从三维混合细胞球体共培养物中分离乳腺上皮细胞

本实验的总体目标是从三维混合细胞组织培养物中分离上皮细胞，以分析间质成纤维细胞对上皮细胞生物学特性的影响。该目标通过首先建立三维混合细胞类固醇共培养体系来实现，随后将球状体从基质培养物中分离，从而获得共培养后的上皮细胞。

下一步是传代共培养后的上皮细胞，直至其准备好用于分析。最终，可通过显微成像观察培养物以及对共培养后的上皮细胞进行分析，来评估在三维培养条件下暴露于成纤维细胞对上皮细胞行为的影响。例如此处所示的基质侵袭荧光成像和Transwell迁移实验。演示该实验步骤的是我实验室的研究助理Quin。该操作在建立共培养体系的前一天进行。

从冷冻箱中取出基质胶，在4°C冰箱中置于冰上过夜解冻。实验当天，至少在与基质胶混合前一小时将培养基放在冰上。用于稀释解冻后的基质胶。

将共培养所需冰上预冷的 H Mac 培养基体积的一半加入无菌离心管中，置于冰上。然后向该管中加入等体积的解冻 Matrigel，使终浓度为 1:1 的稀释比例，期间保持管子置于冰上。接着，在 24 孔板指定孔的中央加入 50 微升 Matrigel-培养基混合物，将培养板放入 37°C、含加湿空气和 5% CO2 的培养箱中孵育 10 分钟。

然后向孔中再加入 450 微升 Matrigel 培养基混合物，并继续孵育 60 分钟。在第二次孵育期间，用 HME 培养基制备成纤维细胞与上皮细胞 1:1 的悬浮液，浓度为每 0.5 毫升含 0.5 × 10⁵ 个细胞。当 Matrigel 培养基混合物凝固后，轻柔地将细胞悬液滴加至凝胶表面，并将培养物放回培养箱中继续培养两天。

每两到三天更换一次培养基，从孔的侧边极其轻柔地吸出培养基，并轻轻加入新鲜的 HEC 培养基。每天在显微镜下观察类球体的形成情况，根据需要使用明场或荧光显微镜成像。首先使用无菌的 2 毫升玻璃移液管将培养物上下吹打 10 次。然后用玻璃移液管将培养物转移至无菌的 15 毫升离心管中，在室温下以 350 × g 离心 10 分钟。离心后，细胞球体会沉淀在管底。

使用无菌巴斯德吸管尖端轻轻移除离心管顶部被破坏的Matrigel。制备：现在向沉淀中加入1毫升H-MAC培养基，用无菌2毫升玻璃吸管轻轻吹打2至3次，然后将培养物转移至24孔组织培养板的一个孔中。让类固醇细胞贴壁至少48小时后再更换培养基。

随着时间推移，细胞将离开球状结构，以单层形式生长。当细胞培养达到50%汇合度时，采用标准化方案将其传代至35毫米培养皿中培养2至4天，随后再传代至100毫米培养皿中培养3至5天，之后再进行细胞的进一步分析。使用无菌巴斯德吸管吸除培养基，然后手动尽可能去除残留的空壳状球体。在三维球体共培养系统中，如图D、E和F所示，经工程化沉默TM1的成纤维细胞可诱导记忆性上皮细胞的基质侵袭能力增强，相较于图A、B和C中的对照成纤维细胞。请注意，在含有TM1沉默成纤维细胞的球体中，上皮细胞突起侵入基质的现象（如图D和F中箭头所示）。如图J、K和L所示，经工程化过表达TM1的成纤维细胞则导致乳腺癌细胞系SUM159的侵袭能力降低，相较于图G、H和I中的对照成纤维细胞。比较含有TM1工程化成纤维细胞的球体与对照成纤维细胞球体中上皮细胞突起的缺失情况（如图G和I中箭头所示），在共培养球体建立后即可观察到上述差异。

通过在二维环境中重新接种，可以从类固醇中分离出细胞群体。这组图像显示了在此处从Matrigel培养物中分离后，经光学显微镜和荧光显微镜观察的培养物。第0天代表分离后立即成像，第1、2和5天则分别表示分离后的天数。

注意观察离开该类固醇的细胞冠随时间逐渐增多。最终，仅剩下一个几乎无细胞的类固醇残影，此处由箭头标示。在去除残影并传代后，几乎无类固醇残留。

根据所测试细胞的相对生长速率，纯细胞群体可通过连续传代获得，或使用相应的细胞标记物进行分选。本示例中，通过流式细胞术分析样品中的细胞比例，利用绿色荧光和红色荧光分别鉴定表达GFP的成纤维细胞和表达mCherry的上皮细胞，以确定上皮细胞与成纤维细胞的相对比例。

从三维共培养体系中分离后，上皮细胞在较长时间内仍保留由与成纤维细胞共培养所赋予的特性，从而为分析提供了充足的机会。在此示例中，与标记为 C 的对照成纤维细胞相比，暴露于 TM 气一缺乏型成纤维细胞后，共培养的 H max 细胞迁移能力增强，且在从三维共培养体系分离后数周内仍持续存在。在完成该操作后，还可采用其他方法（如分析基因表达变化和表观遗传修饰的方法）来进一步探究成纤维细胞对上皮细胞影响的相关问题。