一种简化的技术方法 原位 人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

今天，我们将演示一种简化的方法，用于从人类尸体供体的眼球中获取角膜和视网膜组织。本方法有助于获取高质量的组织，用于移植、手术训练及科研用途，同时不损伤眼球的其他组织。凭借每年移植数千例角膜的18年专业经验，我们通过不断开发新技术并持续提升技能，始终保持了工作的高标准。

为实现这一目标，我们首先对角膜进行操作，随后进行视网膜剥离。角膜是一种无血管组织，能够将光线透射至视网膜，因此必须始终保持良好的透明度。角膜由五层结构组成，分别为上皮层、前弹力层（Bowman层）、基质层、后弹力层（Descemet膜）和内皮层。

如果角膜受损，可以通过合适的供体角膜进行替换。脉络膜是位于巩膜与视网膜之间的中层膜状结构，其内侧以布鲁赫膜（Bruch's membrane）为界，负责眼球内的血液供应。对脉络膜进行适当的去脏处理，与视网膜的清除同样重要。

视网膜有助于接收来自角膜和晶状体的光，并将其转化为化学能，最终传递至大脑。借助视神经，因其透明且脆弱，应系统地进行去眼球操作以获得高质量的组织。打开层流超净工作台。

使用70%异丙醇清洁超净工作台。穿戴个人防护装备，如手术帽、口罩、无菌手套和袖套。采用无菌技术，通过放置无菌巾和预消毒的器械托盘来建立无菌区域。

无菌打开无菌器械托盘背面，并翻转至无菌区域，避免任何污染。将所有无菌物品和器械放置在无菌区域内，并将装有眼球的眼科罐置于靠近无菌区域边缘的位置以便操作。为方便使用，对预先准备好的储存液瓶进行标记，并将碘伏多醇瓶盖置于硫代硫酸钠上，同时放置无菌磷酸盐缓冲盐溶液。

在无菌喂养环境外，将眼组织和溶液从4°C的冰箱中取出后，使其升至室温。避免反复升温或降温循环。使用无菌镊子从眼罐中取出纱布和海绵。

将眼球置于眼睑上并移除额外的绷带。小心地用视神经夹取眼球，并将眼球浸入无菌 IPVP 中。在无菌 IPVP 中对眼球进行消毒，持续两分钟。

将眼球转移至无菌硫代硫酸钠中，持续一分钟。再将眼球转移至无菌磷酸盐缓冲细胞系溶液中，静置直至进行操作。在层流罩下操作，用PBS清洗并取出眼球，置于无菌区域中。

用类固醇包裹眼球，保留角膜及角膜周围约五毫米的巩膜暴露。眼球可简单地用手握住。使用无菌剪刀维持适当压力，彻底清除结膜的所有残留组织，同时避免损伤角膜。

使用一次性手术刀片，在距角膜缘区域3至4毫米处做巩膜切口。然后将切口沿360度方向延伸，注意避免穿透下方的葡萄膜组织或导致角膜形态改变。在保持角膜正常曲率的情况下，做四个较大的切口，留下四个小间隙，避免玻璃体溢出。

四个切口均已完成，确保不切除任何其他组织。若存在小的巩膜斑块，可能会妨碍切割，因此需使用显微手术剪确保巩膜切除彻底。该操作应在不损伤脉络膜视网膜和玻璃体的情况下进行。

检查切口以确保其已完全切开。如果切口操作正确，角巩膜缘仅在与角膜相对应的位置处与睫状体相连，将带肋的眼球放置在无菌托盘中心附近。使用无菌镊子完成角膜的移除。

固定巩膜缘，将角膜巩膜缘从眼球壁上切除。轻轻分离角膜巩膜纽扣上残留的邻近组织。切勿以可能引起角膜跨张力的方式牵拉角膜巩膜缘，也不得使其回落到前房上。

使用低渗溶液检测角膜内皮细胞密度，使用台盼蓝染色约一分钟检测细胞死亡率。在无菌金属网纱上去除台盼蓝染料，并用无菌 PBS 清洗角膜。将其转移至盛有蔗糖溶液的无菌培养皿中。

该溶液有助于形成低渗环境，并有助于在显微镜下直观识别细胞。随后在光学显微镜下以100倍放大倍数对细胞进行计数，并以每平方毫米细胞数进行测量。通常需观察细胞密度的形态学特征，如细胞间边界、多形性变性、营养不良以及细胞死亡情况。

角膜厚度是移植过程中的一个重要特征，同时还需要考虑切除角膜的良好透明度。使用无菌角膜CLO在巩膜边缘固定角膜，弯曲角膜CLO以确保孔洞充分打开，从而锁住巩膜边缘，然后使用角膜镊将角膜巩膜边缘转移至先前准备好的、在室温下配制的角膜保存液中。在角膜保存的四周期间，应将其保存在31 SIU的温度条件下。

储存介质使用 B 9 2 4 0 仪器进行多项微生物学检测。在储存过程中，角膜会增厚，超过移植所需的正常厚度。眼库使用 D 肿胀剂来降低厚度，6% Dextron T 500 用于将角膜恢复至正常厚度，并作为运输介质。

在视网膜切除前，使用 RNA 专用清洁剂清洗无菌器械，以创建无 RNA 酶的环境。准备无菌操作区域，并确保眼球完整，仅去除角膜和巩膜边缘。若玻璃体正在渗出，则难以完整剥离视网膜组织。

若供体年龄低于65岁，在血清学检测后，将巩膜置于70%酒精中保存以用于手术。此种情况下，不切割巩膜，仅移除玻璃体，完整保留整个巩膜以供视网膜切除。从巩膜靠近角膜侧开始做一小切口，使用无菌镊子和剪刀向视神经方向操作。

使用无菌镊子夹住巩膜部分，用剪刀逐段直接朝视神经方向剪开，避免损伤玻璃体。脉络膜组织与巩膜粘连，需将其分离。完全剪开整个巩膜以暴露脉络膜组织。什么？

当巩膜被完全切断后，通过在视神经附近进行剪切，将巩膜与剩余组织分离，此时将可见覆盖在玻璃体上的一整层脉络膜。使用两把无菌镊子，向这些无RNA酶的无菌离心管中各加入2 ml RL裂解液。用一对镊子夹住视神经，另一对镊子轻轻剥离并移除脉络膜层。

部分分离脉络膜并进行剪切，以方便去除。可使用剪刀剪开脉络膜层，注意避免损伤视网膜。将切除的脉络膜层置于RNA later溶液中，并在4°C下保存24小时。

去除全部的额外脉络膜以暴露视网膜组织。当整个脉络膜层被完全去除后，将可见一层透明的视网膜。显然，脉络膜层内侧有布吕克膜（Bruch's membrane），也可一并去除，但肉眼难以识别。

同样，使用两把镊子去除视网膜层。若在视神经附近切除，则易于分离出大量视网膜。此时可观察到眼球的各层结构。

将切除的视网膜组织放入RNA later溶液中，在4°C条件下保存24小时。使用70%异丙醇酒精清洁工作区域。在倒置显微镜下以100倍放大倍数观察经台盼蓝染色的内皮细胞。

通常会保留每平方毫米超过200个细胞的合适角膜用于后续使用。将其质量从一般到优良进行评级，有助于开展比较研究。通常在角膜准备用于移植时，需记录其厚度和透明度，合适的角膜将用于穿透性角膜移植术，即移植整个角膜。

通过观察被染成蓝色的细胞来检测细胞死亡率，并以死亡细胞的百分比进行评估。在保存过程中，若总体细胞死亡率超过2%，则视为不适合。如果细胞密度低于每平方毫米2200个细胞，或存在因细胞死亡造成的损伤，则角膜可用于前层角膜移植术。

如果前部组织受损但角膜内皮细胞密度良好，该角膜可用于后部板层角膜移植。在器官培养期间，角膜厚度通常会增加。运输介质有助于恢复其正常的形态和结构。

此外，器官培养有助于角膜的重新上皮化，且由于其较长的保存时间，有利于供体的合理筛选。可进行微生物学和血清学检测，为手术安排提供充足时间，并在死亡后时间较长而无法及时检测时，帮助评估角膜内皮细胞密度和形态。

因此，只要按照所述步骤操作，即可在不损伤其他组织的情况下摘除角膜。如果角膜不适合用于移植，仍可用于科研目的，例如开发新的培养基和保存条件，以研究眼表疾病、分离角膜缘干细胞，以及研究药物对角膜的作用。对于视网膜组织，我们可避免RNA样本被中心组织污染，从而保持RNA的完整性，这对研究具有根本性的重要意义。

这些对科研至关重要的组织旨在用于表征眼组织的转录组、分离干细胞以用于再生医学项目，以及评估正常个体与患病个体之间组织的组织学差异。视网膜组织取出后可用于不同用途，因此后续的保存步骤和条件也可能相应不同。例如，视网膜组织可置于含有RNA稳定试剂（如RNAlater或Thisis缓冲液）的离心管中，用于RNA或DNA提取；也可用于细胞分离，如使用Dispase或胰蛋白酶处理。

在将组织包埋于石蜡或OCT中用于免疫组织化学之前，进行固定处理。感谢观看本视频，祝您的研究顺利。