基于气相色谱法检测经醛糖腈乙酸酯衍生化的葡萄糖胺和胞壁酸以测定土壤中微生物残体

本视频的总体目标是提供一种基于气相色谱（GC）分析土壤中提取的氨基葡萄糖和粘酸的 Aldon 腈乙酸酯衍生物的详细方法。该过程始于酸消解，通过降解有机聚合物释放出氨基葡萄糖和粘酸。随后，从混合溶液中分离并纯化单体氨基糖。

随后进行衍生化反应，将这些氨基糖转化为适用于气相色谱分析的挥发性醛糖腈乙酸酯。该实验流程的最后步骤是液-液萃取及气相色谱测定。最终可获得结果，显示氨基糖的醛糖腈乙酸酯在肌醇与丙酮醇以及甲基谷氨酰胺标准品之间实现基线分离，通过火焰离子化检测器进行气相色谱分析即可检测到。

该技术相较于其他方法的主要优势在于，它在精确度、灵敏度、操作简便性、良好的色谱分离效果以及样品储存稳定性之间实现了最佳平衡。该方法有助于回答全球碳循环领域中的一些关键问题，例如SSE微生物对稳定态土壤碳库的贡献。尽管该方法可为研究微生物残体在土壤中的累积提供深入见解和信息，但它也可应用于其他体系，如海洋系统、生物组织甚至地外样品。

开始本实验方案时，先将野外采集的土壤样品进行冷冻干燥，然后使用球磨机或研钵与研杵将土壤样品研磨并均质化。将研磨后的土壤样品称重后放入25毫升水解瓶中。向每个水解瓶中加入10毫升6摩尔盐酸，通入氮气后严密封盖。

在培养箱中于105摄氏度水解八小时。使用自动定时开关，将烧瓶从培养箱中取出并冷却至室温。

向每个烧瓶中加入100微升内标物肌-乙酰丙酮。通过轻轻旋转混合，设置塑料漏斗，使其流入200毫升梨形烧瓶中。使用标准磨口24/40接头，并置于塑料杯上以保持稳定。

将沃特曼二号定性滤纸圆片对折成四分之一，放入漏斗中。轻轻旋动每个水解烧瓶，将浆液倒入漏斗。过滤每个样品后，使用旋转蒸发仪在约45°C下减压干燥滤液。

将每对锥形瓶中的干燥残渣用三至五毫升水悬浮，并转移至40毫升聚四氟乙烯（Teflon）管中。用另一份等量的水冲洗每个锥形瓶。使用1摩尔氢氧化钾溶液将样品pH调节至6.6至6.8，以沉淀金属离子及其他有机分子。随后，在离心机中以2000 × g离心10分钟，去除沉淀物。

将上清液倒入40毫升玻璃管中，用对二甲苯覆盖管口以冻结上清液，然后在对二甲苯上戳孔。冻干已冻结的上清液以去除所有液体。上清液完全干燥后，用3毫升干燥甲醇溶解残留物。

充分涡旋混匀后盖上管盖，然后在2000 × g 条件下离心10分钟。为沉淀盐分，将上清液转移至3毫升锥形反应小瓶中，在45 °C下使用快速减压浓缩仪（VA machine）或在温和的干燥氮气流中蒸发至干燥。蒸发完成后，向每支小瓶中加入100 µL回收内标和甲基谷氨酰胺，以及1毫升水。

然后在开始衍生化之前将样品冷冻。按照书面实验方案所述配制标准品，随后将样品和标准品均进行冷冻干燥。配制衍生化试剂，其中包含32毫克/毫升的盐酸羟胺和40毫克/毫升的其他成分。

嘌呤甲醇中含四种二甲基氨基嘌呤。向每个反应小瓶中加入300 µL衍生化试剂，盖紧瓶盖后充分涡旋混匀。将密封的小瓶置于75至80°C的水浴中反应35分钟。

将小瓶从水浴中取出，冷却至室温。然后向每个三毫升反应小瓶中加入一毫升乙酸酐，盖紧瓶盖并充分涡旋混匀。随后在75至80摄氏度的水浴中再次孵育25分钟。

从水浴中取出小瓶，冷却至室温。开始分离与测量时，向每支试管中加入1.5毫升二氯甲烷，然后涡旋振荡。向每支小瓶中加入1毫升1摩尔盐酸并充分涡旋后，静置溶液，直至两相完全分离。

吸弃上层水相。使用1000微升移液器，以相同方式提取有机相，共三次，最后一次用1毫升水洗涤。务必确保完全去除所有上层水相。

将最终溶液在45摄氏度下使用快速氮吹仪或氮气流干燥，每份样品溶解于300微升乙酸乙酯-己烷中，转移至含小体积插入管的2毫升棕色螺口小瓶中，盖紧瓶盖，用于后续气相色谱分析。采用火焰离子化检测器及熔融石英非极性毛细管柱（如DB-5）进行定量分析，具体操作按书面实验方案进行。在标准运行与分析后，调节载气流速，使乙酰丙醇氨基葡萄糖和穆氨酸衍生物在250摄氏度时洗脱，末端甲基谷氨酰胺在270摄氏度时洗脱。

在气相色谱运行后，使用自动进样器进行一微升30比1的分流进样，气相色谱进样口温度设为250摄氏度。作为本实验流程的最后一步，采用书面方案中所述的色谱法和质谱法进行衍生物验证。此处展示了标准品及土壤样品中葡萄糖胺和尿酸的分析示例；此外，基于所用标准品的准确量以及每种内标物的响应因子，该方法还可同时测定葡萄糖胺的两种异构体——葡萄糖胺和半乳糖胺。

可以测定土壤样品中这些生物标志物的含量。同时，回收标准也被用于定性监测衍生化过程。此处展示了醛糖腈乙酸酯、葡萄糖胺衍生物和粘酸的形成方案。

编号一代表腈化反应，编号二代表乙酰化反应。通过比较采用不同同位素标记制备的样品的离子质谱，研究了电子轰击电离后形成的离子碎片的推定结构。此处展示了葡萄糖胺醛糖腈乙酸酯衍生物的主要离子在不同情况下的质荷比位移。

在此示例中，使用了未标记的试剂以及同位素标记的乙酸酐和同位素标记的氨基葡萄糖进行制备。化学结构上的星号代表重同位素原子或同位素基团。在进行该操作时，重要的是要记住在衍生化过程中必须严格保持无水条件。

此阶段所使用的有机溶剂和玻璃器皿均需干燥。尽管许多供应商提供无水溶剂，但实验室现有的溶剂也可通过装有干燥试剂（如硫酸镁）的层析柱进行干燥处理。完成此步骤后，可进一步采用其他方法，例如同位素比值质谱法，以回答更多科学问题，例如巨噬细胞的反应机制、碳或氮在土壤中的周转与积累过程，以及通过区分发育后存活与死亡的巨噬细胞来深入研究其生物学行为。

该技术为宏观生态学及土壤生物学、化学领域的研究人员探索大型生物对自然或人工陆地系统中土壤有机质形成与固存的贡献奠定了基础。