TransFLP - A基因修改方法霍乱弧菌
2012年10月8日
一个快速的方法来修改的基因组 V.霍乱进行说明。这些修改包括删除单个基因，基因簇和基因组岛屿以及集成的短序列（如启动子元件或亲和标签序列）。该方法是基于对自然的改造和FLP重组。
该程序的目的是使用这种基于自然转化和翻转组合的快速且有缺陷的方法对 vio cray 进行基因作。这是通过首先准备适当的几丁质来源来实现的，因为几丁质是转化的自然诱导剂。在第二步中，使用两轮 PCR 生成 DNA 构建体，并进行自然转化，使含有细菌的质粒 PBR 翻转吸收 PCR 片段并掺入其基因组。
接下来，使用温度升高来诱导质粒编码的脂肪酶，以去除翻转重组靶标或 FRT 位点侧翼抗生素抗性盒。在最后一步中，细菌被编码 FLP 的质粒固化。最终，使用 PCR 和测序来证明遗传作是成功的。
与现有方法（例如使用自杀质粒对 Vire 进行基因纵）相比，该技术的主要优点是这种方法非常快速和有效。首先在标准 1.5 毫升塑料管中称取 50 至 80 毫克甲壳素薄片样品，然后保持管盖打开，高压灭菌器调用后立即关闭盖子，将高压灭菌试剂盒储存在薄片中，在室温下至少需要六个寡核苷酸来扩增感兴趣的 DNA 区域， 以及通过 PCR 的 FRT 侧翼抗生素盒。还建议在插入的 PCR 片段之外包含一对寡核苷酸引物。
这允许小心检查 FRT 侧翼抗生素抗性盒设计、2 号、3 号、4 号和 5 号寡核苷酸的整合和正确切除。引物 2 和 5 应包含至少 28 个碱基对，以便能够充分跪下基因组 DNA 和引物。3 和 4 应用含有质粒的 FRT 罐 FRT 作为模板构建，设计引物 2 和 5，以允许在引物 2 和 3 以及引物 4 和 5 之间的五个主要端进行广泛的互补碱基配对。
现在对于第一轮 PCR，使用寡核苷酸 1 和 2 制备三个同时但独立的 PCR 反应中的第一个，用于扩增定制设计构建体的目标实验区域的上游区域。同时，使用寡核苷酸 3 和 4 制备第二个 PCR 反应，以扩增 FRT 侧翼抗生素盒。例如，在这个实验中，使用了编码 canin 抗性的 A PH 基因。
使用寡核苷酸 5 和 6 以及基因组 DNA 作为模板制备第三次 PCR 反应，同时扩增下游 DNA 区域。然后在纯化所有三个 PCR 片段后开始所有三个样品的 PCR 反应，使用与第一轮获得的所有三个片段等量的混合物作为模板进行第二轮 PCR。这种扩增将由寡核苷酸 1 和 6 催化。
所得 PCR 片段将用作自然转化实验中的转化 DNA。培养霍乱弧菌细胞后，在 30 摄氏度下进行有氧富集培养基。通过在室温下离心收获细菌。
接下来，将细菌培养物以薄片的形式转移到风筝上，并将细胞悬液在 30 摄氏度下孵育过夜。接下来，小心地将至少 200 ng 的第二轮 PCR 衍生片段混合到细菌细胞悬液中。注意不要将细菌从几丁质表面广泛分离，然后将该溶液在 30 摄氏度下孵育一天，不要移动。
现在涡旋，对含有 PBR 翻转质粒的细菌剧烈培养至少 30 秒，将 100 至 300 微升细胞溶液扩散到含有氨苄青霉素的双选择性平板上。除了板中的其他抗生素外，还将细菌细胞培养物在 30 摄氏度下孵育，直到可见菌落。然后从选择性板中分离单个转化体。
通过在 37 摄氏度下在含有氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上培养细菌 16 至 24 小时来开始此步骤。作为可选步骤，将温度改变 2 到 3 小时至 40 摄氏度，因为 PBR 翻转质粒的翻转表达在较高温度下被去抑制。在 37 摄氏度下再孵育 8 小时后，将细菌转移到新鲜的平板上。
现在，在含抗生素和不含抗生素的琼脂平板上平行限制克隆，以检测抗生素敏感性，然后分离出单个产生的抗生素敏感菌落。通过在 30 摄氏度的有氧条件下培养培养物过夜来开始此步骤，富集不含抗生素的培养基。第二天早上，将过夜培养物以 1 比 100 的比例稀释在新鲜的不含抗生素的培养基中，在下午的条纹中或将培养物的平板稀释到普通 LB 琼脂平板上，然后在 30 摄氏度下再孵育平板 8 至 16 小时，直到可见菌落。
在第一个实验中，旨在删除相邻的基因 CTXA 和 CTXB。如刚才所示，生成用于反式翻转法的寡核苷酸亲本菌株，含有 FRT 侧翼抗生素抗性盒的中间菌株，而不是 C-T-X-A-B 的原始 DNA 位点，最终菌株为 C-T-X-A-B 缺失并从抗性盒中释放，均测试其基因型批发 PCR，使用不跪在转化 PCR 片段上的引物进行本实验， 但仅限于染色体 DNA。通过标准气凝胶电泳分离 PCR 片段以确定其大小。
在泳道 1 中，世界 B 型霍乱菌株位于预期的片段大小 3， 143 个碱基对。在泳道 2 中，来自菌株 delta C-T-X-A-B-F-R-T 的 PCR 片段可以。FRT 位于 3， 162 个碱基对处。
在泳道 3 中，与 1 KB 分子量标准相比，delta ctx A B FFR TP CR 片段位于 1， 769 个碱基对处。在第二个去除整个基因组岛的示例中，选择弧菌致病性岛 1 或 VPI 1 作为本实验的目标。trans flip 方法分两步修改。
首先，卡那霉素抗性基因的整合在 PI 1 开始时由单个 FRT 位点进行。然后进行第二轮自然转化，允许插入额外的抗生素耐药性标志物，即庆大霉素耐药性，然后在致病岛的末端插入第二个 FRT 位点。每个凝胶图片上方显示了相应的引物对，并且如前所述继续使用反式 FLP 方法。
亲本、中间和最终菌株均通过泳道 1 中纯化的基因组 DNA 的 PCR 进行验证。野生 V 型霍乱菌株的 PCR 片段在泳道 2 中运行。运行菌株 VPI one FRT can GM FRT 得到的 PCR 片段。
在泳道 3 中，分析菌株 delta VPI one FRT 衍生的 PCR 产物。引物对显示在每个凝胶图片的上方。最后一个菌株缺少整个 VPI 菌株。
在第三个示例中，A T 7 RNA 聚合酶依赖性启动子序列与基因 T fox 整合到上游，基因 T fox 是使用反式翻转方法自然转化的主要调节因子，对标准方案进行了轻微修改。T 7 RNA 依赖性启动子共有序列作为突出端包含在 4 号和 5 号寡核苷酸中，因此该 DNA 序列维持在染色体内。即使在切除抗生素耐药盒后，该构建体仍被整合到含有 V 着色菌株的 T 7 RNA 聚合酶中。
在该菌株中，T 7 RNA 聚合酶基因的表达由 LAC UV 5 启动子驱动，以检测 T Fox Natural 的 T 7 RNA 聚合酶依赖性表达在 LB 培养基中进行转化测定。由于在丰富的培养基中缺乏 T FOX 转录并且缺乏其天然诱导几丁质，因此在这些条件下缺乏基因 T Fox 之前缺乏 T 7 依赖性启动子的亲本菌株在这些条件下是不可自然转化的。这种表型与 T 7 RNA 聚合酶是否由 IPTG 人工诱导无关。
然而，由于 LB 培养基中 LAC UV 5 启动子的泄漏，反式翻转产生的菌株（包含能力基因 T Fox 上游的 T 7 RNA 聚合酶依赖性启动子）确实是可自然转化的富集培养基。产生的 T 7 RNA 聚合酶已经从 T 7 RNA 聚合酶依赖性启动子转录了 T FOX，而无需通过 IPTG 诱导。这启动了自然能力和转化，证实了整合的 T 7 RNA 聚合酶依赖性启动子序列的功能。
由于添加了 LAC UV 5 启动子 IPTG 的诱导剂，T 7 RNA 聚合酶的完全诱导显着增强了这种表型。看完这个视频后，你应该对如何利用几丁质诱导的自然转化和翻转重组的组合来对霍乱 VI 进行基因作有一个很好的了解。一旦掌握，该技术允许您在短短几天内删除基因或基因组岛，以及以定点方式整合 DNA 序列。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文描述了一种快速修改霍乱弧菌的基因方法，包括基因缺失和整合。该技术利用自然转化和FLP-重组实现高效的基因组编辑。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因工程
- 微生物学
- 生物技术
背景
- 霍乱弧菌是一个重要的病原体。
- 基因操纵对于研究基因功能至关重要。
- 传统方法可能耗时较长。
- 该方法旨在简化这一过程。
研究目的
- 开发一种快速的基因组修改方法。
- 促进基因缺失和序列整合。
- 提高霍乱弧菌基因研究的效率。
使用的方法
- 准备甲壳素作为转化诱导剂。
- 通过PCR生成DNA构建体。
- 利用质粒构建体对细菌进行自然转化。
- 使用温度变化来诱导酶活性以移除盒子。
主要结果
- 成功将PCR片段整合到细菌基因组中。
- 证明了抗生素抗性盒子的移除。
- 通过PCR和测序验证了基因修改。
- 建立了高效的基因操纵方法。
结论
- 该方法提供了一种快速有效的修改霍乱弧菌基因组的方法。
- 可以应用于各种基因研究。
- 未来的研究可以在这一技术基础上进一步探索。
常见问题
Executive Industry Relevance
Genetic manipulation of Vibrio cholerae is essential for target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial and vaccine development. The TransFLP method accelerates hypothesis testing by enabling rapid, marker-free chromosomal modifications using natural transformation and FLP-recombination. This supports predictive confidence in early discovery by reducing timeline and technical barriers for functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables rapid deletion of virulence genes like CTXA/CTXB or genomic islands such as VPI-1 to interrogate therapeutic hypotheses and pathway essentiality.
- Operational Value: Uses chitin-induced natural competence and PCR-derived DNA fragments to bypass plasmid cloning and conjugation steps, reducing workflow time from weeks to days.
- Scientific Value: Facilitates site-directed integration of functional sequences (e.g., T7 promoter upstream of Tfox) to study gene regulation and natural transformation competence as a phenotypic readout.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isogenic mutant strains with defined genetic backgrounds for reproducible phenotypic screening and target de-risking.
- Operational Value: Produces quantitative, PCR-verifiable outputs (e.g., fragment size shifts: 3,143 bp → 1,769 bp) enabling standardized strain validation across teams.
- Scientific Value: Supports creation of marker-free strains after FLP-mediated excision, avoiding antibiotic resistance artifacts in downstream assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables deletion of pathogenicity islands (e.g., VPI-1) to assess attenuation and virulence factor contribution in disease-relevant models.
- Operational Value: Allows sequential modifications (e.g., dual antibiotic cassettes with FRT sites) for stepwise genomic engineering in preclinical strain development.
- Scientific Value: Integrates inducible promoters (e.g., T7/lacUV5) to control gene expression and study condition-dependent phenotypes relevant to host environments.
Pipeline & Workflow Integration
The TransFLP method fits within early discovery to preclinical workflows by providing a rapid, reusable platform for generating genetically defined V. cholerae strains for target validation, assay development, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via precise gene deletions and insertions to clarify gene function and pathway involvement in virulence.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, marker-free mutant libraries with PCR-confirmed genotypes.
- Analytics: Delivers quantitative genotypic readouts (PCR fragment sizing, sequencing) for objective comparison of modified versus wild-type strains.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating attenuated strains (e.g., ΔVPI-1) for virulence assessment in infection models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, chitin-based transformation platform applicable across Vibrio species and genetic targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through rapid, precise genetic manipulation reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined PCR fragment inputs, chitin flakes, and temperature-shift FLP induction.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by accelerating strain generation and reducing late-stage biological risk in antimicrobial programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through faster generation of isogenic mutants for target de-risking and lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, PCR design, and bacterial culture techniques.
- Dependent on access to chitin flakes, thermocyclers, and selective plating infrastructure.
- Necessitates standardization of FRT-flanked cassette design and FLP induction protocols across teams.
- Adaptation considerations include optimizing homology arm length (250–500 bp) and chitin incubation times for different Vibrio strains.
- Practical limitation: Efficiency depends on natural competence induction, which may vary with growth medium and physiological state.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Preparation of Chitin Flakes
1:39
Oligonucleotide Design and Polymerase Chain Reaction
3:45
Chitin-induced Natural Transformation
4:59
Removal of Selective Cassette(s) by FLP-recombination
5:46
Plasmid Curing
11:34
Conclusion
6:21
Results: Representative TransFLP Modifications of V. cholerae
