CD4+ T细胞形成的HIV病毒学突触，首先用荧光染料标记目标蛋白，然后构建脂质双层，使细胞形成突触，再固定细胞并用荧光抗体染色，以可视化突触中的信号分子。随后利用全内反射荧光显微镜或TIRF显微镜，获取正在形成突触的细胞内信号分子的图像。分析草坪图像，以确定活性信号分子相对于病毒突触结构的定位。该实验方法可用于判断细胞蛋白（如淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 LCK）是否被招募至 HIV 病毒突触。该方法有助于解答 HIV 病毒学和免疫学中的关键问题，例如哪些细胞组分参与了病毒突触的形成。突触形成中的作用是什么，以及它如何影响细胞间 HIV 的传播？该啤酒系统提供了一种终末期观察突触的方法，其优势在于能够在单个平面上以高空间分辨率可视化突触。结果清晰地描绘了突触结构，构建啤酒装置和组装流动池是一种技艺，一种艺术形式。在此，我们演示在生物光学流通池上进行双通道（bilar）制备的方法，适用于使用感染性病毒或感染细胞的研究，或在试剂有限而需使用小体积时的情况。一次性OB流通池也可采用相同的双通道制备流程。Michael Kramer 和我将演示一种蛋白质标记的实验步骤。选择如 LOR 4 88 等荧光染料，该类染料可有效结合蛋白质，具有足够的光稳定性以用于显微镜成像，并且与显微镜设备上可用激光的激发波长相匹配。以纯化的 His 标签 GP one 20 DH 12 蛋白为起始材料。使用截留分子量为 50 千道尔顿的离心过滤装置，将蛋白质缓冲液置换为无菌 PBS。接下来，检测pH值，并加入pH 9.0的碳酸氢钠，使碳酸氢钠的终浓度为50毫摩尔，pH值约为8.5。然后加入摩尔过量十倍的LOR 4 88平均反应性荧光染料。将该混合物避光孵育45分钟至1小时。使用离心过滤装置去除多余的染料。向柱中加入新鲜的无菌 PBS，继续洗涤以去除游离染料。然后将 GP one 20 蛋白浓缩至约 1 毫克/毫升。在 488 纳米处测定荧光染料的浓度。同时使用 NanoDrop 分光光度计，选择蛋白质和标记物（proteins and labels）设置来测定蛋白质浓度。将两个数值相除，以确定每分子蛋白质的荧光强度。用塑料夹准备45毫升硫酸和15毫升30%过氧化氢的piranha溶液。将盖玻片浸入溶液中15分钟。将盖玻片转移至盛有PIKA纯化水的烧杯中，每张盖玻片用流水冲洗两分钟，每面各一分钟，然后置于支架上晾干。按照Varona等人2008年所述方法，组装光学F CS双室装置。接下来，在不触碰玻璃表面的情况下，用移液头捕获并呈递hiss GP one 20至双分子层表面。用移液器将五滴每滴一微升的脂质体混合物滴加到微流槽载玻片上，以在每个流动池中制备五个双层膜。现在将盖玻片放置在脂质上方。接着，用不锈钢夹具底座覆盖白色固定环。将整个装置翻转并密封。然后标记双层膜的位置，在室温下孵育10分钟。接着，将带有二通止流夹的管路连接到左侧灌流管上。用含有1%人血清白蛋白的Heis缓冲盐水填充连接至三通旋塞的管路，并确认装置内无气泡。随后将此管路连接至右侧灌流管，并形成正弯月面。轻柔地推动缓冲液通过流动池，以封闭双层膜。将装有300微升100微摩尔氯化镍ENC酪蛋白的一毫升注射器连接至三通旋塞，轻轻推动缓冲液通过，关闭两个旋塞后再取下注射器。室温下孵育30分钟。现在加入250个分子的hiss标记LOR 4 88荧光标记的GP120，每微米以模拟HIV V1表面发现的内簇局部密度。室温避光孵育30分钟，用5毫升H-B-S-H-S-A缓冲液洗涤各层，将流动池平衡至37摄氏度。使用1毫升注射器，将活化的人CD4阳性T细胞加入400微升1%人血清白蛋白溶液中，在37摄氏度培养箱中孵育45分钟，以使细胞附着于脂质层。接着，加入2%多聚甲醛固定细胞，在37摄氏度孵育10分钟。用1毫升缓冲液洗涤三次。PBS洗涤一次，每次1毫升，共三次，然后在室温下加入0.1% Triton X-100作用5分钟以通透细胞，随后用含5%小牛血清的酪蛋白在室温下封闭25分钟。再用PBS洗涤三次。随后每张流式细胞板加入300微升一抗抗体和缓冲液，孵育20分钟至1小时。室温下用 PBS 洗涤三次后，加入含适当荧光标记的二抗缓冲液。在实验中，层对照样品仅用二抗处理，以确定该试剂产生的非特异性信号水平。室温孵育 20 分钟，然后用一毫升缓冲液洗涤三次。采用全内反射荧光显微镜对所有样品进行PBS成像。通过图像分析软件包（如ImageJ的“分析-测量”选项卡）对图像进行定量分析。勾选面积和平均灰度值的复选框。在图像上选择一个多边形或自由绘制的闭合区域作为感兴趣区域。然后选择分析测量选项卡，以便软件记录此次测量的数据。在结果表格中，将测量参数设置为平均值和面积，然后打开每种实验条件下细胞轨迹对应的图像，测量感兴趣区域及轨迹，并为每种实验条件测量一个背景区域。复制测量数据并粘贴到 Excel 中。当所有数据收集完毕后，计算以任意单位表示的平均强度。从平均值中减去背景强度，然后乘以面积，得到蛋白质的积分强度（以任意单位表示），用于测量初始膜近端信号分子的激活和募集情况。由于与病毒突触处的GP120相互作用，将人原代CD4阳性T细胞引入含有G120和ICAM1的双层膜上；而将细胞引入仅含ICAM1的双层膜作为对照，以确定信号的基础水平。当细胞与含有GP120和ICAM1的双层膜相互作用后，LCK蛋白被募集至病毒突触界面，并与GP120共定位。在同时含有GP one 20和ICAM one的双层膜上，总LCK的平均强度高于仅含有ICAM one的双层膜。有趣的是，总整合强度水平相似。综上所述。这些数据表明，LCK 会重新分布形成一个中心簇。在 CD4 阳性 T 细胞与 GP120 结合后，通过 TURF 显微镜检测并定量了磷酸化 LCK 酪氨酸 394 的平均强度和总强度。结果表明，GP one 20 的结合增加了 LCK 激活环上酪氨酸 394 位点的磷酸化水平。相比之下，在仅含 ICAM one 的双分子层上，细胞接触区域存在的 Finn 多于同时含有 GP one 20 和 ICAM one 的双分子层。因此，Finn 未被招募到病毒突触中。因此，我们得出结论：在HIV-1 gp120诱导的病毒学突触中，发挥活性激酶作用的是LCK，而非Finn。观看本视频后，您应能充分理解如何制备负载特定蛋白的Biers细胞，如何在流动池中通过全内反射显微镜对细胞间相互作用进行免疫荧光染色成像，以及如何进行基础分析。该Biers系统还可用于活细胞成像，以实时监测病毒学突触形成的动态过程。此外，细胞可转染带有荧光标记的蛋白质，例如 GFPs Z 70。这使得能够实时追踪信号分子在突触处分布与募集的变化。

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

艾滋病毒的成像1信封引起的病毒学突触信号合成脂双层

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。本文中，我们展示了将已知可调控突触形成的细胞黏附蛋白锚定于脂质双层膜上层，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察突触形成的方法。...

用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

本方案描述了一种利用冷冻电子断层扫描和三维图像处理技术测定膜蛋白结构的高通量方法。内容涵盖了样品制备、数据采集、数据处理与解析的详细步骤，并以HIV-1包膜糖蛋白作为该方法的代表性研究目标进行示例。这些计算处理流程的设计使得研究人员和学生能够远程开展工作，参与数据处理与结构分析。...

利用冷冻电子断层扫描与自动化子断层平均化技术测定HIV包膜糖蛋白的分子结构

来源：Olety, B., et. al., 可视化HIV-1 Gag与巨大单层囊泡（GUV）膜的结合。 J. Vis. Exp.

在巨大单层囊泡膜上可视化病毒结构蛋白的组装

本视频展示了一种在支撑脂质双层（SLB）上可视化自然杀伤（NK）细胞免疫突触形成的实验技术。首先，将荧光标记的NK细胞活化受体配体与SLB结合，随后加入NK细胞进行孵育。接着，对细胞进行聚合肌动蛋白和含穿孔素的杀伤颗粒染色。该方法可利用受激发射损耗（STED）显微镜实现对突触形成过程的可视化观察。...

在支撑脂双层上自然杀伤细胞免疫突触形成的超分辨率成像

一种用于研究T细胞与支撑性平面脂双层相互作用的体外技术

本视频展示了免疫突触拓扑结构的活细胞成像，研究携带荧光抗原的T淋巴细胞与上皮细胞之间的相互作用。荧光显微镜显示内皮细胞中红色细胞质的移位以及黄色膜环的出现，表明免疫突触的形成。...

通过活细胞成像评估免疫突触拓扑结构

了解病毒表面抗原的构象对于评估抗体中和作用以及指导有效疫苗免疫原的设计至关重要。本文介绍一种基于细胞的ELISA检测方法，可用于研究特异性抗Env抗体对转染细胞表面表达的三聚体HIV-1...

利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

本文介绍了一种将玻璃支撑脂质双层技术与受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术相结合的方法，用于形成免疫突触。本实验方案的目的是为使用者提供成功实施这两种技术所必需的操作步骤和指导。...

在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞之间形成的动态“免疫突触”所调控。本方案描述了研究内皮细胞的方法，既可将其作为研究尚不充分的生理性抗原呈递细胞，也可作为新型“平面细胞抗原呈递模型”进行研究。...

用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

我们在此展示一种 体外 基于小麦胚芽表达系统合成的YFP标记Gag蛋白，通过可视化分析HIV-1 Gag与脂质膜之间的相互作用的膜结合实验 体外 翻译系统和通过电形成技术制备的GUVs。...

HIV-1 Gag 与巨大单层囊泡（GUV）膜结合的可视化观察

本方案用于成像免疫突触的形成过程以及随后向免疫突触定向的分泌性物质运输。细胞 conjugates 由经超抗原刺激的 Raji 细胞（作为抗原呈递细胞）与 Jurkat 克隆细胞（作为效应辅助性 T...

成像人类免疫突触

了解利用全内反射荧光显微镜可视化HIV-1包膜诱导的病毒学突触形成的方法。该技术通过合成脂双层模拟感染细胞表面，帮助研究者分析信号分子的定位与LCK蛋白的招募机制。

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

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