Name: 共培养内皮细胞介导成熟的人类胚胎干细胞向胰腺中胰岛素生成细胞在定向分化的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学习利用内皮细胞共培养技术促进人胚胎干细胞向胰腺胰岛素生成细胞分化的多阶段方案。该方法通过免疫荧光和QPCR验证，可显著提高胰岛素表达水平和细胞产量，为糖尿病治疗研究提供新途径。

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我们感谢美国国立卫生研究院新创新者奖 DP2 116520 和橡树岭联合大学拉尔夫·鲍威尔青年教师提升奖的支持。

1. 细胞培养
<ol>
 <li>人胚胎干细胞H1系（WiCell）在经hESC级Matrigel包被的培养孔中，使用mTeSR1培养基进行培养，每日更换培养基。Matrigel包被液的制备方法为：将300 μl hESC级Matrigel加入25 ml DMEM:F12中稀释。每孔六孔板加入1 ml该Matrigel溶液，或每孔十二孔板加入400 μl，室温孵育1小时以完成包被。当细胞集落直径达到1至1.5 mm时，以1:4的传代比例通过机械刮取方式进行传代。</li>
 <li>人微血管内皮细胞（RHMVEC，VEC technologies）在MCDB-131培养基中培养，每隔一天更换一次培养基。当细胞融合度达到80%时，以1:3的传代比例通过胰酶消化法进行传代。本研究使用第3至第7代的内皮细胞。</li>
</ol>
2. 储备液的配制
<ol>
 <li>将 Activin A 溶于含 0.1% 牛血清白蛋白的无菌 PBS 中，配制成 50 μg/mL 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。</li>
 <li>将 EGF 溶于无菌 10 mM 乙酸中，配制成 500 μg/mL 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。</li>
 <li>将胰岛素加入酸化 H2O（pH ≤2）中，配制成 10 mg/mL 的溶液；酸化水的制备方法为：将 0.1 ml 冰乙酸加入 10 ml 水中。</li>
 <li>将 DAPT 溶于 DMSO 中，配制成 18 mg/mL 的溶液，再用 DMEM:F12 稀释至 300 μM，分装后于 -20 °C 保存。</li>
 <li>将 KAAD-Cyclopamine 溶于 DMSO 中，配制成 5 mg/mL 的溶液，再用 DMEM:F12 稀释至 2 μM，分装后于 -20 °C 保存。</li>
 <li>将全反式维甲酸溶于 95% 乙醇中，配制成 2.7 mg/mL 的溶液，再用 DMEM:F12 稀释至 2 mM，分装后于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
3. 定形内胚层（DE）与胰腺前体细胞（PP）的诱导
<ol>
 <li>当 hESC 集落直径达到 1 至 1.5 mm 时，通过添加补充有 B27、0.2% BSA、100 ng/ml Activin A 和 1 μM Wortmannin 的 DMEM:F12 培养基进行定型内胚层（DE）诱导，持续 4 天（第 0 天至第 4 天），每天更换培养基。</li>
 <li>完成定型内胚层诱导后，更换培养基为补充有 B27、0.2% BSA 和 0.2 μM KAAD-Cyclopamine 的 DMEM:F12，以诱导胰腺前体细胞，持续 24 小时（第 4 天至第 5 天）。</li>
 <li>24 小时后，更换培养基为补充有 B27、0.2% BSA、0.2 μM KAAD-Cyclopamine 和 2 μM 全反式维甲酸的 DMEM:F12，继续培养 3 天，每天更换培养基（第 5 天至第 8 天）。</li>
</ol>
4. 胰腺成熟
<ol>
 <li>PP 诱导后，所有组别均更换为成熟培养基，培养基成分为添加了 B27、0.2% BSA、10 mM 尼克酰胺、25 μg/ml 胰岛素、30 nM Na2SeO3 和 50 μg/ml 转铁蛋白的 DMEM:F12，持续培养 2 天，每天更换培养基（第 8 天至第 10 天）。</li>
 <li>在成熟培养基中培养 2 天后，采用多种不同条件并行进行最终的成熟步骤，以进行比较。诱导分化的条件如下：(i) 使用 Notch 抑制剂 DAPT；(ii) 仅使用共培养培养基，不添加内皮细胞作为对照；(iii) 与 RHMVEC 细胞进行接触式共培养。细胞在 DAPT 或共培养培养基中维持一周（第 10 天至第 17 天），每天更换培养基。
 <ol>
 <li>DAPT 培养基通过在成熟培养基中添加 30 μM DAPT 制备。该组细胞首先在完全 MCDB131 培养基中暴露 24 小时，随后转入 DAPT 培养基中培养 6 天（第 11 天至第 17 天）。</li>
 <li>共培养培养基通过在 MCDB-131 培养基中添加 B27、0.2% BSA、10 mM 尼克酰胺、10 ng/ml EGF、1 μg/ml 氢化可的松、10 mg EndoGro 和 90 μg/ml 肝素制备。在培养基对照条件下，分化中的细胞先在完全 MCDB-131 培养基中培养 24 小时（第 10 天至第 11 天），之后更换为共培养培养基继续培养 6 天（第 11 天至第 17 天）（无内皮细胞）。</li>
 <li>在接触式共培养条件下，将一百万个 RHMVEC 细胞加入含有分化中细胞的完全 MCDB-131 培养基（VEC technologies）中，培养 24 小时（第 10 天至第 11 天），以允许细胞贴壁。24 小时后，更换为共培养培养基，继续培养 6 天（第 11 天至第 17 天），每天更换培养基。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. qRT-PCR 分析
<ol>
 <li>在每个分化阶段（内胚层、胰腺前体细胞、成熟胰岛）结束时，收集细胞并使用 NucleoSpin RNA II 提取试剂盒按照制造商说明书提取 RNA。</li>
 <li>通过检测 RNA 在 260 nm 和 280 nm 处的吸光度分析 RNA 质量，随后使用 SmartSpec Plus 分光光度计进行 RNA 定量。</li>
 <li>使用 ImProm II 逆转录试剂盒按照制造商说明书进行逆转录反应。所有反应均使用 100 ng RNA 进行。</li>
 <li>采用 Mx3005P QPCR 系统（Agilent）和 Brilliant II SYBR Green QPCR 预混液按照制造商说明书进行 qRT-PCR。所用引物列于表 1。初始变性步骤为 50 °C 反应 2 分钟，随后 95 °C 反应 10 分钟；进行 50 个扩增循环，每个循环包括：95 °C 变性 30 秒，54 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分钟。</li>
 <li>目标 mRNA 表达量相对于未分化细胞的倍数变化通过 CT 值按以下公式计算： 
 ΔCT(标记物i) = CT(标记物i) - CT(GAPDH) 
 ΔΔCT(标记物i) = ΔCT(标记物i)(样品) - ΔCT(标记物i)(未分化细胞) 
 相对表达量(标记物i) = 2-ΔΔCT(标记物i)</li>
</ol>
6. 免疫细胞化学
<ol>
 <li>在每个分化阶段（内胚层、胰腺前体细胞、成熟胰岛）结束时，细胞在室温下用4%甲醛固定15分钟。</li>
 <li>使用0.25% Triton X-100（TX）对固定后的细胞进行通透处理，持续15分钟。</li>
 <li>在含0.05% TX的10%驴血清中孵育30分钟，以阻断非特异性染色。</li>
 <li>在4°C下，用封闭缓冲液按推荐的抗体稀释比例进行一抗孵育，过夜。</li>
 <li>用0.05% TX洗涤细胞三次，每次5分钟。</li>
 <li>在室温避光条件下，用封闭缓冲液稀释的适当二抗孵育细胞1小时。</li>
 <li>用0.05% TX洗涤细胞三次，每次5分钟。</li>
 <li>用Hoescht染料按1:1000稀释于PBS中孵育5分钟进行细胞核染色，随后用PBS洗涤三次。</li>
 <li>使用Olympus IX81倒置显微镜和Metamorph成像软件对固定并染色的细胞进行成像。</li>
</ol>
7. 代表性结果
在未分化的hESC中添加Activin A和Wortmannin共4天，可诱导形成定型内胚层，经qRT-PCR检测定型内胚层标志物Sox17、Cxcr4和Foxa2以及Sox17免疫染色证实，如图2所示。随后添加环巴胺（cyclopamine）和视黄酸诱导分化为胰腺前体细胞，通过胰腺前体细胞标志物的qRT-PCR分析及Pdx1免疫染色加以确认，如图3所示。
在分化的最终阶段，与RHMVEC细胞接触共培养可强烈诱导hESC来源的胰腺前体细胞中胰岛素表达的上调。通过与使用DAPT的对照条件进行比较，分析了共培养介导分化的效率。由于DAPT目前是实现胰腺成熟最常用的方法之一，因此被用作阳性对照。由于共培养是在添加了支持内皮细胞因子的改良培养基中进行的，因此额外设置了不含内皮细胞的培养基对照，以验证培养基对分化的影响。该分析的详细结果见图4。
<img alt="人干细胞向胰腺前体细胞分化的示意图；共培养成熟过程。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 1。"> 
图 1。 将人胚胎干细胞（hESC）分化为胰岛素表达细胞的多阶段方案。
<img alt="基因表达柱状图和SOX17/DAPI染色显微图像；蛋白质比较、细胞研究结果。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2。"> 
图 2。 人类胚胎干细胞向定型内胚层的诱导。A) 人胚胎干细胞（hESC）经Activin A和Wortmannin处理4天后，代表性定型内胚层（DE）标志物的qRT-PCR分析结果。数据已相对于未分化的hESC进行归一化处理。B) Sox17染色（绿色）与DAPI染色（蓝色）显示Sox17在细胞核中的表达。比例尺：50 μm。
<img alt="PDX1/DAPI 分析的基因表达柱状图和荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3。"> 
图 3。 胚胎干细胞来源的内胚层细胞向胰腺前体细胞的诱导。A) 在定型内胚层诱导后，经环杷明和视黄酸处理 4 天的人胚胎干细胞（hESC）来源内胚层细胞中早期胰腺标志物的 qRT-PCR 分析。结果以未分化的 hESC 为参照进行标准化。B) Pdx1 染色（紫色）与 DAPI（蓝色）显示 Pdx1 的核表达。比例尺：50 μm。
<img alt="胰高血糖素和胰岛素表达图谱，C肽免疫荧光显微镜图像，DAPI染色。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图4。"> 
图4。 胰腺成熟阶段 A) 采用DAPT、接触共培养或共培养培养基（对照）进行胰腺成熟后，hESC中胰腺激素的qRT-PCR分析。结果以未分化的hESC为参照进行标准化。p值通过学生t检验获得。B) 与Dil-Ac-LDL标记的RHMVEC（红色）共培养显示，若存在空白区域，则内皮细胞附着于培养板表面（上图）；其他RHMVEC可直接与正在分化的ESC接触（下图）。C) 采用共培养方法分化的细胞进行C肽（绿色）染色。比例尺：12.5 μm（上图）和50 μm（下图）。D) RHMVEC的免疫染色显示RHMVEC中无胰岛素表达。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>标记物</td>
 <td>引物1 (5' 至 3')</td>
 <td>引物2 (5' 至 3')</td>
 <td>参考文献</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SOX17</td>
 <td>CTCTGCCTCCTCCACGAA</td>
 <td>CAGAATCCAGACCTGCACAA</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CXCR4</td>
 <td>CACCGCATCTGGAGAACCA</td>
 <td>GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FOXA2</td>
 <td>GGAGCGGTGAAGATGGAA</td>
 <td>TACGTGTTCATGCCGTTCAT</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDX1</td>
 <td>AAGTCTACCAAAGCTCACGCG</td>
 <td>GTAGGCGCCGCCTGC</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTF1</td>
 <td>CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG</td>
 <td>GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLXB9</td>
 <td>CACCGCGGGCATGATC</td>
 <td>ACTTCCCCAGGAGGTTCGA</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HNF6</td>
 <td>TGTGGAAGTGGCTGCAGGA</td>
 <td>TGTGAAGACCAACCTGGGCT</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAX6</td>
 <td>CGAATTCTGCAGGTGTCCAA</td>
 <td>ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NKX6.1</td>
 <td>AGACCCACTTTTTCCGGACA</td>
 <td>CCAACGAATAGGCCAAACGA</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ISL1</td>
 <td>GATCTATGTCACCTCGCAAGG</td>
 <td>TACAACCACCATTTCACTG</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GLUCAGON</td>
 <td>AGGCAGACCCACTCAGTGA</td>
 <td>AACAATGGCGACCTCTTCTG</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>INSULIN</td>
 <td>AAGAGGCCATCAAGCAGATCA</td>
 <td>CAGGAGGCGCATCCACA</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 用于qPCR反应的引物。

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

在胰腺发育过程中，分化中的胰腺细胞与来自主动脉的内皮细胞紧密相邻；此外，胰岛组织具有高度血管化特征，以促进血糖与胰岛激素的快速交换。鉴于这些事实，内皮细胞在胰腺器官发生过程中发挥重要作用也就不足为奇了。尽管内皮细胞在胰腺发育中的重要性正日益受到重视，但其在 体外 胚胎细胞的分化研究较少。在我们先前的报告中，我们证实了内皮细胞对小鼠胚胎干细胞胰腺成熟具有促进作用 13在本研究中，我们探讨了内皮细胞信号对人胚胎干细胞分化的影响。
本方案中使用了多种内皮细胞，尽管其分化效率存在差异，但总体效果相似。在本报告中，我们展示了人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞与大鼠心脏微血管内皮细胞（RHMVEC）共培养的效果。内皮细胞可通过乙酰化低密度脂蛋白（AC-LDL）染色进行方便地识别，该染色仅特异性地标记内皮细胞。将正在分化的胚胎干细胞与预先染色的内皮细胞共培养后发现，尽管大多数内皮细胞在培养中长期保持存活，但RHMVEC在培养4天后逐渐消失，至成熟培养第6天时已无法检测到。由于RHMVEC的消失简化了后续分析，避免了细胞分选的需要，因此本研究选择该细胞系用于共培...

<table><tbody><tr><td>mTeSR1（含补充剂）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>适用于人胚胎干细胞的Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131</td><td>Invitrogen</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131（完全培养基）</td><td>VEC Technologies</td><td>MCDB-131</td><td></td></tr><tr><td>B27补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;D Systems</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC&lt;/a&gt;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Invitrogen</td><td>W3144</td><td>1&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>KAAD-Cyclopamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>0.2&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>全反式维甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>2&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td>30&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>30 nM</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td>25 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>50 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG&lt;/a&gt;</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>EndoGro</td><td>VEC Technologies</td><td>ENDOGRO</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>90&amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1&amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>ImProm II 反转录系统</td><td>Promega Corp.</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR 预混液</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>600548</td><td></td></tr><tr><td>Sox17 山羊多克隆 IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-17355</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PDX1 山羊多克隆 IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-14662</td><td>1/500</td></tr><tr><td>C-肽 兔多克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4593</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 驴抗山羊 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>1/1000</td></tr><tr><td colspan="4">表2. 试剂与试剂盒</td></tr></tbody></table>

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

胚胎干细胞（ESC）具有两个主要特征：可无限传代扩增 体外 处于未分化状态，具有多能性，因此能够分化为多种细胞谱系。这些特性使胚胎干细胞在细胞治疗和再生医学应用中极具吸引力 1然而，要实现其全部潜力，必须将细胞分化为成熟且具有功能的表型，这是一项艰巨的任务。一种诱导细胞分化的有前景的方法是紧密模拟器官发生过程中的路径 体外 环境。已知胰腺发育以特定阶段进行 2，始于内胚层，内胚层可发育为多种器官，包括肝脏和胰腺。通过添加激活素A调节Nodal信号通路，可实现内胚层诱导 3 联合多种生长因子 4-7定形内胚层细胞随后通过抑制音猬因子（sonic hedgehog）信号通路实现向胰腺谱系的定向分化，该抑制作用可通过以下方式实现 体外 通过添加环杷明 8胰腺成熟由多个并行事件介导，包括抑制 Notch 信号通路、胰腺前体细胞聚集成三维细胞簇、血管化诱导等。迄今为止，最成功的方法 体外 通过添加DAPT抑制Notch信号通路，已实现由胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞的成熟 9尽管如此，这种方法获得的成熟表型产量较低，且功能有所下降。较少被研究的领域是内皮细胞信号在胰腺成熟中的作用，而该作用正逐渐被视为体内胰岛成熟的重要影响因素。 10,11.
本研究探讨了内皮细胞信号在人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞向胰岛样胰岛素生成细胞成熟过程中的作用。我们报道了一种多阶段定向分化方案：首先，通过激活素A（Activin A）联合抑制PI3K通路，将人胚胎干细胞诱导为内胚层；随后，通过环杷明（Cyclopamine）抑制音猬因子（sonic hedgehog）信号通路，并添加视黄酸（Retinoic Acid）以诱导视黄酸通路，实现内胚层细胞向胰腺特化的定向分化；最后，通过共培养体系介导的内皮细胞信号诱导细胞进入最终成熟阶段。尽管在共培养中已测试了多种内皮细胞，但本文主要展示与大鼠心脏微血管内皮细胞（RHMVEC）共培养的结果，主要基于分析的便利性。

本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。

胚胎干细胞（ESC）具有两个主要特征：它们可以在体外无限增殖并维持未分化状态，以及它们具有……

本方案介绍了一种多阶段分化人胚胎干细胞的有效方法，可获得比先前方案更高产量的胰岛素生成细胞。首先，使用激活的 PI3K 抑制剂诱导定型内胚层；随后，通过暴露于拓扑胺 A 和视黄酸以促进胰腺前体细胞的诱导；接下来，将细胞与内皮细胞共培养，以介导胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。通过免疫荧光显微镜和定量PCR进行功能分析，以验证C肽的表达及胰岛素的上调。该技术相较于现有方法（如not）的主要优势在于，能够实现更高的胰岛素上调水平，同时获得更高产量的表达C肽的细胞。将人胚胎干细胞克隆培养至直径1至1.5毫米的大小，使细胞密度达到12孔板中的适当密度。将hESC Matrigel用DMEM/F12培养基稀释至每孔1毫升，同时吸除HSCs中的培养基，并更换为MTR1。随后用刮取法收集细胞，将其加入15毫升离心管中，并加入新鲜MTR1，然后以1:4的传代比例接种至预先经Matrigel包被的12孔板孔中。当扩增的细胞直径达到1至1.5毫米时，通过添加含有活性in a和PI三K抑制剂的定型内胚层诱导培养基启动分化，培养四天。每天更换培养基。首先在含有0.2微摩尔KAAD-环多巴胺的完全D-M-E-M-F 12培养基中培养24小时，开始胰腺前体细胞的诱导。随后，更换为含有0.2微摩尔KAAD-环多巴胺和2微摩尔全反式维甲酸的完全D-M-E-M-F 12培养基，孵育三天，每天更换培养基，继续培养。将细胞在成熟培养基中培养两天，作为体内成熟实验的阳性对照，在进行终末成熟步骤之前，使用 Notch 抑制剂 DAPT 处理 ESC 来源的胰腺前体细胞，之后再进行传代。在显微镜下观察内皮细胞，随后进行胰酶消化并计数细胞，用于接触共培养条件。向完全 MCDB 131 培养基中的分化细胞中加入 100 万大鼠心脏微血管内皮细胞。同时准备仅含内皮细胞的共培养基对照组。将所有处理条件置于培养箱中培养六天，并定期更换培养基。每天从分化过程的每个阶段末尾收集样本细胞。使用NucleoSpin® E-R-R-N-A提取试剂盒，按照制造商说明书提取内胚层细胞、胰腺前体细胞和成熟眼状体的RNA。使用SmartSpec Plus分光光度计和石英比色皿，通过260纳米与280纳米处吸光度比值测定RNA质量，并根据每份样品100纳克RNA模板计算样品浓度。使用即用型反转录试剂盒进行反转录反应。随后，使用所示引物设置定量PCR，将反应体系加入热循环仪并运行定量PCR程序。然后根据CT值，计算在分化各阶段结束时目标mRNA表达量相对于未分化细胞的倍数变化。在室温下用 4% 甲醛固定细胞 15 分钟。然后用 0.25% Triton X-100 处理 10 分钟以透化细胞，阻断非特异性染色。加入含 10% 驴血清的 0.05% TX 溶液，孵育 30 分钟。接下来，将一抗加入封闭缓冲液中，4摄氏度孵育过夜。用含0.05%吐温X-100的缓冲液洗涤样本5分钟。然后将二抗用封闭缓冲液稀释后加入，室温避光孵育1小时。用含0.05% Triton X-100的PBS稀释一抗至1:1000，对细胞核进行染色，孵育5分钟，随后用PBS洗涤三次，每次5分钟。使用倒置显微镜和成像软件采集固定并染色后的细胞图像。将活性因子 a 和疣病毒 manin 加入未分化的人胚胎干细胞中培养四天，可诱导形成定型内胚层。Q-R-T-P-C-R 分析证实了预期的定型内胚层标志物 SOX17、CXCR4 和 FoxA2 的存在。绿色的 SOX17 免疫染色显示与蓝色 DPI 染色的细胞核在此处共定位。通过添加环胺和视黄酸诱导分化为胰腺前体细胞，经胰腺前体细胞标志物的定量逆转录聚合酶链反应（Q-R-T-P-C-R）以及 PDX1 免疫染色得以确认。在分化的最终阶段，与大鼠心脏微血管内皮细胞进行接触式共培养，可强烈诱导人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞中胰岛素表达的上调。L型共培养物与AC-LDL标记的RHM VEC显示ECS附着于培养板的区域。若存在空白区域，则可发现其他RHM VEC直接接触正在分化的ESC，符合预期。对RHM VEC进行免疫染色，结果显示无明显胰岛素表达。肽染色也是共培养方法诱导细胞分化后一种有用的标记。该技术可用于研究干细胞分化过程中细胞间的相互作用，从而显著增强成熟表型的功能性。

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科研

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生物学

共培养内皮细胞介导成熟的人类胚胎干细胞向胰腺中胰岛素生成细胞在定向分化的方法

本文描述了一种从人胎儿胰腺细胞中分离、培养和成像胰岛细胞簇（ICCs）的实验方案。...

人胎儿胰腺细胞簇的分离、培养与成像

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外...

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

本方案比较了两种不同诱导方案在将人牙髓干细胞（hDPSCs）向胰腺谱系分化中的应用...

体外诱导人牙髓干细胞向胰腺谱系分化

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

在本视频中，我们展示了实验室如何常规使用胰蛋白酶对HuES人类胚胎干细胞系进行传代。由JoVE为您提供。...

使用胰蛋白酶传代HuES人类胚胎干细胞系

学习利用内皮细胞共培养技术促进人胚胎干细胞向胰腺胰岛素生成细胞分化的多阶段方案。该方法通过免疫荧光和QPCR验证，可显著提高胰岛素表达水平和细胞产量，为糖尿病治疗研究提供新途径。

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

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