通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

本实验的目的是通过延时共聚焦显微镜技术，展示在活体果蝇胚胎中蛋白质动态变化及定位模式的可视化。首先从维持培养的果蝇品系中收集胚胎，完成此目标。接着将胚胎转移至载玻片上，然后人工去除胚胎的卵壳，获得去壳胚胎。

随后以有序的方式将样本固定到预先准备好的载玻片上，并根据实验需要，可显微注射适当的纺锤体检查点诱导试剂。该实验流程的最后一步是利用共聚焦显微镜对胚胎进行活细胞延时成像。最终，通过延时成像和共聚焦显微镜技术，展示纺锤体检查点蛋白的定位、染色体行为的共定位，以及检查点诱导剂在与检查点相关的转基因斑马鱼品系中的作用效果。

该方法有助于回答有丝分裂退出（ME）调控领域中的关键问题，例如利用基因工程果蝇品系，研究纺锤体检查点蛋白的突变或缺失对其他检查点组分共定位的影响，以及这种影响对纺锤体组装检查点高效功能的后果。转基因果蝇饲养在含有果蝇培养基的塑料小瓶中，置于25摄氏度环境下，并在培养基表面添加适量干酵母粉。根据生长状况，小瓶通常每两到三周更换一次。

制备果蝇食物时，使用蠕动泵持续搅拌，加热适量果蝇食物混合物以溶解其成分，将八至十毫升该培养基作为糊状物分装至每个塑料小瓶中。待食物糊状物凝固并降至室温后，用棉质泡沫塞封住每个小瓶。将这些食物小瓶放入托盘中，用塑料袋密封，并在四摄氏度下保存，用于小规模的卵收集。

将约50对羽化后两到三天的成年果蝇转移至装有新鲜果蝇培养基的试管中，培养基表面需添加额外的干酵母粉以供产卵。在25摄氏度条件下培养，此处指由空调系统维持的恒定室温。每隔一小时，将果蝇转移至新的试管中，让胚胎在原管中继续孵育30分钟。

为确保收集的部分胚胎处于第8至第10次核分裂周期左右，通常会弃去第一个小时收集的胚胎，因为这些胚胎可能为滞留在雌性体内的老化胚胎，其滞留是由于产卵条件不适宜所致。因此，本实验仅使用从第二小时及之后转移的胚胎。

本实验步骤使用显微镜载玻片和50乘22毫米的盖玻片。首先取一片盖玻片，用湿润的细毛笔蘸取极少量水，将盖玻片一侧的四个角轻轻润湿。然后将盖玻片放置在显微镜载玻片上。

由薄液膜引起的毛细表面张力应能防止盖玻片移动。在盖玻片中部涂抹一条细窄的庚烷胶水。庚烷应在数秒内挥发，仅在盖玻片上留下胶水。

接下来，使用金刚石笔将另一块盖玻片切割成约 1.5 毫米见方的小方块。取其中一个方块，放置在胶条的一端。该方块将在需要显微注射时用于打开针尖。

取另一张载玻片，贴上一段长约2厘米的双面胶带，撕去覆盖纸，开始进行胚胎包被操作。用湿润的细毛笔将果蝇转移至新鲜的培养管中。将约50个卵转移至已准备好的载玻片上的双面胶带上。

使用适量的液体使卵分散开。当液体蒸发后，在解剖显微镜下卵会粘附在胶带上。用一对镊子其中一瓣的外侧，沿卵的长轴方向轻轻触碰数次，直至卵壳破裂并打开。

将胚胎留在Corian壳中以防止快速脱水。继续此操作，直至处理10到20枚卵。随后，逐个拾取胚胎，将其从Corian壳中取出，并轻轻将胚胎放置于垂直条带上。

在胶带上。将胚胎的长边与胶带的长边呈反平行方向对齐。将胚胎置于干燥室中三到八分钟。

最后，用适量的伏特左特宁油覆盖胚胎，以防止显微注射前过度脱水。显微注射是该操作中最困难的环节之一。为了使显微注射尽可能简便高效，应遵循特定的切片制备方案。

必须小心地准备胚胎，使其处于显微注射的最佳状态。显微注射胚胎所用的针头需预先制备。使用细小的上样尖端，用一到两微升含有适当浓度试剂的注射缓冲液从针头后方填充。

将针头安装在Leica TCSP倒置共聚焦显微镜的持针器上，并将压力管连接至注射控制系统。在40倍物镜下找到胚胎，随后在不改变焦平面的情况下找到针头的阴影。

通过将针头移至视野中央，并逐渐将其降低至正确的焦平面来完成此操作。非常轻柔地移动显微镜载物台，找到粘合带一端预先安装的小方块盖玻片。轻柔移动针尖，直至其接触到小方块盖玻片的边缘，并轻轻将其戳破。

移动载物台，使胚胎重新进入视野，并选择一个适合注射的合适发育阶段的胚胎。小心地将胚胎移至靠近针尖的位置，并重新调节胚胎和针尖的焦平面。将胚胎移入针尖内。

将一滴试剂注入胚胎侧边，然后移开胚胎。使用配备40倍油浸物镜的Leica TCSS SP2倒置共聚焦显微系统，采集活体胚胎的时间序列或单张图像。当对光谱重叠且在同一胚胎中共表达的多种荧光蛋白进行成像时，需依次采集每种荧光蛋白的发射波长。

这些图像在设置延时成像的时间框架后才显现出来。必须考虑这些因素。通常通过两条扫描线的平均值获得单张图像。

在平均进行两次帧扫描的情况下，以同步扫描模式获取一幅 12×12 像素的五乘五图像至少需要 6.3 秒，而以顺序扫描模式则需要 15.44 秒，以获得良好的信噪比。针孔通常设置为 1 至 2 au（airy 单位），激光功率则调整至尽可能低的水平，以避免明显的光漂白现象。这段代表性延时录像展示了活体卵母细胞胚胎中 CDC 20 的动态动力学核心招募过程以及染色体的运动情况。

对一个共表达绿色荧光蛋白标记的 CDC20（GFP-CDC20，绿色）和红色荧光蛋白标记的组蛋白 H2B（RFP-Histone2B，红色）的转基因早期胚胎进行了延时成像。在核分裂周期中，每 10 秒采集 7 至 8 帧图像，并将细胞已进入前期的帧定义为零时间点。该图展示了延时录像中的各帧图像：GFP-CDC20 可清晰地出现在前期和前中期的动粒上，如第三和第四幅图像中的白色箭头所示，并持续存在于中期和后期的动粒上，如第五和第六幅图像所示。

在第一张图像中，G-F-P-C-D-C 20 被排除在白色箭头所示的界面核之外，并在早前期进入细胞核，如第二张图像所示。在第八至第十四张图像中，使用共表达的 RFP 组蛋白 H2B 作为标记物来确定染色质形态，并显示了合并图像。这些图像显示在底行。

利用本实验方案，可通过显微注射抗体、荧光标记蛋白或可能激活纺锤体组装检查点（SAC）的化学化合物来操控胚胎，从而研究纺锤体组装检查点（SAC）的功能。在本示例中，胚胎经秋水仙素处理以解聚微管，从而激活SAC，并表达GFP-CDC20或GFP-MAD2。两个核心动力学信号被用作细胞周期进程的标志物。

在上方图中，ARES 标示了第二至第六幅图像中的停滞期 esci。第一幅图像中箭头标记的区域表示秋水仙素处理前，G-F-P-C-D-C 20 被排除在晚期内界面核之外。中间图中的图像显示，在内源性 MAD 2 缺失的情况下，第七至第十二幅图像中箭头所示的 G-F-P-C-D-C 20 继续在细胞核内外以及动粒上下来回振荡。

尽管胞质分裂似乎存在缺陷，但这表明在秋水仙素处理下，细胞的纺锤体组装检查点（SAC）功能失常，无法将细胞阻滞在分裂期。在图像10中可观察到子代细胞核未能正常分离的示例。最后，在底部面板的图像14至18中，箭头指示静止的动粒核心结构，其中累积了GFP-MA2融合蛋白，这表明功能性的GFP-MA2能够挽救MA2突变胚胎中sac缺陷的表型。

图13中的箭头指示GFP MAD2在晚期间期细胞核中的积累。观看这些视频后，您应能充分掌握如何从维持的柄状结构中收获MAD2软件胚胎，在制备载玻片进行活体实时共聚焦显微成像前，手动去协调胚胎的操作方法。