Name: 龙虎斗动粒蛋白的动态行为与染色体运动，在生活学习有丝分裂关卡果蝇合胞胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 学习利用时间分辨共聚焦显微镜观察活体果蝇胚胎中动粒蛋白的动态行为与染色体运动，研究纺锤体检验点蛋白的招募与周转机制，为细胞分裂调控提供重要见解。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本方案是在惠康信托基金（Wellcome Trust）资助下开发的。我们感谢 Maureen Sinclair 女士多年来对果蝇品系的维护以及果蝇饲料的制备。我们还要感谢 Michael Aitchison 先生在本方案开发过程中提供的帮助和技术支持。

1. 转基因果蝇及其保种
<ol>
 <li>本演示中使用的转基因果蝇： Ubq-gfp-Cdc20 (II) Ubq-rfp-His2B (X*) Ubq-gfp-Cdc20 (II*) Ubq-gfp-Cdc20 (II*) mad2EY(III*) 和 Ubq-gfp-Cdc20 转基因果蝇此前已在实验室中通过标准的P元件介导转基因方法获得10,11 和 Ubq-rfp-His2B 由法国巴黎居里研究所（Institute Curie）CNRS/UMR 144 的 Yohanns Belaïche 惠赠。通过标准方法将其导入 Mad2 突变背景中 果蝇 遗传学。该 mad2EY 原始突变品系购自Bloomington保种中心。本实验方案中不讨论用于培养转化子的步骤。 
 注：* 代表染色体数目。</li>
 <li>维护： 转基因果蝇在 25 °C 置于含有果蝇食物的塑料小瓶中，并在顶部添加干燥酵母粉。根据培养条件，小瓶通常每3-4周常规更换一次。图1).</li>
</ol>
2. 果蝇食物制备（实验室规模）
<ol>
 <li>将适量的果蝇培养基混合物加热并持续搅拌，以溶解其中的成分。</li>
 <li>使用Jencons Scientific Ltd生产的蠕动泵，将约8-10 ml该培养基以浆状物形式分装至每个塑料小瓶（直径2.5 cm，长8 cm）中。</li>
 <li>待培养基凝固并冷却至室温后，用棉质泡沫塞封口。将这些培养基小瓶置于托盘中，再用塑料袋密封，保存于4 °C环境中以备后续使用。</li>
</ol>
3. 小规模卵收集
<ol>
 <li>将约50对2-3日龄的成年果蝇转移至一个新鲜的果蝇培养管中，培养基表面添加干酵母粉，并在25 °C条件下让其产卵。</li>
 <li>随后每小时将果蝇转移至一个新的培养管中，使胚胎在管中保留30分钟，以确保所收集的部分胚胎处于核分裂周期8-10阶段，此时细胞核逐渐迁移至皮层并排列成单一单层。通常弃去第一小时收集的胚胎，因为其中常含有在产卵条件不适宜时滞留在雌蝇体内的较老胚胎。</li>
</ol>
4. 准备盖玻片和载玻片
<ol>
 <li>取一个 50 x 22 mm 的盖玻片，用湿润的细毛笔在其一侧的四个角上蘸取极少量的水，然后将其放置在显微镜载玻片上，使盖玻片因薄液膜产生的毛细表面张力而固定不动。</li>
 <li>在盖玻片中央横向涂上一条薄薄的庚烷胶水，庚烷应在数秒内挥发，仅在盖玻片上留下胶水。</li>
 <li>用金刚石笔将另一片盖玻片切割成小方块（约 1.5 mm2），取其中一块放置在胶水条的一端（用于微注射时开启针尖），其余保存以备后续使用。</li>
 <li>取另一张显微镜载玻片，在其上粘贴一段长约 2 cm 的双面胶带，并撕去覆盖纸。（见 图 2A &amp; B）。</li>
</ol>
5. 去除胚胎的卵膜
<ol>
 <li>将果蝇转移至新的培养管中，使用湿润的细毛笔将约50枚卵连同适量液体转移到载玻片的双面胶带上，使卵能够分散开。待液体蒸发后，卵将牢固地粘附在胶带上。</li>
 <li>在解剖显微镜下，用一对镊子的外侧边缘沿卵的长轴方向轻轻多次触碰，直至卵壳（chorion）破裂开口，但需将胚胎保留在卵壳内以防止快速脱水。重复此操作，直至处理了10–20枚卵（具体数量根据单次实验所需卵数而定）。</li>
 <li>随后可将胚胎逐个从卵壳中取出，并小心地转移至涂有胶的条带上。根据是否需要进行显微注射，可将胚胎的长轴与胶带的长边平行或反向平行排列放置。</li>
 <li>为防止进一步干燥，可立即用适量Voltalef 10S油（Holocarbon 700油与27油按5:1混合，Sigma）覆盖胚胎，用于即时成像；或根据实验目的和环境湿度，先将胚胎置于干燥室中干燥3–8分钟以进一步脱水。若需进行显微注射，应在适当时机用10S油覆盖已脱水的胚胎，以防过度脱水。（见图2C、D和E）。</li>
</ol>
6. 胚胎成像
<ol>
 <li>使用配备 HCX PL APO CS 40X 1.25 油浸物镜的 Leica TCS SP2 倒置共聚焦显微镜系统采集活体胚胎的时间序列或单张图像（也可根据实验目的使用 60 或 100 倍物镜，放大倍数越高，光漂白现象越明显）。</li>
 <li>当对光谱重叠且在同一胚胎中共表达的多种荧光蛋白进行成像时，需依次采集每种荧光蛋白的发射波长。Leica TCS SP2 系统可用的激发与发射波长如下：GFP，λEx：488 nm，λEm：500–600 nm；RFP，λEx：543 nm，λEm：555–700 nm。</li>
 <li>通常以 2 条扫描线的平均值和 2 帧扫描的平均值获取单张图像。在同步扫描模式下扫描一幅 512×512 像素的图像至少需要 6.3 秒，在顺序扫描模式下则需 15.44 秒，可获得良好的信噪比。设置时间序列图像采集的时间间隔时，需充分考虑上述扫描时间。</li>
 <li>针孔通常设置为 1–2 AU（艾里单位），激光功率应调节至尽可能低的水平，以避免明显的光漂白。</li>
</ol>
7. 通过显微注射适当试剂诱导胚胎的纺锤体组装检查点（SAC）
<ol>
 <li>在实验前准备好针头。我们倾向于使用火焰拉制仪（Sutter Instrument，型号：P-97）从硅化玻璃毛细管（GC-100-10，Harvard）中拉制针头，参数设置为：heat = 600，pull = 90，vel = 70，del = 150。</li>
 <li>使用细加样尖端（20 μl Eppendorf，批号：W215818J）将适量浓度的试剂注射缓冲液1-2 ml反向填充至针头中。</li>
 <li>将针头安装在显微镜的针头夹持器上，并将压力管连接至Eppendorf注射控制系统。</li>
 <li>在40X物镜下找到胚胎，并通过移动针头至视野中心并逐渐降低至正确焦平面，找到针头的投影，而不改变焦平面。</li>
 <li>轻柔地将胚胎移开，找到预先固定在胶条一端的盖玻片小方块。极其轻柔地移动针尖，直至其接触小方块盖玻片的边缘，并轻轻将其戳破。</li>
 <li>将胚胎移回视野，选择适合注射的合适发育时期的胚胎。我通常在核分裂周期5-7期进行注射，因为此时细胞核尚未迁移至皮层。注射前可通过快速扫描GFP-Cdc20或RFP-Histone 2B的荧光信号来确定核分裂周期阶段9。</li>
 <li>小心地将胚胎移近针头，并重新调整胚胎和针头的焦平面。将胚胎移入针头下方，在目标位置注入一滴试剂，然后将胚胎移开（或按照显微注射系统的操作说明进行）。根据实验目的，可从胚胎后端或侧面进行注射。</li>
 <li>注射完成后，胚胎即可在适当时间进行成像。（参见 图2F &amp; G）</li>
</ol>
8. 代表性结果
<img alt="酵母实验用品，包括玻璃盖玻片、载玻片、镊子、解剖刀、胶带、试管、烧瓶。" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 所需材料：a. 细毛笔，b. 小型方形碎玻璃容器，c. 22 × 50 mm 盖玻片，d. 显微镜载玻片，e. 双面胶带，f. 瓶盖带孔的试管中的干酵母粉，g. 用于果蝇饲养的酵母颗粒，h. 果蝇培养管，i. 用于去壳胚胎的半把镊子，j. 一对镊子，k. 正庚烷胶液容器（量瓶）。
<img alt="显示设置、去壳胚胎放置、油的使用和针头制备的胚胎显微注射示意图。" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 图示为第 4 步中盖玻片和载玻片的准备、第 5 步中胚胎去壳以及第 7 步中显微注射针头的制备。A. 上图显示一张盖玻片，其中间有一条横贯的庚烷胶带，一端粘附着一小块破碎的盖玻片碎片。下图显示一张载玻片，其四个角上各有一薄层水滴，用于固定盖玻片。使用载玻片来承载盖玻片的原因是保持与在载玻片上使用双面胶带时大致相同的焦距，从而在解剖及在胶带与盖玻片之间转移胚胎时，避免重新对显微镜调焦。B. 一张载玻片，其上预先贴有一小段双面透明胶带（Scotch tape），在剥离覆盖纸后用于胚胎去壳。C. 左侧图片显示具有完整卵壳的胚胎，其前端和后端已标记；右侧图片显示胚胎位于破碎的卵壳中，在被转移至带有胶条的盖玻片之前的状态。D &amp; E. 图示两种将去壳后的胚胎转移、放置并排列在胶条上的方法。胚胎在适当干燥后被10S油覆盖。F &amp; G. 图示如何打开注射针尖端并将其定位以进行注射。
上述实验获得的单张图像或延时图像可直接使用 Leica 软件进行分析，或以 .TIF 文件格式保存，该格式为开放格式，可用于后续通过其他常见图像分析软件（如 Image J、Photoshop 和 MetaMorph 等）进行定量分析或编辑处理。以下将讨论两个示例说明此过程：
示例 1： 一段延时录像（图 3）展示了活体 Drosophila 合胞体胚胎中 GFP-Cdc20 的动态着丝粒招募过程以及染色体运动。从原始延时序列图像中确定/编辑了感兴趣区域，并使用 Photoshop 软件进行自动批量转换。该录像使用 QuickTime 软件进行合成。
<img alt="Mitosis phases sequence, GFP-Cdc20 expression, DNA visualization; fluorescence microscopy images." src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 一部延时电影展示了活细胞中GFP-Cdc20在动粒上的动态招募过程及染色体运动 果蝇 合胞体胚胎。（A） 对一只共表达 GFP-Cdc20（绿色）和 RFP-Histone 2B（红色）融合蛋白的转基因合胞体胚胎进行延时成像，使用 Leica TCS SP2 共聚焦系统记录图像，于 18 °C 在第7-8次核分裂周期期间。每10秒采集一帧图像。以细胞已处于前期的帧作为零时间点10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">单击此处查看图3A的视频</a>. （B） GFP-Cdc20 可在前期和前中期的动粒上清晰观察到（B3 &amp; 4，白色箭头）并持续存在于中期和后期的着丝粒上（B5 &amp; 6，白色箭头）。GFP-Cdc20 在间期细胞核中被排除在外（白色箭头指示），在早前期进入细胞核。染色质形态通过共表达的 His2BmRFP 作为标记物确定（B8-14）。比例尺 = 5 mm。
示例 2： 可通过显微注射抗体、荧光标记蛋白或可能激活纺锤体组装检查点（SAC）的化学化合物来操控胚胎，从而研究SAC的功能。例如，注射秋水仙素以解聚微管，从而激活SAC，如图410所示。
<img alt="显示经秋水仙素处理的 mad2 酵母细胞中 GFP-Cdc20 和 GFP-Mad2 的免疫荧光检测结果。" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. Mad2 对秋水仙素诱导的纺锤体组装检查点（SAC）功能至关重要10。对 gfp-cdc20; mad2+/+、gfp-cdc20; mad2EY（mad2-/- 空白突变体）以及 gfp-mad2; mad2EY 胚胎通过显微注射方式进行秋水仙素处理。在注射前（01、07 和 13）或注射后（02–06，上图；08–12，中图；14–18，下图）采集延时共聚焦图像。GFP-Cdc20（上图和中图）或 GFP-Mad2（下图）在动粒上的信号被用作细胞周期进程的标志。上图中，箭头指示 02–06 中停滞的动粒。01 中箭头标记的区域表明，在秋水仙素处理前，GFP-Cdc20 被排除在晚间期细胞核之外。中图显示，在缺乏内源性 Mad2 的情况下，尽管细胞质分裂似乎存在缺陷（如在含秋水仙素条件下缺乏微管的胚胎中所预期的那样），GFP-Cdc20 信号仍持续进出细胞核，并在动粒上反复结合与解离（如 07–12 中箭头所示），提示 SAC 功能失效，无法在秋水仙素处理后使细胞周期停滞。图 10 显示子代细胞核未能正常分离。下图中，14–18 中的箭头指示动粒停滞，并伴有 GFP-Mad2 融合蛋白的积累，表明功能性的 GFP-Mad2 可挽救 Mad2 突变胚胎中的 SAC 缺陷表型。图 13 中的箭头指示 GFP-Mad2 在晚间期细胞核中的积累。比例尺 = 5 mm。胚胎显微注射了约相当于 1% 卵体积的 100 mg/ml 秋水仙素储存液（溶于 1×PBS 中）。

<ol><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li>
<li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy%2C+chromosomal+missegregation%2C+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp.+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li>
<li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+a+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li>
<li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC%2FC+inhibition+by+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li>
<li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li>
<li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation-specific+binding+of+p31%28comet%29+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li>
<li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC%2Fcyclosome+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li>
<li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein%2Fdynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li>
<li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li>
<li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li>
<li>Karess, R. E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaress%2C+RE+%22DNA+cloning%3A+A+practical+approach%22">DNA cloning: A practical approach</a>. Glover, D. 2, IRL Press. Oxford. 121-141 (1985).</li>
<li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li>
<li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC%2FC%3A+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li>
<li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+Fzy%2FCdc20+and+Fzr%2FCdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382(2009).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503(2011).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文所述方案是一种利用Leica TCS SP2共聚焦激光扫描显微镜对果蝇合胞体胚胎进行成像的通用方法，可根据需要修改以适用于其他显微镜系统，并可通过调整用于研究其他基因功能 果蝇 合胞体胚胎。我们已采用该方案，利用转基因果蝇或多种多克隆抗体，通过观察活体或固定样品中蛋白质的定位，研究纺锤体组装检查点、蛋白质动态变化及蛋白质降解的多个方面。4,6,12-14 .
在收集少量（约10–100枚）卵时，最简便的方法是将果蝇保留在新鲜的果蝇培养管中。这可以避免制备额外的苹果汁琼脂平板和卵收集装置，而这些装置在其他文献中有描述15,16。在盖玻片上的胶带一端添加一小块破碎的盖玻片玻璃，可显著方便打开针头，并在针头浸入10S油时通过调节显微注射系统设置来确定注射体积。胚胎脱水程度对于注射成功至关重要，可有效防止泄漏并维持胚胎活力，尤其是在需要较长时间操作的实验或注射后培育转基因个体时。然而，脱水所需的确切时间并无统一标准，其时长因实验而异，取决于注射溶液的量以及工作环境的湿度。
通过显微注射特定蛋白抑制剂、针对特定蛋白的单克隆或多克隆抗体、信使RNA或荧光标记的多肽，可以在野生型或基因突变背景下操控目标蛋白的特定功能。许多此类突变品系或GFP标记的转基因品系均可从果蝇（Drosophila）品系保藏中心公开获取，其中大部分品系信息可在Flybase（<a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/</a>）上查询并在线检索。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;必需的仪器和试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;共聚焦成像系统：&lt;/strong&gt; 本方案中描述的成像系统为 Leica TCS SP2 激光扫描共聚焦倒置显微镜系统。所述方法也可适用于其他成像系统，可能仅需进行少量调整。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;体视显微镜：&lt;/strong&gt; 我们使用配备 DF PLAPO 1X-4 物镜的 Olympus SZX7 体视显微镜。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;针头拉拔器：&lt;/strong&gt; Flaming/brown 微量移液器拉制仪（Sutter Instrument，型号：P-97）&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;显微注射系统：&lt;/strong&gt; 文中描述了使用Eppendorf显微注射系统，但也可使用其他合适的系统。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;果蝇饲料分配器：&lt;/strong&gt; Jencons Scientific Ltd 蠕动泵&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>玉米粉</td><td>SUMA，英国</td><td></td><td>100.0 g</td></tr><tr><td>红糖</td><td>Billington&amp;#8217;英国</td><td></td><td>50.0 g</td></tr><tr><td>干酵母</td><td>DCL YEAST有限公司，英国</td><td></td><td>25.0 g</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>106556</td><td>12.5克</td></tr><tr><td> 山梨酸</td><td>BDH，英国 VWR International Ltd.</td><td>8829310</td><td>0.4g</td></tr><tr><td>苯甲酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>1019599</td><td>2.9克</td></tr><tr><td>尼泊金（对羟基苯甲酸甲酯）</td><td>BDH，VWR International Ltd. 英国</td><td>K35969015</td><td>0.9克</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 至多1L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p 类=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表1.&lt;/strong&gt; 果蝇食物成分。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;购自 Sigma 的 Holocarbon 700 和 27 油。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;干酵母：&lt;/strong&gt; Thomas Allison，英国&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;制备庚烷胶：&lt;/strong&gt; 取约1.5米双面透明胶带，放入15 ml Falcon离心管中，加入5 ml正庚烷，旋转3–5小时或过夜。之后将溶液均分为4份，每份转移至1.5 ml Eppendorf离心管中，在台式离心机中高速离心5分钟，以去除任何杂质。将正庚烷胶液收集并储存于10 ml容量瓶中备用。胶液的粘性强度取决于其浓度及使用量。通常情况下，较稀的胶液在共聚焦显微镜扫描时产生的背景噪声更小。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;李&gt;&lt;em&gt;盖玻片&lt;/em&gt; BDH，VWR International Ltd. 英国&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;显微镜载玻片&lt;/em&gt; BDH，VWR International Ltd. 英国&lt;/li&gt; &lt;李&gt;&lt;em&gt;硅化玻璃毛细管：&lt;/em&gt; GC-100-10，Harvard&lt;/li&gt; &lt;李&gt;&lt;em&gt;精细加样技巧：&lt;/em&gt; 20&amp;mu;l eppendorf 货号：W215818J&lt;/li&gt; &lt;李&gt;镊子&lt;/li&gt; &lt;李&gt;细头画笔&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

纺锤体组装检查点（SAC）机制是一种活性信号，可监测染色体动粒与纺锤体微管之间的相互作用，以阻止后期的启动，直到染色体正确连接为止。细胞利用这一机制防止非整倍性或基因组不稳定，从而避免癌症以及出生缺陷、阿尔茨海默病等其他人类疾病1。目前已鉴定出多个SAC组分，如Mad1、Mad2、Bub1、BubR1、Bub3、Mps1、Zw10、Rod和Aurora B激酶，它们均为动粒动态蛋白2。证据表明，动粒是SAC信号的起始位点。SAC的主要调控靶点是Cdc20。Cdc20是APC/C（后期促进复合物或周期体）的关键激活因子之一3，同时也是一种动粒动态蛋白4-6。当SAC被激活时，会抑制APC/C的活性，阻止两种关键底物——细胞周期蛋白B（cyclin B）和securin——的降解，从而抑制中期向后期的转变7,8。然而，SAC信号究竟如何在动粒上启动并组装，并进一步传递至APC/C以抑制其功能，目前仍不清楚。
Drosophila 是一种极为易于操作的实验体系；与人类相比，它是一种更简单且被深入理解的生物，但却与人类共享许多基本的生命过程。它或许是用于活细胞生物成像研究的最佳模式生物之一，尤其适用于有丝分裂事件在时空中的可视化观察，因为其早期胚胎会同步经历13次快速的核分裂周期（在25 °C下每个周期持续8-10分钟），并逐渐将细胞核有序排列在皮层下方的单层结构中9。
本文介绍了一种利用表达GFP（绿色荧光蛋白）或其变体标记的目标蛋白的转基因果蝇（Drosophila），结合徕卡TCS SP2共聚焦激光扫描显微镜系统，研究果蝇中纺锤体组装检查点（SAC）功能的生物成像方法，并以SAC组分Cdc20和Mad2的GFP融合蛋白图像为例进行展示。

动粒是纺锤体组装检查点（SAC）启动信号、监控姐妹染色单体有丝分裂分离的位点。本文介绍了一种利用徕卡激光扫描共聚焦系统，在Drosophila胚胎中可视化动粒蛋白招募与周转过程，并将其与染色体运动进行协调分析的方法。

纺锤体组装检查点（SAC）机制是一种主动信号，可监控染色体动粒与纺锤体之间的相互作用……

本实验的目的是通过延时共聚焦显微镜技术，展示在活体果蝇胚胎中蛋白质动态变化及定位模式的可视化。首先从维持培养的果蝇品系中收集胚胎，完成此目标。接着将胚胎转移至载玻片上，然后人工去除胚胎的卵壳，获得去壳胚胎。随后以有序的方式将样本固定到预先准备好的载玻片上，并根据实验需要，可显微注射适当的纺锤体检查点诱导试剂。该实验流程的最后一步是利用共聚焦显微镜对胚胎进行活细胞延时成像。最终，通过延时成像和共聚焦显微镜技术，展示纺锤体检查点蛋白的定位、染色体行为的共定位，以及检查点诱导剂在与检查点相关的转基因斑马鱼品系中的作用效果。该方法有助于回答有丝分裂退出（ME）调控领域中的关键问题，例如利用基因工程果蝇品系，研究纺锤体检查点蛋白的突变或缺失对其他检查点组分共定位的影响，以及这种影响对纺锤体组装检查点高效功能的后果。转基因果蝇饲养在含有果蝇培养基的塑料小瓶中，置于25摄氏度环境下，并在培养基表面添加适量干酵母粉。根据生长状况，小瓶通常每两到三周更换一次。制备果蝇食物时，使用蠕动泵持续搅拌，加热适量果蝇食物混合物以溶解其成分，将八至十毫升该培养基作为糊状物分装至每个塑料小瓶中。待食物糊状物凝固并降至室温后，用棉质泡沫塞封住每个小瓶。将这些食物小瓶放入托盘中，用塑料袋密封，并在四摄氏度下保存，用于小规模的卵收集。将约50对羽化后两到三天的成年果蝇转移至装有新鲜果蝇培养基的试管中，培养基表面需添加额外的干酵母粉以供产卵。在25摄氏度条件下培养，此处指由空调系统维持的恒定室温。每隔一小时，将果蝇转移至新的试管中，让胚胎在原管中继续孵育30分钟。为确保收集的部分胚胎处于第8至第10次核分裂周期左右，通常会弃去第一个小时收集的胚胎，因为这些胚胎可能为滞留在雌性体内的老化胚胎，其滞留是由于产卵条件不适宜所致。因此，本实验仅使用从第二小时及之后转移的胚胎。本实验步骤使用显微镜载玻片和50乘22毫米的盖玻片。首先取一片盖玻片，用湿润的细毛笔蘸取极少量水，将盖玻片一侧的四个角轻轻润湿。然后将盖玻片放置在显微镜载玻片上。由薄液膜引起的毛细表面张力应能防止盖玻片移动。在盖玻片中部涂抹一条细窄的庚烷胶水。庚烷应在数秒内挥发，仅在盖玻片上留下胶水。接下来，使用金刚石笔将另一块盖玻片切割成约 1.5 毫米见方的小方块。取其中一个方块，放置在胶条的一端。该方块将在需要显微注射时用于打开针尖。取另一张载玻片，贴上一段长约2厘米的双面胶带，撕去覆盖纸，开始进行胚胎包被操作。用湿润的细毛笔将果蝇转移至新鲜的培养管中。将约50个卵转移至已准备好的载玻片上的双面胶带上。使用适量的液体使卵分散开。当液体蒸发后，在解剖显微镜下卵会粘附在胶带上。用一对镊子其中一瓣的外侧，沿卵的长轴方向轻轻触碰数次，直至卵壳破裂并打开。将胚胎留在Corian壳中以防止快速脱水。继续此操作，直至处理10到20枚卵。随后，逐个拾取胚胎，将其从Corian壳中取出，并轻轻将胚胎放置于垂直条带上。在胶带上。将胚胎的长边与胶带的长边呈反平行方向对齐。将胚胎置于干燥室中三到八分钟。最后，用适量的伏特左特宁油覆盖胚胎，以防止显微注射前过度脱水。显微注射是该操作中最困难的环节之一。为了使显微注射尽可能简便高效，应遵循特定的切片制备方案。必须小心地准备胚胎，使其处于显微注射的最佳状态。显微注射胚胎所用的针头需预先制备。使用细小的上样尖端，用一到两微升含有适当浓度试剂的注射缓冲液从针头后方填充。将针头安装在Leica TCSP倒置共聚焦显微镜的持针器上，并将压力管连接至注射控制系统。在40倍物镜下找到胚胎，随后在不改变焦平面的情况下找到针头的阴影。通过将针头移至视野中央，并逐渐将其降低至正确的焦平面来完成此操作。非常轻柔地移动显微镜载物台，找到粘合带一端预先安装的小方块盖玻片。轻柔移动针尖，直至其接触到小方块盖玻片的边缘，并轻轻将其戳破。 移动载物台，使胚胎重新进入视野，并选择一个适合注射的合适发育阶段的胚胎。小心地将胚胎移至靠近针尖的位置，并重新调节胚胎和针尖的焦平面。将胚胎移入针尖内。将一滴试剂注入胚胎侧边，然后移开胚胎。使用配备40倍油浸物镜的Leica TCSS SP2倒置共聚焦显微系统，采集活体胚胎的时间序列或单张图像。当对光谱重叠且在同一胚胎中共表达的多种荧光蛋白进行成像时，需依次采集每种荧光蛋白的发射波长。这些图像在设置延时成像的时间框架后才显现出来。必须考虑这些因素。通常通过两条扫描线的平均值获得单张图像。在平均进行两次帧扫描的情况下，以同步扫描模式获取一幅 12×12 像素的五乘五图像至少需要 6.3 秒，而以顺序扫描模式则需要 15.44 秒，以获得良好的信噪比。针孔通常设置为 1 至 2 au（airy 单位），激光功率则调整至尽可能低的水平，以避免明显的光漂白现象。这段代表性延时录像展示了活体卵母细胞胚胎中 CDC 20 的动态动力学核心招募过程以及染色体的运动情况。对一个共表达绿色荧光蛋白标记的 CDC20（GFP-CDC20，绿色）和红色荧光蛋白标记的组蛋白 H2B（RFP-Histone2B，红色）的转基因早期胚胎进行了延时成像。在核分裂周期中，每 10 秒采集 7 至 8 帧图像，并将细胞已进入前期的帧定义为零时间点。该图展示了延时录像中的各帧图像：GFP-CDC20 可清晰地出现在前期和前中期的动粒上，如第三和第四幅图像中的白色箭头所示，并持续存在于中期和后期的动粒上，如第五和第六幅图像所示。在第一张图像中，G-F-P-C-D-C 20 被排除在白色箭头所示的界面核之外，并在早前期进入细胞核，如第二张图像所示。在第八至第十四张图像中，使用共表达的 RFP 组蛋白 H2B 作为标记物来确定染色质形态，并显示了合并图像。这些图像显示在底行。利用本实验方案，可通过显微注射抗体、荧光标记蛋白或可能激活纺锤体组装检查点（SAC）的化学化合物来操控胚胎，从而研究纺锤体组装检查点（SAC）的功能。在本示例中，胚胎经秋水仙素处理以解聚微管，从而激活SAC，并表达GFP-CDC20或GFP-MAD2。两个核心动力学信号被用作细胞周期进程的标志物。在上方图中，ARES 标示了第二至第六幅图像中的停滞期 esci。第一幅图像中箭头标记的区域表示秋水仙素处理前，G-F-P-C-D-C 20 被排除在晚期内界面核之外。中间图中的图像显示，在内源性 MAD 2 缺失的情况下，第七至第十二幅图像中箭头所示的 G-F-P-C-D-C 20 继续在细胞核内外以及动粒上下来回振荡。尽管胞质分裂似乎存在缺陷，但这表明在秋水仙素处理下，细胞的纺锤体组装检查点（SAC）功能失常，无法将细胞阻滞在分裂期。在图像10中可观察到子代细胞核未能正常分离的示例。最后，在底部面板的图像14至18中，箭头指示静止的动粒核心结构，其中累积了GFP-MA2融合蛋白，这表明功能性的GFP-MA2能够挽救MA2突变胚胎中sac缺陷的表型。图13中的箭头指示GFP MAD2在晚期间期细胞核中的积累。观看这些视频后，您应能充分掌握如何从维持的柄状结构中收获MAD2软件胚胎，在制备载玻片进行活体实时共聚焦显微成像前，手动去协调胚胎的操作方法。

studying-mitotic-checkpoint-illustrating-dynamic-kinetochore-protein

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

龙虎斗动粒蛋白的动态行为与染色体运动，在生活学习有丝分裂关卡<em&gt;果蝇</em&gt;合胞胚胎

本方案描述了在黑腹果蝇（Drosophila...

研究有丝分裂的显微注射技术 黑腹果蝇 合胞体胚胎

本文描述了分离和制备用于相差显微镜和荧光显微镜成像的活体及固定Drosophila睾丸样品的方法。...

精子发生过程的细胞学分析：Drosophila 精巢的活体与固定制备

固定样品中减数分裂I期前中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞

我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。...

结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

本实验方案介绍了一种简便、便捷的方法，利用组蛋白2B-GFP BacMam...

活细胞成像观察有丝分裂过程中的染色体分离

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。...

利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态

本文介绍了一种评估纺锤体形成和有丝分裂进程动态变化的实验方案。通过应用延时成像技术，使用者能够识别处于有丝分裂不同阶段的细胞，追踪并鉴定有丝分裂缺陷，并分析在抗有丝分裂药物处理下纺锤体的动态行为及有丝分裂细胞的命运。...

活细胞成像评估有丝分裂纺锤体扰动后中期持续时间动态变化及细胞命运

本实验方案的目的是通过活细胞和固定细胞显微镜技术，对完整组织中的细胞分裂进行分析 黑腹果蝇 减数分裂的精母细胞。该方案展示了如何从完整的睾丸中分离出完整且未受损的睾丸组织 果蝇...

样品制备 果蝇 用于活体完整组织中细胞分裂分析的幼虫与蛹期睾丸

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

学习利用时间分辨共聚焦显微镜观察活体果蝇胚胎中动粒蛋白的动态行为与染色体运动，研究纺锤体检验点蛋白的招募与周转机制，为细胞分裂调控提供重要见解。

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点果蝇合胞体胚胎

探索更多视频

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

探索更多视频

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点果蝇合胞体胚胎