Name: 衍生Aldononitrile乙酸氨基葡萄糖和胞壁酸的微生物在土壤中残留量的测定气相色谱的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 了解利用气相色谱法分析土壤中氨基葡萄糖和胞壁酸的醛腈乙酸酯衍生物的详细方法。本方案涵盖酸水解、分离纯化、衍生化及GC检测等关键步骤，可实现基线分离和精确定量，为土壤微生物残体研究提供可靠技术支撑。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了美国能源部大湖生物能源研究中心（DOE BER 科学办公室 DE-FC02-07ER64494）资助项目的资助。我们感谢张旭东博士及其团队成员在技术讨论以及完善本实验方案过程中提供的宝贵意见和帮助。

1. 样品制备与酸提取
<ol>
	<li>野外采集土壤样品后进行冷冻干燥。</li>
	<li>使用球磨机、土壤研磨仪或研钵与研杵将土壤样品研磨并均质化。</li>
	<li>称取土壤样品（含氮量 > 0.3 mg）至25 mL水解瓶中。</li>
	<li>向每个水解瓶中加入10 mL 6M HCl，通入N2气体，并 tightly 密封。</li>
	<li>使用自动定时开关，在培养箱中于105 °C水解8小时。</li>
</ol>
2. 样品纯化
<ol>
	<li>从培养箱中取出烧瓶，冷却至室温。</li>
	<li>向每个烧瓶中加入 100 μL 内标肌醇（1 mg mL-1 水溶液），轻轻旋转混匀。</li>
	<li>安装带有 ST/NS 24/40 接口的塑料漏斗，使其流入 200 mL 梨形烧瓶，并将烧瓶置于塑料杯上以保持稳定。</li>
	<li>将 Whatman #2 定性滤纸圆片（直径 11 cm）折叠成四分之一，放入漏斗中。</li>
	<li>轻轻旋转每个水解烧瓶，将悬浊液倒入漏斗进行过滤（可用约 3 mL 水进一步冲洗每个烧瓶）。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪在约 45 °C 下减压干燥滤液。</li>
	<li>用 3~5 mL 水重新溶解每个梨形烧瓶中的干燥残渣（如需要可使用超声浴），然后转移至 40 mL 聚四氟乙烯（Teflon）管中；再用一份水冲洗烧瓶。</li>
	<li>用 1 M KOH 溶液调节 pH 至 6.6–6.8，以沉淀金属离子和其他有机分子。</li>
	<li>在 2000 rcf 下离心 10 分钟，去除沉淀物。</li>
	<li>将上清液倒入 40 mL 玻璃管中，用封口膜覆盖管口，在 -20 °C 冷冻后，在封口膜上刺孔。</li>
	<li>冷冻干燥已冻结的上清液，以完全去除液体。</li>
	<li>用 3 mL 干燥甲醇溶解残渣，充分涡旋振荡（如需要可使用超声浴）；盖紧管盖，然后在 2000 rcf 下离心 10 分钟以沉淀盐分。</li>
	<li>将上清液转移至 3 mL 锥形反应小瓶中，在 45 °C 下使用 RapidVap 仪器蒸发至干燥（或如需要可在干燥氮气流下蒸发）。</li>
	<li>向每个小瓶中加入 100 μL 回收标准物 N-甲基葡糖胺（1 mg mL-1 水溶液）和 1 mL H2O，用封口膜覆盖瓶口，在 -20 °C 冷冻，刺穿封口膜，然后进行冷冻干燥。</li>
	<li>制备标准品：向小瓶中加入 100 μL 胞壁酸（0.5 mg mL-1 甲醇溶液）、100 μL 葡糖胺（1 mg mL-1 水溶液）、100 μL 肌醇（1 mg mL-1 水溶液）、100 μL N-甲基葡糖胺（1 mg mL-1 水溶液）以及 1 mL H2O，用封口膜密封每个小瓶，在 -20 °C 冷冻，刺穿封口膜，然后进行冷冻干燥。</li>
</ol>
3. 衍生化
<ol>
	<li>配制衍生化试剂：将 32 mg mL-1 盐酸羟胺和 40 mg mL-1 4-二甲氨基吡啶溶于吡啶-甲醇（4:1 v/v）中。</li>
	<li>向每个反应小瓶中加入 300 μL 衍生化试剂，盖紧瓶盖，并充分涡旋混匀。</li>
	<li>将小瓶置于 75–80 °C 水浴中加热 35 分钟（确保小瓶密封良好，防止水进入瓶内）。</li>
	<li>从水浴中取出小瓶，冷却至室温。</li>
	<li>向每个 3 mL 反应小瓶中加入 1 mL 乙酸酐，盖紧瓶盖，充分涡旋混匀，然后在 75–80 °C 水浴中重新加热 25 分钟。</li>
	<li>从水浴中取出小瓶，冷却至室温。</li>
</ol>
4. 分离与测定
<ol>
	<li>向每个小瓶中加入 1.5 mL 二氯甲烷，盖紧瓶盖，并充分涡旋混匀。</li>
	<li>向每个小瓶中加入 1 mL 1 M HCl，盖紧瓶盖并充分涡旋混匀，静置至两相分离，使用 1000 μL 移液器吸取并弃去上层（水相）。</li>
	<li>以相同方式用 1 mL H2O 对有机相进行 3 次萃取（最后一次洗涤时，需特别注意确保所有上层水相均被完全移除）。</li>
	<li>使用 RapidVap 在 45 °C 下干燥最终溶液（或根据需要使用氮气吹干）。</li>
	<li>用 300 μL 乙酸乙酯-正己烷（1:1 v/v）溶解，转移至含小体积内插管的 2 mL 棕色螺口小瓶中，盖紧瓶盖。</li>
	<li>进行定量分析时，采用 GC-FID 分析，色谱柱为熔融石英非极性毛细管柱：柱长 30 m，内径 0.25 mm，膜厚 0.25 μm；固定相为 5% 苯基-95% 甲基聚硅氧烷（DB-5 或等效柱），载气为氢气或氦气，恒流 0.5 mL min-1。使用高纯度“惰性”固定相和氢气载气时色谱效果更佳，但普通类型固定相和氦气条件下也可接受。检测器温度设为 300 °C；空气流速 400 mL min-1，氮气和氢气补充气流速均为 30 mL min-1。进样口和柱温箱参数如下：1 μL 分流进样（分流比 30:1），GC 进样口温度设为 250 °C；初始柱温 120 °C，保持 1 min；以 10 °C min-1 升温至 250 °C，保持 2.5 min；再以 20 °C min-1 升至 270 °C，保持 2 min；再以 20 °C min-1 升至 290 °C，保持 5 min。调节载气流速，使肌醇、氨基葡萄糖和胞壁酸衍生物在 250 °C 时洗脱，N-甲基氨基葡萄糖在 270 °C 时洗脱。</li>
</ol>
5. 衍生品验证
<ol>
	<li>采用软电离液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱法（LC-ESI-TOF-MS）鉴定分子离子，并测定衍生物的分子量。</li>
	<li>采用气相色谱-电子轰击电离-质谱-选择离子监测法（GC-EI-MS-SIM）或气相色谱-电子轰击电离-串联质谱法（GC-EI-MSMS），通过提高灵敏度来研究目标衍生物的特定离子。</li>
	<li>使用多种同位素标记试剂制备衍生物，然后利用这些同位素标记衍生物在质谱中的质量位移来研究分子离子及离子碎片。</li>
</ol>
6. 代表性结果
该方法的实验流程主要包括四个步骤：酸消化、样品纯化、衍生化和气相色谱测定（图1）。图2展示了来自标准品储备液和土壤样品中葡萄糖胺与胞壁酸分析的一个示例。除葡萄糖胺和胞壁酸外，甘露糖胺和半乳糖胺（葡萄糖胺的两种异构体）也可通过该方法同时测定。基于各标准品相对于内标肌醇的响应因子，可对土壤样品中的这些生物标志物进行定量。回收率标准品已被用于定性监测衍生化过程。葡萄糖胺和胞壁酸形成醛糖腈乙酸酯衍生化产物的反应路线如图3所示。
通过气相色谱-电子轰击电离质谱-选择离子监测（GC-EIMS-SIM）以提高灵敏度，或采用软电离液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS8）确定了衍生物的拟议结构；通过比较采用不同同位素标记试剂制备的样品所产生的离子谱图，研究了电子轰击电离条件下形成的离子碎片的拟议结构11。图4展示了在三种不同情况下制备的氨基葡萄糖腈乙酸酯衍生物的主要离子（m/z 187）的质量位移，这三种情况分别为：使用非标记试剂、D-乙酸酐以及U-13C-氨基葡萄糖制备的样品。其他详细信息和解释可参考我们近期的出版物8, 11。该策略可作为研究衍生化化学反应的模型。
<img alt="测量流程图，提取过程；GC方法，衍生化，纯化步骤。" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 土壤样品中氨基葡萄糖和胞壁酸分析方法的测量流程图。该方法主要包括4个步骤：酸消解、纯化、衍生化和气相色谱测定。
<img alt="分析化合物的色谱图；标准品与土壤样品的响应因子计算。" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 肌醇、葡萄糖胺、胞壁酸、甘露糖胺、半乳糖胺和甲基葡萄糖胺的醛糖腈乙酸酯的标准品及土壤样品的气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）色谱图。
<img alt="化学反应机理；结构式；有机合成；多步转化图示。" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 葡糖胺和胞壁酸衍生化为醛糖腈乙酸酯的反应路线图。数字1代表腈化反应，数字2代表乙酰化反应。
<img alt="质谱图谱；片段分析；含结构式和分子峰的示意图。" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 在 EI 模式下制备的与主要离子结构相关的脱氧糖腈乙酸酯衍生化葡萄糖胺的质谱图，样品分别使用 (A) 非标记试剂、(B) D-乙酸酐、(C) U-13C-葡萄糖胺处理。星号表示重同位素原子或同位素基团。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg">点击此处</a>查看该图的放大版本。

<ol><li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+and+Fertility+of+Soils%22%5BJournal%5D)">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li>
<li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+studying+soil+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li>
<li>Joergensen, R. G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity%2C+biomass%2C+and+diversity+in+agricultural+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Nutrition+and+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li>
<li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Science+Society+of+America+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li>
<li>Amelung, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmelung%2C+W+%22Assessment+Methods+for+Soil+Carbon%22">Assessment Methods for Soil Carbon</a>. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).</li>
<li>Guerrant, G. O., Moss, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+monosaccharides+as+aldononitrile%2C+O-methyloxime%2C+alditol%2C+and+cyclitol+acetate+derivatives+by+gas-chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography.</a> Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).</li>
<li>Zhang, X., Amelung, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+determination+of+muramic+acid%2C+glucosamine%2C+mannosamine%2C+and+galactosamine+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils.</a> Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).</li>
<li>Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+molecular+ion+structure+for+aldononitrile+acetate+derivatized+muramic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid.</a> Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).</li>
<li>He, H., Xie, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GC%2FMS+technique+to+assess+15N+and+13C+incorporation+into+soil+amino+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars.</a> Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).</li>
<li>Glaser, B., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound-specific+delta+13C+analysis+of+individual+amino+sugars+-+a+tool+to+quantify+timing+and+amount+of+soil+microbial+residue+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).</li>
<li>Liang, C., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li>
<li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文介绍的基于气相色谱（GC）的方法用于分析经醛糖腈乙酸酯衍生化的葡萄糖胺和胞壁酸，为定量检测从土壤中提取的这些氨基糖提供了一种相对快速的手段。衍生化产物化学性质稳定，可在一次分析中同时测定。该方法不仅限于土壤样品，也可简化后适用于非土壤基质的样品。
本方法所使用的真空泵具有耐酸设计。我们进一步建议在蒸发6M HCl溶液时设置碱性捕集装置，以保护真空泵。在衍生化步骤中，必须严格保持无水条件，包括试剂和玻璃器皿均需无水。操作应迅速进行，不得延误。玻璃器皿必须彻底清洁，可通过在550°C下灼烧或用溶剂冲洗实现。处理酸类物质以及蒸发过程中产生的强酸蒸气时，应采取适当的安全防护措施。氨基糖苷类抗生素是由土壤微生物产生的一类抗生素，已被确认可能造成干扰，因其在DB-5色谱柱上会与葡萄糖胺或胞壁酸共洗脱12，因此若以GC-FID作为定量这些氨基糖的主要方法，建议使用具有不同固定相化学性质的第二根色谱柱。我们建议在GC洗脱后采用确证型检测器用于后续分析。对于复杂基质中痕量生物标志物的明确鉴定，建议使用高精密度仪器，例如配备多反应监测模式的GC-MS/MS；在存在干扰物的情...

<table><tbody><tr><td>胞壁酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2503-25MG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1514-100G</td><td></td></tr><tr><td>N-甲基-D-葡萄糖胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004-500G</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A307003G025</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（无水）</td><td>Acros Organics</td><td>AC326950010</td><td></td></tr><tr><td>4-二甲氨基吡啶</td><td>Acros Organics</td><td>AC148270050</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>VWR international</td><td>BJGC100-4</td><td></td></tr><tr><td>盐酸羟胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>H330-100</td><td></td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Fisher Scientific</td><td>P368-500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10-100</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷（亚甲基氯）</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-500</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（6 M）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S456-4</td><td></td></tr><tr><td>盐酸羟胺&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt;N</td><td>Icon services</td><td>IN5280</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;H (D&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros Organics</td><td>AC174670050</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖-U&lt;sup&gt;-13&lt;/sup&gt;C</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt;N </td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-713-1</td><td></td></tr><tr><td>Rapid-Vap</td><td>Labconco Corp.</td><td>790002</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>KNF Neuberger</td><td>D-79112</td><td></td></tr><tr><td>水解烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 423A</td><td></td></tr><tr><td>衍生化微量小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-100E</td><td></td></tr><tr><td>GC</td><td>Hewlett-Packard</td><td>6890</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5972</td><td></td></tr><tr><td>LC-ESI-TOF-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>配备 Agilent LC/MSD-TOF 的 Agilent 1200 系列高效液相色谱系统</td><td></td></tr></tbody></table>

基于气相色谱法检测经醛糖腈乙酸酯衍生化的葡萄糖胺和胞壁酸以测定土壤中微生物残体

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

对微生物进行表征的定量方法对于更全面地理解生态系统中微生物的状态和功能至关重要。目前的微生物分析策略包括传统的依赖实验室培养的技术，以及基于直接提取和测定某些生物标志物的方法1, 2。生活在土壤中的微生物种类繁多，但其中仅有少数能够被培养，因此依赖培养的方法会引入显著偏差，而生物标志物分析则不存在这一局限性。
葡萄糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺和胞壁酸已被广泛用作衡量活体和死亡微生物生物量的指标，其中葡萄糖胺（含量最丰富）和胞壁酸（仅来源于细菌细胞）是土壤系统中最重要的组分3, 4。然而，由于对分析方法的知识缺乏，限制了其在科学界同行中的广泛应用。在所有现有的分析方法中，衍生化为醛糖腈乙酸酯后结合气相色谱（GC）分析，已成为一种较优的选择，因其在精密度、灵敏度、操作简便性、良好的色谱分离效果以及样品储存稳定性之间实现了最佳平衡5。
本文介绍了一种可靠且相对简单的土壤中氨基葡萄糖和胞壁酸经转化为醛糖腈乙酸酯后的分析详细方案。该方案主要包括四个步骤：酸水解、样品纯化、衍生化和气相色谱测定。逐步操作流程根据先前发表的研究进行了优化6, 7。此外，我们提出了一种策略，用于在电子轰击电离条件下对衍生化产物的分子离子及其裂解离子片段进行结构验证。我们采用气相色谱-电子轰击电离-质谱-选择离子监测（GC-EI-MS-SIM）、液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS）以及同位素标记试剂，测定氨基葡萄糖和胞壁酸衍生化为醛糖腈乙酸酯后的分子量；并通过同位素标记衍生物在离子谱图中的质量位移，研究各衍生物的离子碎片特征8。除理论解析外，对衍生化产物分子离子及其离子碎片的验证，将有助于在生物地球化学研究中使用δ13C或这些生物标志物离子碎片的研究人员9, 10。

我们描述了一种基于气相色谱（GC）分析从土壤中提取的葡萄糖胺和胞壁酸的醛糖腈乙酸酯衍生物的方法流程。为了阐明其化学反应机制，我们还提出了一种策略，用于确认该衍生物的结构及其在电子轰击电离过程中产生的离子碎片。

对微生物进行定量表征的方法对于深入理解生态系统中微生物的状态与功能至关重要。

本视频的总体目标是提供一种基于气相色谱（GC）分析土壤中提取的氨基葡萄糖和粘酸的 Aldon 腈乙酸酯衍生物的详细方法。该过程始于酸消解，通过降解有机聚合物释放出氨基葡萄糖和粘酸。随后，从混合溶液中分离并纯化单体氨基糖。随后进行衍生化反应，将这些氨基糖转化为适用于气相色谱分析的挥发性醛糖腈乙酸酯。该实验流程的最后步骤是液-液萃取及气相色谱测定。最终可获得结果，显示氨基糖的醛糖腈乙酸酯在肌醇与丙酮醇以及甲基谷氨酰胺标准品之间实现基线分离，通过火焰离子化检测器进行气相色谱分析即可检测到。该技术相较于其他方法的主要优势在于，它在精确度、灵敏度、操作简便性、良好的色谱分离效果以及样品储存稳定性之间实现了最佳平衡。该方法有助于回答全球碳循环领域中的一些关键问题，例如SSE微生物对稳定态土壤碳库的贡献。尽管该方法可为研究微生物残体在土壤中的累积提供深入见解和信息，但它也可应用于其他体系，如海洋系统、生物组织甚至地外样品。开始本实验方案时，先将野外采集的土壤样品进行冷冻干燥，然后使用球磨机或研钵与研杵将土壤样品研磨并均质化。将研磨后的土壤样品称重后放入25毫升水解瓶中。向每个水解瓶中加入10毫升6摩尔盐酸，通入氮气后严密封盖。在培养箱中于105摄氏度水解八小时。使用自动定时开关，将烧瓶从培养箱中取出并冷却至室温。向每个烧瓶中加入100微升内标物肌-乙酰丙酮。通过轻轻旋转混合，设置塑料漏斗，使其流入200毫升梨形烧瓶中。使用标准磨口24/40接头，并置于塑料杯上以保持稳定。将沃特曼二号定性滤纸圆片对折成四分之一，放入漏斗中。轻轻旋动每个水解烧瓶，将浆液倒入漏斗。过滤每个样品后，使用旋转蒸发仪在约45°C下减压干燥滤液。将每对锥形瓶中的干燥残渣用三至五毫升水悬浮，并转移至40毫升聚四氟乙烯（Teflon）管中。用另一份等量的水冲洗每个锥形瓶。使用1摩尔氢氧化钾溶液将样品pH调节至6.6至6.8，以沉淀金属离子及其他有机分子。随后，在离心机中以2000 × g离心10分钟，去除沉淀物。将上清液倒入40毫升玻璃管中，用对二甲苯覆盖管口以冻结上清液，然后在对二甲苯上戳孔。冻干已冻结的上清液以去除所有液体。上清液完全干燥后，用3毫升干燥甲醇溶解残留物。充分涡旋混匀后盖上管盖，然后在2000 × g 条件下离心10分钟。为沉淀盐分，将上清液转移至3毫升锥形反应小瓶中，在45 °C下使用快速减压浓缩仪（VA machine）或在温和的干燥氮气流中蒸发至干燥。蒸发完成后，向每支小瓶中加入100 µL回收内标和甲基谷氨酰胺，以及1毫升水。然后在开始衍生化之前将样品冷冻。按照书面实验方案所述配制标准品，随后将样品和标准品均进行冷冻干燥。配制衍生化试剂，其中包含32毫克/毫升的盐酸羟胺和40毫克/毫升的其他成分。嘌呤甲醇中含四种二甲基氨基嘌呤。向每个反应小瓶中加入300 µL衍生化试剂，盖紧瓶盖后充分涡旋混匀。将密封的小瓶置于75至80°C的水浴中反应35分钟。将小瓶从水浴中取出，冷却至室温。然后向每个三毫升反应小瓶中加入一毫升乙酸酐，盖紧瓶盖并充分涡旋混匀。随后在75至80摄氏度的水浴中再次孵育25分钟。从水浴中取出小瓶，冷却至室温。开始分离与测量时，向每支试管中加入1.5毫升二氯甲烷，然后涡旋振荡。向每支小瓶中加入1毫升1摩尔盐酸并充分涡旋后，静置溶液，直至两相完全分离。吸弃上层水相。使用1000微升移液器，以相同方式提取有机相，共三次，最后一次用1毫升水洗涤。务必确保完全去除所有上层水相。将最终溶液在45摄氏度下使用快速氮吹仪或氮气流干燥，每份样品溶解于300微升乙酸乙酯-己烷中，转移至含小体积插入管的2毫升棕色螺口小瓶中，盖紧瓶盖，用于后续气相色谱分析。采用火焰离子化检测器及熔融石英非极性毛细管柱（如DB-5）进行定量分析，具体操作按书面实验方案进行。在标准运行与分析后，调节载气流速，使乙酰丙醇氨基葡萄糖和穆氨酸衍生物在250摄氏度时洗脱，末端甲基谷氨酰胺在270摄氏度时洗脱。在气相色谱运行后，使用自动进样器进行一微升30比1的分流进样，气相色谱进样口温度设为250摄氏度。作为本实验流程的最后一步，采用书面方案中所述的色谱法和质谱法进行衍生物验证。此处展示了标准品及土壤样品中葡萄糖胺和尿酸的分析示例；此外，基于所用标准品的准确量以及每种内标物的响应因子，该方法还可同时测定葡萄糖胺的两种异构体——葡萄糖胺和半乳糖胺。可以测定土壤样品中这些生物标志物的含量。同时，回收标准也被用于定性监测衍生化过程。此处展示了醛糖腈乙酸酯、葡萄糖胺衍生物和粘酸的形成方案。编号一代表腈化反应，编号二代表乙酰化反应。通过比较采用不同同位素标记制备的样品的离子质谱，研究了电子轰击电离后形成的离子碎片的推定结构。此处展示了葡萄糖胺醛糖腈乙酸酯衍生物的主要离子在不同情况下的质荷比位移。在此示例中，使用了未标记的试剂以及同位素标记的乙酸酐和同位素标记的氨基葡萄糖进行制备。化学结构上的星号代表重同位素原子或同位素基团。在进行该操作时，重要的是要记住在衍生化过程中必须严格保持无水条件。此阶段所使用的有机溶剂和玻璃器皿均需干燥。尽管许多供应商提供无水溶剂，但实验室现有的溶剂也可通过装有干燥试剂（如硫酸镁）的层析柱进行干燥处理。完成此步骤后，可进一步采用其他方法，例如同位素比值质谱法，以回答更多科学问题，例如巨噬细胞的反应机制、碳或氮在土壤中的周转与积累过程，以及通过区分发育后存活与死亡的巨噬细胞来深入研究其生物学行为。该技术为宏观生态学及土壤生物学、化学领域的研究人员探索大型生物对自然或人工陆地系统中土壤有机质形成与固存的贡献奠定了基础。

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

衍生Aldononitrile乙酸氨基葡萄糖和胞壁酸的微生物在土壤中残留量的测定气相色谱的检测

13C-同位素标记是一种用于确定多种微生物细胞中心代谢的有效技术。在使用特定标记底物培养细胞后，通过GC-MS检测可基于蛋白质源性氨基酸中的独特标记模式，揭示功能性的代谢通路。...

通过13C标记的蛋白质源性氨基酸进行代谢通路的验证与发现

一种全细胞生物报告基因检测方法 Burkholderia sartisoli RP037-mChe 被开发用于检测有机污染物的微量成分（即，...

一种利用全细胞生物传感器评估非饱和水系统中有机污染物迁移与生物可利用性的方法

本文介绍了一种比色法，用于检测细菌芽孢萌发过程中还原糖的存在。...

检测细菌芽孢萌发过程中的皮层碎片

本方案描述了一种用于定量且全面研究多种营养物质代谢的实验方法。该工作流程结合了同位素示踪实验与分析程序，可确定被消耗营养物质的去向以及微生物合成分子的代谢来源。...

基于同位素示踪实验组合的工作流程以研究微生物对多种营养源的代谢

我们阐述了筛选和鉴定产生物表面活性剂微生物的方法，以及对生物表面活性剂进行色谱表征和化学鉴定的方法，并评估该生物表面活性剂的工业应用潜力。 在提高剩余油采收率方面的应用也一并介绍。...

利用生物表面活性剂组合进行提高采油率

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter...

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

本方案描述了从生物基质中提取非蛋白质氨基酸的方法 通过 三氯乙酸（TCA）蛋白沉淀及酸水解后，采用液相色谱-串联质谱法进行分析。...

从蓝细菌中提取非蛋白氨基酸用于液相色谱-串联质谱分析

本文介绍了一种适用于测定动物源性药材中三甲胺（TMA）的顶空气相色谱-串联三重四极杆质谱法（HS-GC-MS/MS）。该方案包括样品前处理、顶空处理、分析条件、方法学验证以及动物源性药材中三甲胺的测定。...

一种利用顶空气相色谱-串联四极杆质谱法检测动物源性药材中三甲胺的改进技术

本方案介绍了一种完全自动化的流程，用于从水体和富含脂质的鱼类组织中提取土臭素和2-甲基异茨醇。该方法可在这些化合物达到气味阈值之前实现早期检测。文中提供了来自水产养殖环境的代表性数据。...

利用高容量吸附萃取探针和气相色谱-质谱法对水和鱼类中的土臭素与2-甲基异茨醇进行提取与检测

建立了一种从小胶质细胞中制备纯化线粒体、分离线粒体蛋白以释放N-聚糖，并利用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离联用高分辨准确质量分析仪质谱技术快速检测亚细胞线粒体聚糖的实验方案。...

小胶质细胞线粒体提取用于糖链分析

了解利用气相色谱法分析土壤中氨基葡萄糖和胞壁酸的醛腈乙酸酯衍生物的详细方法。本方案涵盖酸水解、分离纯化、衍生化及GC检测等关键步骤，可实现基线分离和精确定量，为土壤微生物残体研究提供可靠技术支撑。

基于气相色谱法检测经醛糖腈乙酸酯衍生化的葡萄糖胺和胞壁酸以测定土壤中微生物残体

探索更多视频