Name: TransFLP - A基因修改方法霍乱弧菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 了解基于自然转化和FLP重组的快速基因编辑方法，用于霍乱弧菌的基因删除与序列整合。该技术通过几丁质诱导和温度调控实现高效基因组修饰，为病原菌功能研究提供可靠工具。

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谨此感谢 Olga de Souza Silva 提供的技术支持。本工作由瑞士国家科学基金会（SNSF）资助，项目编号 31003A_127029。

TransFLP 方法（图1）通过三种不同的方式加以示例：I）删除两个相邻的编码 V. cholerae 毒力决定因子的基因（例如，ΔctxAB）；II）移除一个致病岛（例如，ΔVPI-1）；以及 III）在目的基因上游整合一个依赖 T7 RNA 聚合酶的启动子序列，从而使其可在相应的菌株背景下实现人工表达（例如，T7-tfoX）（图2）。
1. 准备几丁质薄片
<ol>
	<li>在标准的 1.5 ml 塑料离心管中称取 50–80 mg 的几丁质碎片。可批量制备。几丁质碎片可从 Sigma 公司购得（货号 C9213）。</li>
	<li>将管盖保持打开状态，对几丁质碎片进行高压灭菌。</li>
	<li>高压灭菌完成后，待灭菌器冷却后立即盖上管盖。</li>
	<li>将高压灭菌后的几丁质碎片于室温下保存。</li>
</ol>
2. 可选：用编码 Flp 重组酶的质粒对V. cholerae进行人工转化
<ol>
	<li>使用标准方法制备电转化感受态 V. cholerae 细胞11。将感受态细胞分装后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>取 1–2 μl 常规质粒小提产物 pBR-flp5 加入电转化感受态 V. cholerae 细胞中，混匀后转移至电穿孔杯（0.2 cm 间隙宽度）中。</li>
	<li>施加 1.6 kV 的电脉冲。</li>
	<li>加入 0.9 ml SOC 培养基，轻柔地将细胞转移至标准的 14 ml 离心管中，在 30 °C 静置培养 2.5 至 3 小时。</li>
	<li>分别涂布 100 μl 和 300 μl 菌液于含有 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上，30 °C 过夜培养。</li>
	<li>挑取单克隆进行纯化，并制备甘油保存菌种，用于后续 TransFLP 实验。</li>
</ol>
3. 寡核苷酸设计与聚合酶链式反应
<ol>
	<li>至少需要六条寡核苷酸引物，通过PCR扩增目标DNA区域以及FRT侧翼的抗生素抗性盒图3建议同时使用一对位于插入的PCR片段外侧的寡核苷酸引物，以检测插入情况以及FRT侧翼抗生素抗性盒的正确切除。例如 在图中表示为“chk-up”和“chk-down”引物 图3至图5).</li>
	<li>仔细设计寡核苷酸 #2、#3、#4 和 #5，确保它们能够充分退火（例如 约28 bp）与模板DNA结合。模板DNA对于引物#2和#5为基因组DNA（gDNA），而对于含有FRT-Kan-FRT的质粒DNA（如pROD17）则为质粒DNA。12 以及本研究中的 pBR-FRT-KAN-FRT（引物 #3 和 #4）图3A).</li>
	<li>设计引物#2至#5，使其5'端在#2与#3之间以及#4与#5之间具有广泛的碱基配对图3A 插图）。随后进行两轮PCR。</li>
	<li>进行三次独立的 PCR 反应作为一组st PCR扩增的第一轮将利用引物#1和#2扩增目的基因/目的DNA区域的上游区。该PCR应产生至少500 bp长度的片段，以确保细胞内发生同源重组。较短的片段（约250 bp）也可能足够8 但不推荐使用。</li>
	<li>同时进行第二轮PCR，扩增带有FRT侧翼的抗生素抗性盒。在本文提供的示例中，我们主要使用了 aph (kanR）。此反应使用引物 #3 和 #4（图3A).</li>
	<li>同时，通过PCR扩增下游DNA区域（第三个样本）。PCR片段长度也应至少为500 bp。以基因组DNA为模板，使用引物#5和#6进行PCR扩增。图3A).</li>
	<li>在完成所有三个PCR片段的纯化后，进行第二次nd PCR扩增轮次。以第一轮PCR获得的全部三种片段等量混合物作为模板，由引物#1和#6催化扩增反应。所得PCR片段（图3B）在自然转化实验中用作转化DNA图1).</li>
</ol>
4. 几丁质诱导的自然转化
<ol>
	<li>培养 V. cholerae 在30 °C的丰富培养基中好氧培养细胞，直至其在600 nm处的光密度达到约0.5。</li>
	<li>通过离心收集细菌。用限定的人工培养基（DASW）将沉淀洗涤一次。6) 然后在 2 倍体积的 DASW 中重悬细胞。将 1 ml 培养物加入 50–80 mg 无菌甲壳素碎片中（见第 1 点说明）。如果细菌含有质粒 pBR-flp（可选第 2 点），在培养物中加入氨苄青霉素（50 μg/ml）。于 30 °C 静置培养 16–24 小时。</li>
	<li>加入 ≥ 200 ng 的 2nd- 将PCR扩增得到的片段加入（详见第3点说明）。轻轻混匀，避免将细菌从几丁质表面过度剥离。在30 °C下静置孵育24小时。</li>
	<li>充分涡旋振荡培养物至少30秒。取100–300 μl涂布于选择性LB培养基平板上（例如 含有卡那霉素或庆大霉素的LB平板（如本示例所示）。若细菌含有质粒pBR-flp，则通过同时添加氨苄青霉素与其他抗生素制备双选择性平板。于30 °C培养16–24小时，或培养至菌落可见。</li>
	<li>从选择性平板上分离单个转化子。此类转化子由于发生双交换事件，已将原始染色体位点替换为PCR片段。若无需去除抗生素抗性盒，这些菌株可直接用于后续实验。</li>
</ol>
5. 通过 Flp 重组去除选择性盒
<ol>
	<li>如果在进行自然转化实验前尚未完成，可按照第2点所述方法，使用质粒pBR-flp对转化子进行人工转化。</li>
	<li>将细菌接种于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37 °C条件下培养16–24小时。可选操作：在培养过程中将温度提高至40 °C，持续2–3小时，因为质粒pBR-flp上的flp基因在较高温度下表达会解除抑制5,10；或在培养约8小时后，将细菌转移至新的平板上。</li>
	<li>通过将克隆平行划线接种于含抗生素和不含抗生素的琼脂平板上，检测其对抗生素的敏感性（本实验以卡那霉素为例；图1）。挑选出单个敏感菌落。若计划后续使用TransFLP技术对菌株进行其他缺失或插入修饰，可将氨苄青霉素抗性的克隆保存为甘油菌种冻存。</li>
</ol>
6. 质粒消除
<ol>
	<li>在有氧条件下于 30 °C 过夜培养。使用不含任何抗生素的丰富培养基。</li>
	<li>可选：将过夜培养物按 1:100 比例接种至新鲜的无抗生素培养基中，于 3–6 小时内进行新鲜培养。</li>
	<li>将培养物进行稀释后涂布或划线接种于普通 LB 琼脂平板上，于 30 °C 培养 8–16 小时（直至可见菌落）。</li>
	<li>通过将克隆平行划线接种于含抗生素和不含抗生素的琼脂平板上，检测克隆对氨苄青霉素的敏感性（图 1）。将对氨苄青霉素敏感的菌株制备成甘油冻存液并保存。</li>
</ol>

<ol><li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations%3A+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li>
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</ol>

未声明利益冲突。

上述及其他文献5中描述的TransFLP方法已在我们的实验室中得到广泛应用。可行的遗传操作包括但不限于：单个基因和基因簇的删除、基因组岛的删除（例如，VPI-1）、在目标基因上游插入序列（例如，启动子序列）以及在特定基因末端插入序列（例如，编码亲和标签的序列）。
TransFLP 的一个导入先决条件是相应的 V. cholerae 菌株具有天然感受态，但情况并非总是如此，尤其是在霍乱患者来源的分离株中。这类菌株的群体感应系统中常发生突变 例如，位于编码群体感应主要调控因子 HapR 的基因内17提供一份副本 hapR 在这些菌株中恢复自然转化能力6 如HapR缺陷型菌株N16961所示18.
可以引入一些可能的改进措施，例如在自然转化后对细菌进行富集，以防转化频率过低8。请注意，在进行甲壳素诱导的自然转化实验时，...

<table><tbody><tr><td>几丁质碎片</td><td>Sigma</td><td>C9213</td><td>需高压灭菌</td></tr><tr><td>可选：微脉冲仪（若需通过 pBR-flp 质粒编码的 Flp 重组酶切除抗生素盒）</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>或性能相当的电穿孔仪</td></tr></tbody></table>

transflp — 一种基于自然转化和flp重组的对vibrio cholerae进行遗传修饰的方法

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

目前已有多种方法可用于操纵细菌染色体1-3。这些方案大多依赖于条件型复制质粒的插入（例如含有依赖pir基因或温度敏感型复制子的质粒1,2）。这类质粒通过同源重组介导整合至细菌染色体中。此类插入突变体通常可直接用于实验研究。或者，也可通过筛选质粒的切除并使其丢失来实现基因改造，该策略在革兰氏阴性菌中常利用由sacB基因编码的反向选择性酶——果聚糖蔗糖酶来实现4。质粒切除后可能恢复插入前的原始基因型，也可能导致染色体与质粒上携带的修饰基因拷贝之间发生置换。该技术的一个缺点是耗时较长：首先需要克隆质粒；随后需通过接合（最常见的是与E. coli供体菌株交配）或人工转化的方式将其水平转移至V. cholerae中；此外，在无正向选择压力的情况下，质粒的切除是随机事件，可能恢复原始基因型，也可能产生目标修饰。本文介绍一种快速操纵V. cholerae染色体5的方法（图1）。该TransFLP方法基于近期发现的几丁质介导的该生物体自然感受态诱导机制6，以及弧菌属（Vibrio）其他代表性物种如V. fischeri7中的类似现象。自然感受态使得细胞能够摄取游离DNA，包括PCR扩增产生的DNA片段。一旦被摄入，只要存在至少250–500 bp的侧翼同源区域，DNA即可与染色体发生重组8。在两侧同源区域之间引入筛选标记，可便于频繁出现的转化子的筛选与鉴定。
该方法可用于对V. cholerae进行多种遗传操作，并可能同样适用于其他天然感受态细菌。除我们先前发表的单基因缺失和添加亲和标签序列的研究5外，本文还提供了三个利用该方法实现的新示例。本TransFLP方案整合了对几丁质诱导自然转化初始方案6的多项优化步骤，其中包括以商业化几丁质薄片替代蟹壳碎片8、使用PCR扩增产物作为转化DNA供体9，以及引入FLP重组靶点（FRT）序列5。FRT位点可介导Flp重组酶实现筛选标记的定点切除10。

三个示例的代表性结果如图4至图6所示。第一种方法旨在删除邻近基因ctxA和ctxB，这两个基因共同编码霍乱弧菌（V. cholerae）的主要毒力因子——霍乱毒素。我们根据上述说明及图3所示设计了用于TransFLP方法的寡核苷酸。对亲本菌株、在ctxAB原始DNA位点处携带FRT侧翼抗生素抗性盒的中间菌株，以及最终删除了ctxAB并清除抗性盒的菌株，均进行了基因型检测（图4）。所采用的方法为全细胞PCR。我们使用的引物不与转化用PCR片段退火，而仅与染色体DNA结合（图3），从而可验证PCR片段与染色体同源区域之间的位点特异性交换（图4A）。通过标准琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物以确定其大小（图4B）。该策略可用于检测菌株中间体，并确认最终菌株构建体。
在第二个示例中，针对整个基因组岛的删除，...

本文介绍了一种快速修饰V. cholerae基因组的方法。这些修饰包括单个基因、基因簇和基因组岛的删除，以及短序列（如启动子元件或亲和标签序列）的插入。该方法基于自然转化和FLP重组技术。

TransFLP — 一种基于自然转化和FLP重组的对Vibrio cholerae进行遗传修饰的方法

可采用多种方法对细菌染色体进行操作1-3。大多数此类方案依赖于条件型复制质粒的插入……

本实验的目的是利用这种基于自然转化和Flip重组的快速且高效的方法，对紫色色杆菌进行遗传操作。首先，需要准备合适的几丁质来源，因为几丁质是自然转化的天然诱导物。在第二步中，通过两轮PCR扩增构建目标DNA片段，随后进行自然转化，使含有PBR-Flip质粒的细菌摄取PCR扩增片段，并将其整合到自身的基因组中。接下来，通过升温诱导质粒编码的脂肪酶，以切除两侧由翻转重组靶点（FRT位点）包围的抗生素抗性盒。最后一步中，将细菌中的FLP编码质粒消除。最终通过PCR和测序验证基因操作成功。与现有方法（例如使用自杀质粒对弧菌进行遗传操作）相比，该技术的主要优势在于其速度极快且效率很高。首先，在标准的1.5毫升塑料离心管中称取50至80毫克的甲壳素碎片，保持管盖打开状态进行高压灭菌；高压灭菌程序结束后立即关闭管盖，并将经高压处理的甲壳素碎片在室温下保存。至少需要六条寡核苷酸引物，用于通过PCR扩增目标DNA区域以及FRT侧翼的抗生素抗性盒。此外，建议包含一对位于插入PCR片段外侧的寡核苷酸引物。这可以用于检测FRT侧翼的抗生素抗性盒（编号为二、三、四和五）的正确整合与切除。引物二和五应至少包含28个碱基对，以确保充分结合基因组DNA和引物。引物三和四应以含有FRT序列的质粒为模板进行设计；设计引物二和五时，需使其在5′端与引物三以及引物四和五之间分别具有广泛的互补碱基配对能力。现在进行第一轮 PCR，使用引物一和引物二，对定制设计的构建体中目标实验区域上游区段进行扩增，该扩增为三个同时进行但相互独立的 PCR 反应中的第一个。与此同时，使用引物三和引物四进行第二个 PCR 反应，以扩增两侧带有 FRT 位点的抗生素抗性盒。例如，在本实验中，使用了编码抗卡那霉素抗性的 APH 基因。同时扩增下游DNA区域，方法是使用引物五和引物六以及基因组DNA作为模板，制备第三个PCR反应。随后，在纯化全部三个PCR片段后，对所有三个样品开始PCR反应；以第一轮获得的三个片段等量混合物作为模板，进行第二轮PCR扩增。该扩增反应由引物一和引物六催化。所得PCR片段将作为自然转化实验中的转化DNA。在30摄氏度下有氧富集培养霍乱弧菌细胞后，于室温下通过离心收集细菌。接下来，将细菌培养物以碎片形式转移至风筝状载体上，并在30摄氏度下孵育细胞悬液过夜。随后，仔细地将至少200纳克第二轮PCR扩增得到的片段混入细菌细胞悬液中。注意不要过度剥离细菌与几丁质表面的结合，然后将此溶液在30摄氏度下静置孵育一天。现在将含有 PBR flip 质粒的菌液剧烈涡旋振荡至少 30 秒，取 100 至 300 微升细胞溶液涂布于含有氨苄青霉素及其他相应抗生素的双选择性平板上。将细菌培养物在 30 °C 条件下培养，直至菌落可见。随后从选择性平板上分离单克隆转化子。将细菌在含有氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上于 37 摄氏度培养 16 至 24 小时，开始此步骤。作为可选步骤，可在更高温度下解除 PBR flip 质粒中 flip 基因的抑制表达，因此可将温度升高至 40 摄氏度持续 2 至 3 小时。在 37 摄氏度继续培养 8 小时后，将细菌转移至新的新鲜平板上。随后将克隆平行接种于含抗生素和无抗生素的琼脂平板上，以检测其对抗生素的敏感性，并分离出单个对抗生素敏感的菌落。此步骤首先在30摄氏度、有氧条件下，于不含抗生素的富集培养基中过夜培养菌液。次日清晨，将过夜培养物以1:100的比例接种至新鲜的无抗生素培养基中，振荡培养3至6小时。下午时，将培养物进行划线或梯度稀释后涂布于普通的LB琼脂平板上，随后将平板在30摄氏度继续孵育8至16小时，直至菌落可见。在本实验中，旨在删除邻近基因 CTXA 和 CTXB。用于转位翻转法的寡核苷酸已如前所述生成。对亲本菌株、中间菌株（其基因组中 C-T-X-A-B 的原始 DNA 位点被 FRT 侧翼的抗生素抗性盒所取代）以及最终菌株（C-T-X-A-B 被完全删除且抗性盒已被移除）均进行了基因型检测。本实验通过全基因组 PCR 进行，所用引物不与转化用的 PCR 片段结合，而仅与染色体 DNA 结合。PCR 产物通过标准琼脂糖凝胶电泳分离，以确定其大小。在泳道一中，世界B型霍乱菌株位于预期的3,143个碱基对片段大小处。在泳道二中，来自菌株delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT的PCR片段位于3,162个碱基对处。在第三泳道中，与1 kb DNA标准相比，delta ctx A B FFR TP CR片段位于1,769个碱基对处。在第二个实验示例中，目标为完整删除一个基因组岛，选择霍乱弧菌致病岛1（Vibrio Pathogenicity island one，VPI-1）作为本实验的靶点。该实验对trans flip方法进行了两个步骤的修改。首先，在致病岛PI一的起始位置通过一个FRT位点介导，将卡那霉素抗性基因整合进去。然后进行第二轮自然转化，使另一个抗生素抗性标记——即庆大霉素抗性基因——插入到致病岛末端，并在其后引入第二个FRT位游戏副本。每张凝胶图上方均标示了相应的引物对，随后的trans FLP方法操作如上文所示继续进行。亲本菌株、中间菌株和最终菌株均通过第一泳道中纯化基因组DNA的PCR进行验证。野生型霍乱弧菌V cholerae菌株的PCR片段在第二泳道中电泳。VPI-1-FRT::GM-FRT菌株产生的PCR片段进行了电泳。第 3 泳道分析了菌株 delta VPI one FRT 衍生的 PCR 产物。每张凝胶图像上方标示了引物对。最终菌株缺失了完整的 VPI one 区域。在第三个示例中，采用略有修改的标准方案，通过 trans flip 方法将 T7 RNA 聚合酶依赖性启动子序列整合至基因 *tetR*（自然转化的主要调控因子）的上游。T7 RNA 依赖性启动子的共识序列作为突出端被包含在编号为四和编号为五的寡核苷酸中，从而使该 DNA 序列保留在染色体内部。即使在抗生素抗性盒被切除后，该构建体仍被整合到含有 T7 RNA 聚合酶的 V. cholerae 菌株中。在该菌株中，T7 RNA 聚合酶基因的表达由 LAC UV5 启动子驱动，以检测 T7 RNA 聚合酶依赖性的 T Fox 基因表达。自然转化实验在 LB 培养基中进行。亲本菌株在目标基因 T Fox 前缺乏 T7 依赖型启动子，因此在此条件下不具备自然转化能力，这是由于在富营养培养基中且无其天然诱导物几丁质存在时，T Fox 无法转录。该表型与是否通过 IPTG 人工诱导 T7 RNA 聚合酶的表达无关。然而，该反式翻转产生的菌株含有位于感受态基因 tfoX 上游的 T7 RNA 聚合酶依赖型启动子，在 LB 培养基中由于 lacUV5 启动子的渗漏表达，确实能够在富集培养基中自然转化。所产生的 T7 RNA 聚合酶已在未加入 IPTG 诱导的情况下，从 T7 RNA 聚合酶依赖型启动子起始转录 tfoX，从而启动了自然感受态与转化过程，证实了整合的 T7 RNA 聚合酶依赖型启动子序列具有功能活性。由于添加了LAC UV5启动子的诱导剂IPTG，T7 RNA聚合酶的完全诱导显著增强了该表型。观看本视频后，您应能很好地掌握如何利用几丁质诱导的自然转化与Flp重组相结合的方法，对霍乱弧菌进行遗传操作。一旦掌握该技术，可在短短几天内实现基因或基因组岛的删除，以及DNA序列的位点特异性整合。

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