通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

本实验的总体目标是在任何小鼠品系中稳定且简便地诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），包括那些被认为对EAE诱导具有抗性的品系。首先，用髓鞘特异性蛋白或肽抗原与完全弗氏佐剂乳化后免疫供体小鼠。10天后，分离供体小鼠的淋巴结，并在体外用相同的抗原重新刺激淋巴结细胞，培养4至5天。

随后将这些细胞过继转移至未经处理的受体小鼠体内。易感小鼠品系将在8至14天内发生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），以在抗性品系中诱导EAE。过继转移后14天，对受体小鼠用完全弗氏佐剂（CFA）中的抗原进行免疫。

采用该方法，可在具有抗性的小鼠品系中诱导EAE。通过适应性转移和攻击方案诱导EAE的主要优势在于能够实现可靠的疾病诱导，临床疾病发生率极少低于100%。

我们可以针对不同疾病诱导方法和易感小鼠品系进行方案优化，但更重要的是，本方案可用于在许多先前被认为对疾病具有抗性的小鼠品系中成功诱导EAE。今日演示操作流程的是我们的首席研究助理，cha ching。

首先配制浓度为 2 毫克/毫升的 MBP 溶液，溶剂为 PBS。使用带有螺口接头的研磨玻璃注射器，为每只待免疫小鼠吸取 100 微升抗原溶液。

使用另一个注射器，吸取等体积的完全弗氏佐剂 H 37 ra。然后通过三通旋塞将两个注射器连接，来回推动推杆，使抗原与佐剂混合，直至形成乳剂。为确认乳化完成，将溶液转移至其中一个注射器中，并断开空的注射器。

将空注射器的活塞稍微向后拉动，然后将残留混合物的一滴排入盛有室温清洁水的烧杯中。如果液滴散开，则重新连接注射器并继续混合。若液滴保持完整且已形成乳状液，则重复该测试以收集乳状液。

用于免疫。将一个1毫升的塑料注射器连接到已移除推杆的玻璃注射器上。小心地将溶液转移至塑料注射器中，直至充满至边缘。

然后插入塑料推杆，挤出部分乳剂，使剩余恰好为 1.2 毫升。注射器中不应有气泡残留。若该操作正确执行。

断开塑料注射器，安装26号针头，并推动活塞至1毫升刻度处，以填充针头的空隙体积。牢固地抓握小鼠颈部皮肤，并用无名指和小指将尾巴向后固定，以便于接触胸腹部。皮下注射。

在右侧腋窝正上方的胸部注入50微升乳剂。如果注射操作正确，注射部位会出现一个微小的白色隆起。在左侧腋窝上方重复此操作，然后松开尾巴，抓住右脚，暴露小鼠的右侧 flank（ flank 指体侧，腰胁部）。

在肋骨下方皮下注射50微升溶液。松开右后肢。将小鼠翻转方向，在左侧重复注射。

免疫后7至10天，处死动物并采集其淋巴结。首先将小鼠仰卧放置，四肢伸展，并用图钉固定在解剖板上。

用乙醇喷洒小鼠。然后使用无菌工具，从下腹部向上至下巴处沿纵向切开小鼠皮肤。

从腹部沿一条后肢向下做另一个切口，再沿另一条后肢向下做切口。将小鼠的皮肤剥离，并用大头针固定在解剖板上。

同时沿四肢切开皮肤。然后用镊子将皮肤瓣的上部在两侧固定，腹股沟和腋窝淋巴结通常位于腹股沟或腋窝附近，此时应可见为皮下直接可见的小块不透明组织。使用两把精细镊子轻轻去除第一个淋巴结上方的结缔组织。

注意操作过程中不要破坏血管。待结缔组织清除后，将一对镊子置于淋巴结下方，将其从机体分离。将淋巴结转移至含有无菌 PBS 的 35 毫米培养皿中，并以相同方法采集其余三个淋巴结。

所有淋巴结采集完毕后，将培养皿转移至生物安全柜中。使用无菌注射器活塞的尾部研磨淋巴结，使细胞充分释放，去除组织碎片，随后将悬液通过尼龙滤网过滤至锥形管中。

然后用无菌 PBS 将体积调至 50 毫升，离心细胞 10 分钟。离心后，将细胞重悬于少量预热的细胞培养基中，并计数活细胞。将细胞浓度调整为每毫升 4 × 10⁶ 个细胞。

然后将细胞以每孔2毫升的体积接种至24孔板中。向每孔加入MVP抗原，使终浓度为100微克/毫升。抗原加入后。

将细胞在37摄氏度下孵育五天。细胞重新刺激后，轻轻吹打混匀以收获细胞，并转移至50毫升锥形管中。以1000转/分钟离心10分钟，弃上清，将沉淀重悬于少量无菌PBS中。

然后计数细胞，并用 PBS 将活细胞浓度调整至每毫升 2.5 × 10⁸ 个细胞。将细胞吸入注射器中，并安装 26 号针头以进行过继转移。每只小鼠尾静脉注射 0.2 毫升细胞，以在过继转移后数周对耐药小鼠进行攻毒实验。

以与免疫供体小鼠相同的方法，将200微克抗原溶于200微升乳剂中注射至动物体内。攻击后7至10天，将出现麻痹性疾病，并可监测其进展。疾病最初表现为尾巴无力。

当尾巴无力时，疾病评分为一级。若小鼠一条后肢出现瘫痪，则评分为二级；若两条后肢均瘫痪，则评分为三级。当两条前肢均出现瘫痪时，评分为四级。

5级时，小鼠症状更为明显。6级时，小鼠死亡。如图所示，在攻毒后7至14天，小鼠将出现单相性麻痹疾病，可依据经典的EAE标准进行分级。

尽管小鼠可能会恢复，但不会出现自发性复发。疾病诱导需要特异性抗原攻击。仅使用CFA或无关抗原进行攻击均无法诱发疾病。

观看本视频后，您应充分理解用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的过继转移与抗原攻击方法。通过将抗原特异性淋巴结细胞的过继转移与增强性抗原攻击相结合，可轻松在任何小鼠品系中诱导EAE。该方法使我们能够克服某些小鼠品系固有的抗性机制，从而实现对疾病抗性机制的研究。此外。

该技术应易于适用于研究任何自身免疫性疾病过程。