Name: 简化技术原位切除角膜和视网膜组织剜人眼地球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 了解简化技术原位切除角膜和视网膜组织剜人眼地球的方法，用于移植、手术或研究目的。该技术在18年经验基础上开发，可最大程度保护眼组织完整性并维持高质量标准。

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本工作部分得到了威尼托大区（Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 和 Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009）资助项目的资助。作者感谢 C. Griffoni 博士提供了关于人眼眼球使用情况的 2009/2010 年汇总数据。

1. 原位 眼球角膜的摘除
<ol>
 <li> 使用前约15分钟开启层流空气柜。使用70%异丙醇清洁层流罩。穿戴个人防护装备，如手术帽和口罩。刷洗双手及前臂，并用无菌毛巾擦干。采用无菌技术佩戴无菌手套及无菌手术衣或袖套。 </li>
 <li> 通过无菌操作放置无菌器械托盘以建立无菌区域。确认器械处于无菌状态。打开无菌器械包，并将其翻转至无菌区域，避免任何污染。 </li>
 <li> 将所有无菌材料和器械（表2）以及装有眼球的瓶子（眼罐）放置在无菌区域边缘附近，以便于取用。 </li>
 <li> 根据 表3 所示，用预先准备好的保存/储存液标记各瓶子，并将其与I-PVP（碘-聚乙烯吡咯烷酮）、硫代硫酸钠及无菌生理盐水PBS（磷酸盐缓冲液）一同置于层流空气柜台面上。 </li>
 <li> 眼部组织和溶液通常保存于4 °C冰箱中，需使其恢复至室温后再使用。避免反复升温/降温循环。将溶液瓶盖及眼罐盖子内面朝上放置于各自对应的瓶子旁边。 </li>
 <li> 使用无菌镊子从眼罐中取出纱布和海绵。将眼球浸入0.5%无菌I-PVP中2分钟，以去污染眼球表面。将两把镊子置于无菌托盘盖上，位于无菌区域外。使用另一对无菌镊子将眼球转移至0.1%硫代硫酸钠溶液中1分钟。再用同一对镊子将眼球转移至含有无菌生理盐水（PBS）的瓶子中，直至进行下一步操作。对同一供体的另一只眼球重复相同操作。 </li>
 <li> 在层流罩下操作，用无菌纱布（绷带）包裹眼球，仅暴露角膜及角膜周围约5 mm的巩膜。眼球可直接用手持握，保持适当压力。整个手术过程中应保持组织湿润。 </li>
 <li> 使用镊子配合剪刀彻底清除结膜残余组织。上述操作所用器械应与其他器械分开使用。使用手术刀片在距角膜缘3-4 mm处做巩膜切口，随后将切口延展至360°，注意避免穿透下方的葡萄膜组织或改变角膜正常曲率。做四个较大的切口，保留四个小间隙，防止玻璃体溢出。四个间隙的切割应确保不切除其他组织。 </li>
 <li> 若存在小的巩膜斑块可能影响切割，应使用显微手术剪完成巩膜切除。此操作过程中不得损伤脉络膜、视网膜及玻璃体。 </li>
 <li> 检查切口是否完整。若切口操作正确，角膜-巩膜环仅在对应角膜位置处与睫状体相连。 </li>
 <li> 将包裹好的眼球置于无菌区域中央附近。使用镊子固定巩膜边缘，另一只手向下并远离角膜-巩膜纽扣方向牵拉睫状体-脉络膜，完成角膜的剥离。 </li>
 <li> 轻柔分离角膜-巩膜纽扣上任何残留的粘连组织。切勿以可能导致角膜横向张力的方式牵拉角膜-巩膜环，也不允许其回落至前房内。 </li>
 <li> 使用低渗溶液检测角膜内皮细胞密度，并用台盼蓝染色约1分钟检测细胞死亡率，随后在光学显微镜下计数并以细胞/mm2表示。操作时前房应朝向培养皿盖，后部朝向培养皿底部。可在100倍物镜下借助目镜网格手动计数内皮细胞密度。在意大利，用于移植的最低可接受细胞密度为2200个内皮细胞/mm2。 </li>
 <li> 使用角膜抓钳将角膜-巩膜环转移至预先准备、保存于室温（RT）的角膜保存液中，如 表3 所示。 </li>
 <li> 检查后房是否存在天然晶状体。若巩膜已处理完毕，清除眼球上所有葡萄膜和玻璃体残余。小心拆开包裹并以无菌技术将剩余的后部节段放回对应的眼罐中。对另一只眼球使用新器械重复上述操作。用角膜抓钳固定角膜，并在31 °C条件下置于保存液（器官培养）中保存。切除后的角膜，如 图1a 所示，可用于角膜移植或科研。 </li>
 <li> 将不必要的材料和生物危害性废弃物投入指定的废物容器中。工作完成后，使用70%异丙醇喷雾清洁工作区域。 </li>
 <li> 若角膜在保存28天后仍保持所有评估参数（如形态、细胞计数、透明度、厚度及微生物学检测——使用Bactec 9240仪器（Becton Dickinson, Milan, Italy）进行细菌和真菌检测）合格，则可使用 表4 所示的运输介质将角膜运送至医院。角膜应于层流空气柜内从保存介质转移至运输介质。 </li>
 <li> 由于在保存过程中角膜会增厚，超出移植所需正常厚度，眼库通常使用脱水剂降低其厚度。我们使用6%右旋糖酐T500使角膜在运输介质中恢复至正常大小。尽管可使用4-8%右旋糖酐T500，但6%浓度在本机构应用效果最佳。这有助于外科医生在收到角膜后能立即进行移植。 </li>
</ol>
2. 切除角膜后从眼球中摘除视网膜
<ol>
 <li> 切除后，根据角膜的形态和内皮细胞密度选择用于移植或研究的角膜，并将其置于31 °C的保存或保存培养基中。眼球的其余部分则进行进一步处理，例如用于手术目的的巩膜分离、视网膜用于研究等。</li>
 <li> 在进行视网膜切除前，确保眼球完整，仅角膜连同部分巩膜已被移除。如果胶状的玻璃体正在渗出，则难以完整取出视网膜组织。</li>
 <li> 若供体年龄低于65岁，在血清学检测后将巩膜保存于无菌PBS中以用于外科手术。在此情况下，巩膜不进行切割，仅移除玻璃体，完整保留整个巩膜。</li>
 <li> 进行视网膜切除时，使用无菌镊子和剪刀，从巩膜的角膜侧开始做一小切口，朝向视神经方向进行。用镊子夹住巩膜部分，用剪刀沿直线朝视神经方向逐段剪开，避免损伤玻璃体。</li>
 <li> 脉络膜斑块应与巩膜分离，因为它们通常粘连在一起。将整个巩膜剪开以暴露脉络膜组织。一旦巩膜完全被剪开，靠近视神经处剪断，使巩膜与残留的玻璃体分离。此时可见一个被脉络膜包裹的完整玻璃体球，如图2a所示。</li>
 <li> 使用两把无菌镊子，用其中一把轻轻夹起脉络膜层，另一把将其剥离，从而轻柔地去除脉络膜层。也可使用剪刀去除脉络膜层，但应尽量避免，因其可能损伤视网膜。可先部分去除脉络膜层并进行剪切，以利于完整剥离。</li>
 <li> 一旦去除脉络膜层，即可清晰看到一层透明的视网膜，如图2b所示。脉络膜层内侧附有布鲁赫膜（Bruch's membrane），也可一并去除，但肉眼难以识别。</li>
 <li> 同样地，使用两把镊子去除视网膜层，如图2c所示。若在视神经附近进行切除，则更容易获得大量视网膜组织。此时，眼球的所有层次结构均可清晰观察，如图2d所示。</li>
 <li> 视网膜组织取出后，可根据不同用途进行后续处理，因此所采用的保存步骤和条件可能有所不同。例如，可将视网膜组织置于含有RNA稳定试剂（如RNAlater）的离心管中，或置于裂解缓冲液（用于RNA或DNA提取）、dispase/trypsin酶（用于细胞分离）、固定液（用于组织包埋于石蜡或OCT前的免疫组织化学处理）中。</li>
 <li> 清理所有工作区域，并使用70%异丙醇喷雾清洁操作台面。</li>
</ol>
3. 典型结果
角膜-巩膜缘的外观如图所示 图1a 是一枚切取适当、带有足够巩膜缘且内皮形态符合要求的角膜，此类角膜通常用于穿透性角膜移植术。若切取的角膜前基质受损并伴有混浊，则可用于内皮角膜移植术/后板层角膜移植术（保留内皮及部分基质）。而若内皮层受损或内皮细胞密度降低， &lt; 2200 个细胞/mm2 （意大利标准），若角膜内皮细胞计数低于规定要求，该角膜可用于前部板层角膜移植术（上皮及部分前基质层）或用于科研；若角膜完全受损，则可用于科研，如图所示 图1b、3b和3c 或废弃。损伤可能由组织处理不当、既往白内障手术导致的基质层或后弹力层内皮瘢痕、患者生前发生的物理性损伤等原因引起。因此，有必要先用裂隙灯检查每份组织，再在光学显微镜下观察是否存在细微瘢痕、皱褶或脱离。角膜通常保存在两种不同条件下，如器官培养（约 31 °C）通常在欧洲国家或低温条件下（约 4 °C通常在美国使用。我们采用器官培养法，因为它有助于修复受损的上皮细胞，恢复高死亡后时间角膜内皮细胞的活力，支持长达4周的保存期，为手术安排提供了充足的时间窗口，并为微生物学（细菌和真菌）及血清学检测等提供足够时间。角膜在运输培养基中可良好保存7天。
可逐部分剪切巩膜，以确保轻柔地清除所有脉络膜斑块。当如图4所示锐性切断视神经、脉络膜或视网膜时，玻璃体液可能流出。若摘取视网膜用于RNA分析，应在组织离体后立即保存于RNAlater中。通常切取1×1 cm大小的脉络膜和视网膜组织，置于RNAlater中于4 °C保存24小时后，转移至新的Eppendorf管（安全锁扣管，2 ml）中，在-80 °C长期保存，直至使用或用干冰运输。为避免与其他色素结构污染，应使用两把镊子在视神经附近、远离虹膜或睫状体边缘处摘取视网膜组织，并立即转移至保存容器中，因为视网膜RNA在操作过程中极易降解。
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="角膜保存效果对比，巩膜边缘及弯曲角膜，生物学实验结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 高质量与低质量角膜的比较：a) 正确切除的角膜。此类角膜通常在器官培养条件下保存4周。在运送至医院前，需进行微生物学检测（使用Bactec 9240仪器）和形态学检测（用台盼蓝染色以测定细胞死亡率，并在光学显微镜下以100倍放大倍数观察细胞）（图3a）；b) 弯曲的角膜，由于后弹力层皱褶明显且角膜内皮细胞损伤严重，使用裂隙灯显微镜检查后通常会导致移植排斥。此类角膜通常用于科研或被废弃。
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="眼球解剖示意图，显示巩膜、脉络膜、视网膜、视神经和玻璃体的结构。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于确保准确切除视网膜组织的方法。a) 使用24 mm刀片，配合95 mm弯曲或钝头无菌剪刀和100 mm、11×2规格、齿宽0.70 mm的无菌镊子，从眼球上分离巩膜。操作时应使用镊子夹住一侧巩膜，用剪刀沿直线朝视神经方向剪开。此时可清晰看到脉络膜层；b) 使用两把100 mm、11×2规格、齿宽0.70 mm的无菌镊子，通过撕开的方式去除脉络膜，从而暴露出下方透明的视网膜层；c) 使用相同的镊子，在靠近视神经处小心切除透明的视网膜层，避免挤出玻璃体液。两把镊子应分别夹住视网膜两侧，从视神经附近开始，轻柔地向角膜方向移除组织，以获取足量的视网膜组织。该组织可切成不同大小，用于后续分析实验；d) 本图展示了去除角膜后眼球的不同层次结构。首先去除脉络膜，随后在不损伤眼球其他部分的前提下分离视网膜。
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="显微镜图像显示组织样本中内皮细胞脱落及医源性皱褶。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 在光学显微镜100倍放大下观察到的不同类型的细胞密度与形态的比较。a) 良好的角膜内皮细胞密度（>2200 个细胞/mm2）和形态（多形性较低、退变少、无营养不良且细胞死亡率为0%），表明该角膜适合用于移植；b) 角膜内皮细胞密度较差（约1200–1400 个细胞/mm2），形态异常（细胞多形性显著增高、严重退变），并伴有约30–40%的整体细胞死亡率，经台盼蓝染色后可见；c) 在从眼球中取出角膜时，由于内皮层片状脱落，导致部分内皮细胞受损；通过台盼蓝染色区域中细胞死亡的观察可证实这一点；d) 后弹力层皱褶的形成是由于在切除过程中操作不当所致，例如弯曲角膜、造成跨角膜张力、过度使用器械等。图中显示了在角膜周边区与光学区之间形成的明显医源性皱褶。
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="眼球解剖示意图，标注玻璃体，突出显示解剖结构及污染物检测。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 在切除角膜过程中对脉络膜和视网膜组织造成的损伤，最终会导致玻璃体液的流出。视网膜会因此与玻璃体粘连，使得在无污染的情况下获取高质量组织样本变得困难。
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="手术活动表；角膜移植术、内角膜移植术数据；2009-2010年趋势分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表1"> 
表1. 2009年和2010年在意大利威尼斯眼库基金会（Fondazione Banca Degli Occhi）使用人眼球组织开展的各项活动汇总。约60%的组织用于移植，因此仍有大量眼球组织（约40%）可用于科学研究与医学研究。
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="眼睛解剖图；标注部分包括角膜、巩膜，展示人眼结构。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="补充图1"> 
补充图1. 人眼的解剖结构5。本图展示了人眼的不同部分，用于确定组织的精确位置。

<ol><li>Fay, A. Diseases of the visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFay%2C+A+%22Cecil+Medicine%22">Cecil Medicine</a>. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).</li>
<li>Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+in+Limbal+Stem+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents in Limbal Stem Cell Biology.</a> Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).</li>
<li>Pharm, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Eye%3A+The+physiology+of+human+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Britannica+educational+publishing%22%5BJournal%5D)">The Eye: The physiology of human perception.</a> Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).</li>
<li>Lang, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLang%2C+G+%22Ophthalmology%3A+A+pocket+textbook+atlas%22">Ophthalmology: A pocket textbook atlas</a>. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.</li>
<li>Liesbeth, P. els <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Culture%3A+The+method+of+choice+for+preservation+of+human+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).</li>
<li>Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).</li>
<li>Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555(2010).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+Mouse+Eye+for+a+Whole+Mount+of+the+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (48), e2563(2011).</li>
<li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evisceration+of+Mouse+Vitreous+and+Retina+for+Proteomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses.</a> J. Vis. Exp. (50), e2795(2011).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

角膜和视网膜组织的正确切除与妥善保存均至关重要，因为微小的缺陷（如内皮损伤或后弹力层皱褶过多）可能导致角膜移植失败，而温度变化或操作不当则可能破坏视网膜组织的完整性。本文旨在展示如何以最佳方式分离角膜和视网膜组织，避免造成可能影响其用于移植或研究的损伤或改变。组织适用于移植的标准包括最低细胞密度（&gt;2200 个细胞/mm2）、良好的形态学特征（如细胞大小、结构完整、细胞间边界退化程度低、无营养不良性改变），以及角膜的良好透明度和适当厚度。若手术刀片使用粗暴或过度使用其他器械，不仅会损伤角膜，还可能损害玻璃体，从而增加其他组织进一步切除的难度（图4）。视网膜为透明组织，若其伴随玻璃体液一同释放，则难以辨认，通常会使视网膜组织的切除更加复杂。若视网膜与玻璃体一同被切除，则所获组织或提取的RNA质量将因其他眼部结构的污染而显著降低。因此，采用适当的技术进行角膜或视网膜的切除，对于获取高质量组织至关重要。
我们过去两年的数据（表1）表明，从眼球中获取的角膜约有60%适用于各种类型的移植手术。这进...

<table><tbody><tr><td colspan="4">角膜和视网膜切除所需材料。</td></tr><tr><td>带护套一次性手术刀</td><td>刀片尺寸 15</td><td>Swann-Morton</td><td></td></tr><tr><td>无菌敷料</td><td>5 cm × 5 cm，8 层，5 片</td><td>Artsana</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性医用巾</td><td>35 × 50 cm</td><td>U.Jet</td><td></td></tr><tr><td>无菌剪刀</td><td>刀刃 24 mm / 总长 95 mm，弯曲，钝头</td><td>e.janach</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>不锈钢 - 100 mm，11 × 2 齿，齿距 0.70 mm</td><td>e.janach</td><td></td></tr><tr><td>角膜抓钳 &amp;#8211; 一次性医用器械</td><td></td><td>NIIOS (Hippocratech)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>100 ml PBS [10x] 加入 900 ml d/w（蒸馏水）中</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>1 g 硫代硫酸钠溶于 1 升 PBS [1x] 中</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>碘伏聚维酮（I-PVP）</td><td>5 g I-PVP 溶于 1 升蒸馏水中</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 2.&lt;/strong&gt; 本表列出了用于角膜和视网膜切除的材料及其来源公司。</td></tr><tr><td colspan="4">保存液材料（2000 ml）。</td></tr><tr><td>MEM (1X) 液体</td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360-039</td><td>1 mM (10 ml/l)</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-032</td><td>2 mM (10 ml/l)</td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955-20ML</td><td>10 ml/l</td></tr><tr><td>新生小牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>26010-74</td><td>2% (20 ml/l)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 3. &lt;/strong&gt;保存液材料。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;保存液的配制&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">按照上述指定浓度，将所有成分加入容器中并充分混匀。使用蠕动泵和孔径为 0.2 微米的滤器（Millipore，意大利米兰）进行过滤。将配制好的保存液置于瓶中，室温保存。</td></tr><tr><td colspan="4">运输液材料（2000 ml）。</td></tr><tr><td>MEM (1X) 液体 </td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360-039</td><td>1 mM (10 ml/l)</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-032</td><td>2 mM (10 ml/l)</td></tr><tr><td>新生小牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>26010-74</td><td>2% (20 ml/l)</td></tr><tr><td>右旋糖酐 T500</td><td>Pharmacosmos</td><td>551005004007</td><td>6% (60 g/升)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 4.&lt;/strong&gt; 运输液材料。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;运输液的配制&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">将 6% 右旋糖酐加入约 1.5 升 MEM 中，静置过夜。然后加入其余成分，使用真空泵和 0.2 微米滤器（Millipore，意大利米兰）过滤。将运输液分装至瓶中，室温保存。</td></tr></tbody></table>

一种简化的技术方法 原位 人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

去核是指从尸体供体中取出眼球，同时保持眼球其余部分不受干扰的过程。摘除是指通过切割将眼组织（尤其是角膜）从眼球上分离并取出的操作。去脏是指移除眼球内部器官（此处指视网膜）的过程。眼球包括角膜、巩膜、玻璃体、晶状体、虹膜、视网膜、脉络膜、肌肉等（补充图1）。当患者出现角膜损伤时，需要将受损角膜切除，并通过角膜移植手术植入健康的角膜。视网膜功能的遗传性疾病或缺陷可能损害视力。人眼眼球可用于多种外科手术，如眼库保存、人角膜或巩膜移植以及眼组织相关研究。然而，关于人角膜和视网膜摘除的信息十分有限，可能是因为人眼组织获取途径受限所致。大多数描述类似操作的研究均在动物模型上进行。科研人员依赖于能够获得经过适当解剖且保存良好的眼组织，以进一步加深对人眼发育、稳态及功能的认识。由于我们接收到大量眼球组织，其中约40%（表1）用于科研目的，因此能够在这些组织上开展大量实验，从而不断定义和完善组织摘除与保存的技术方法。
角膜是一种无血管组织，能够使光线透射到视网膜，因此必须始终保持良好的透明度。在角膜中，位于角膜边缘的角膜缘区域是干细胞的储存库，有助于上皮细胞的重建，并限制结膜过度生长，从而维持角膜的透明性和清晰度。角膜的大小和厚度对清晰视力至关重要，因为其中任一参数的变化都可能导致视力分散或模糊。角膜由五层组成：a）上皮层，b）前弹力层（Bowman层），c）基质层，d）后弹力层（Descemet膜），以及e）内皮层。所有这些层次都必须正常运作，才能确保清晰的视力4,5,6。脉络膜是位于巩膜与视网膜之间的中层被膜，其内侧以Bruch膜为界，负责眼部的血液供应。脉络膜还参与调节眼内温度，并为视网膜外层提供营养5,6。视网膜是一层覆盖在眼球后部的神经组织（补充 图1），由两部分组成：感光部分和非感光部分。视网膜接收来自角膜和晶状体的光线，并将其转化为化学能，最终通过视神经将信号传递至大脑5,6。
本文旨在提供一种从人眼眼球中分离角膜和视网膜组织的实验方案。避免与邻近组织发生交叉污染并保持RNA完整性至关重要，因为这些组织对于以下研究不可或缺：（i）表征眼部组织的转录组；（ii）分离干细胞用于再生医学项目；（iii）评估正常与患病个体组织之间的组织学差异。本文描述了我们目前用于从眼球中去除角膜、脉络膜及视网膜组织的技术。此处提供了一套详细的人眼球解剖及角膜和视网膜组织切除的实验操作流程。配套视频将有助于研究人员掌握一种适当的技术，以获取这些难以常规获得的珍贵人源组织。

本文介绍了一种简化技术，用于从人尸体供体的眼球中切除角膜和摘除视网膜组织。此处描述的技术有助于获取高质量的组织，用于移植、手术或研究目的，同时避免损伤眼球的其他组织。

去核是指从尸体供体中取出眼球，同时保持眼球其余部分不受干扰的过程。切除是指……

今天，我们将演示一种简化的方法，用于从人类尸体供体的眼球中获取角膜和视网膜组织。本方法有助于获取高质量的组织，用于移植、手术训练及科研用途，同时不损伤眼球的其他组织。凭借每年移植数千例角膜的18年专业经验，我们通过不断开发新技术并持续提升技能，始终保持了工作的高标准。为实现这一目标，我们首先对角膜进行操作，随后进行视网膜剥离。角膜是一种无血管组织，能够将光线透射至视网膜，因此必须始终保持良好的透明度。角膜由五层结构组成，分别为上皮层、前弹力层（Bowman层）、基质层、后弹力层（Descemet膜）和内皮层。如果角膜受损，可以通过合适的供体角膜进行替换。脉络膜是位于巩膜与视网膜之间的中层膜状结构，其内侧以布鲁赫膜（Bruch's membrane）为界，负责眼球内的血液供应。对脉络膜进行适当的去脏处理，与视网膜的清除同样重要。视网膜有助于接收来自角膜和晶状体的光，并将其转化为化学能，最终传递至大脑。借助视神经，因其透明且脆弱，应系统地进行去眼球操作以获得高质量的组织。打开层流超净工作台。使用70%异丙醇清洁超净工作台。穿戴个人防护装备，如手术帽、口罩、无菌手套和袖套。采用无菌技术，通过放置无菌巾和预消毒的器械托盘来建立无菌区域。无菌打开无菌器械托盘背面，并翻转至无菌区域，避免任何污染。将所有无菌物品和器械放置在无菌区域内，并将装有眼球的眼科罐置于靠近无菌区域边缘的位置以便操作。为方便使用，对预先准备好的储存液瓶进行标记，并将碘伏多醇瓶盖置于硫代硫酸钠上，同时放置无菌磷酸盐缓冲盐溶液。在无菌喂养环境外，将眼组织和溶液从4°C的冰箱中取出后，使其升至室温。避免反复升温或降温循环。使用无菌镊子从眼罐中取出纱布和海绵。将眼球置于眼睑上并移除额外的绷带。小心地用视神经夹取眼球，并将眼球浸入无菌 IPVP 中。在无菌 IPVP 中对眼球进行消毒，持续两分钟。将眼球转移至无菌硫代硫酸钠中，持续一分钟。再将眼球转移至无菌磷酸盐缓冲细胞系溶液中，静置直至进行操作。在层流罩下操作，用PBS清洗并取出眼球，置于无菌区域中。用类固醇包裹眼球，保留角膜及角膜周围约五毫米的巩膜暴露。眼球可简单地用手握住。使用无菌剪刀维持适当压力，彻底清除结膜的所有残留组织，同时避免损伤角膜。使用一次性手术刀片，在距角膜缘区域3至4毫米处做巩膜切口。然后将切口沿360度方向延伸，注意避免穿透下方的葡萄膜组织或导致角膜形态改变。在保持角膜正常曲率的情况下，做四个较大的切口，留下四个小间隙，避免玻璃体溢出。四个切口均已完成，确保不切除任何其他组织。若存在小的巩膜斑块，可能会妨碍切割，因此需使用显微手术剪确保巩膜切除彻底。该操作应在不损伤脉络膜视网膜和玻璃体的情况下进行。检查切口以确保其已完全切开。如果切口操作正确，角巩膜缘仅在与角膜相对应的位置处与睫状体相连，将带肋的眼球放置在无菌托盘中心附近。使用无菌镊子完成角膜的移除。固定巩膜缘，将角膜巩膜缘从眼球壁上切除。轻轻分离角膜巩膜纽扣上残留的邻近组织。切勿以可能引起角膜跨张力的方式牵拉角膜巩膜缘，也不得使其回落到前房上。使用低渗溶液检测角膜内皮细胞密度，使用台盼蓝染色约一分钟检测细胞死亡率。在无菌金属网纱上去除台盼蓝染料，并用无菌 PBS 清洗角膜。将其转移至盛有蔗糖溶液的无菌培养皿中。该溶液有助于形成低渗环境，并有助于在显微镜下直观识别细胞。随后在光学显微镜下以100倍放大倍数对细胞进行计数，并以每平方毫米细胞数进行测量。通常需观察细胞密度的形态学特征，如细胞间边界、多形性变性、营养不良以及细胞死亡情况。角膜厚度是移植过程中的一个重要特征，同时还需要考虑切除角膜的良好透明度。使用无菌角膜CLO在巩膜边缘固定角膜，弯曲角膜CLO以确保孔洞充分打开，从而锁住巩膜边缘，然后使用角膜镊将角膜巩膜边缘转移至先前准备好的、在室温下配制的角膜保存液中。在角膜保存的四周期间，应将其保存在31 SIU的温度条件下。储存介质使用 B 9 2 4 0 仪器进行多项微生物学检测。在储存过程中，角膜会增厚，超过移植所需的正常厚度。眼库使用 D 肿胀剂来降低厚度，6% Dextron T 500 用于将角膜恢复至正常厚度，并作为运输介质。在视网膜切除前，使用 RNA 专用清洁剂清洗无菌器械，以创建无 RNA 酶的环境。准备无菌操作区域，并确保眼球完整，仅去除角膜和巩膜边缘。若玻璃体正在渗出，则难以完整剥离视网膜组织。若供体年龄低于65岁，在血清学检测后，将巩膜置于70%酒精中保存以用于手术。此种情况下，不切割巩膜，仅移除玻璃体，完整保留整个巩膜以供视网膜切除。从巩膜靠近角膜侧开始做一小切口，使用无菌镊子和剪刀向视神经方向操作。使用无菌镊子夹住巩膜部分，用剪刀逐段直接朝视神经方向剪开，避免损伤玻璃体。脉络膜组织与巩膜粘连，需将其分离。完全剪开整个巩膜以暴露脉络膜组织。什么？当巩膜被完全切断后，通过在视神经附近进行剪切，将巩膜与剩余组织分离，此时将可见覆盖在玻璃体上的一整层脉络膜。使用两把无菌镊子，向这些无RNA酶的无菌离心管中各加入2 ml RL裂解液。用一对镊子夹住视神经，另一对镊子轻轻剥离并移除脉络膜层。部分分离脉络膜并进行剪切，以方便去除。可使用剪刀剪开脉络膜层，注意避免损伤视网膜。将切除的脉络膜层置于RNA later溶液中，并在4°C下保存24小时。去除全部的额外脉络膜以暴露视网膜组织。当整个脉络膜层被完全去除后，将可见一层透明的视网膜。显然，脉络膜层内侧有布吕克膜（Bruch's membrane），也可一并去除，但肉眼难以识别。同样，使用两把镊子去除视网膜层。若在视神经附近切除，则易于分离出大量视网膜。此时可观察到眼球的各层结构。将切除的视网膜组织放入RNA later溶液中，在4°C条件下保存24小时。使用70%异丙醇酒精清洁工作区域。在倒置显微镜下以100倍放大倍数观察经台盼蓝染色的内皮细胞。通常会保留每平方毫米超过200个细胞的合适角膜用于后续使用。将其质量从一般到优良进行评级，有助于开展比较研究。通常在角膜准备用于移植时，需记录其厚度和透明度，合适的角膜将用于穿透性角膜移植术，即移植整个角膜。通过观察被染成蓝色的细胞来检测细胞死亡率，并以死亡细胞的百分比进行评估。在保存过程中，若总体细胞死亡率超过2%，则视为不适合。如果细胞密度低于每平方毫米2200个细胞，或存在因细胞死亡造成的损伤，则角膜可用于前层角膜移植术。如果前部组织受损但角膜内皮细胞密度良好，该角膜可用于后部板层角膜移植。在器官培养期间，角膜厚度通常会增加。运输介质有助于恢复其正常的形态和结构。此外，器官培养有助于角膜的重新上皮化，且由于其较长的保存时间，有利于供体的合理筛选。可进行微生物学和血清学检测，为手术安排提供充足时间，并在死亡后时间较长而无法及时检测时，帮助评估角膜内皮细胞密度和形态。因此，只要按照所述步骤操作，即可在不损伤其他组织的情况下摘除角膜。如果角膜不适合用于移植，仍可用于科研目的，例如开发新的培养基和保存条件，以研究眼表疾病、分离角膜缘干细胞，以及研究药物对角膜的作用。对于视网膜组织，我们可避免RNA样本被中心组织污染，从而保持RNA的完整性，这对研究具有根本性的重要意义。这些对科研至关重要的组织旨在用于表征眼组织的转录组、分离干细胞以用于再生医学项目，以及评估正常个体与患病个体之间组织的组织学差异。视网膜组织取出后可用于不同用途，因此后续的保存步骤和条件也可能相应不同。例如，视网膜组织可置于含有RNA稳定试剂（如RNAlater或Thisis缓冲液）的离心管中，用于RNA或DNA提取；也可用于细胞分离，如使用Dispase或胰蛋白酶处理。在将组织包埋于石蜡或OCT中用于免疫组织化学之前，进行固定处理。感谢观看本视频，祝您的研究顺利。

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一种简化的技术方法原位人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

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一种简化的技术方法 原位 人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

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