Name: 在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抗性品系小鼠继转移和抗原挑战克服反应迟钝 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 了解实验性自身免疫性脑脊髓炎诱导方法，通过供体小鼠免疫、淋巴结细胞体外再刺激及过继转移，在EAE抗性小鼠品系中成功建立疾病模型。该技术为研究多发性硬化等自身免疫疾病机制提供可靠方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

部分由美国国立卫生研究院（R01 NS37253 和 N01 NS055167）和美国多发性硬化症学会（RG 3288-A6）资助。

1. 准备CFA乳化抗原
<ol>
<li>将豚鼠MBP（按照Swanborg1的方法制备，并以冻干形式在4 °C下保存）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为2 mg/mL。若使用合成的MBP多肽（MBP60-80，S H H A A R T T H Y G S L P Q K S Q R）2，则配制成2 mg/mL的溶液。将适量抗原溶液（每只待免疫小鼠0.1 mL）吸入一支带有鲁尔锁扣的玻璃注射器中。</li>
<li>在另一支带有鲁尔锁扣的玻璃注射器中，吸入与抗原溶液体积相等的完全弗氏佐剂H37Ra（0.1WT%）（CFA，Difco Laboratories）。</li>
<li>用一个三通旋塞将两支玻璃注射器连接起来。通过来回推动活塞，将MBP溶液与CFA混合。持续操作，直至形成乳剂。</li>
<li>为检测乳剂是否形成，将全部混合物推入其中一支注射器中。断开空的注射器，将活塞稍向后拉，挤出一滴残留乳剂至室温下的洁净水杯中。若乳剂滴在水面保持完整不散开，则表明乳剂已形成；若乳剂滴在水中扩散，则需重新连接注射器并继续混合操作。</li>
<li>使用1 mL塑料注射器进行免疫接种，以确保准确给予抗原剂量。为将抗原乳剂转移至塑料注射器，先拔出活塞，然后将空的塑料注射器插入三通旋塞的开口端，该位置即为步骤1.4中断开的玻璃注射器所在处。</li>
<li>通过推动玻璃注射器的活塞，将乳剂填充至塑料注射器的顶端。重新插入塑料注射器的活塞，再推动活塞排出多余乳剂，直至塑料注射器上的液面降至1.2 mL刻度处。此操作可确保塑料注射器内无气泡残留。</li>
<li>从三通旋塞上取下塑料注射器，将一支26号针头连接至塑料注射器上。推动活塞至1 mL刻度处，使乳剂充满针头的空隙体积。</li>
</ol>
2. 供体小鼠的免疫
注意：通常按照美国国立卫生研究院 McFarlin 研究组最初设计的方法3，在雌性 C57BL/6 小鼠的两侧 flank 区四个位点注射抗原乳剂。对于有经验的研究人员，可由一人独立完成全部操作；对于初学者，可寻求协助，由一人固定小鼠，另一人进行注射。或者，也可在麻醉状态下对小鼠进行注射。
<ol>
 <li>用一只手牢固地抓住小鼠颈部的皮肤，另一只手将尾巴固定在手指之间th 和 5th 手指张开，使胸腹部易于接触。</li>
 <li>将1 mL塑料注射器的针头置于小鼠右侧腋窝稍上方的胸部位置，皮下注射0.05 mL抗原乳剂。透过浅色皮肤可观察到白色CFA形成的轻微隆起。同样方法重复注射于左侧腋窝稍上方的胸部位置。</li>
 <li>松开尾巴，抓住小鼠的右脚，将其翻转并夹在第4指th和 5th 手指。在右侧肋骨下方的部位定位注射点，注入0.05 mL抗原乳剂。</li>
 <li>松开右脚，将小鼠调转方向，用左手握住小鼠的左脚th 和 5th 手指。在左侧肋缘下方的 flank 部位找到注射位点，注入 0.05 mL 抗原乳剂。</li>
 <li>每注射10只小鼠后更换新针头，或在针头变钝时及时更换。</li>
</ol>
3. 免疫后7至10天淋巴结细胞的分离用于组织培养
<ol>
 <li>免疫后7至10天，处死小鼠并取出引流淋巴结。推荐的安乐死方法为CO2吸入法。处死后，将小鼠仰卧于解剖板上，四肢伸展并用图钉固定。用70%乙醇喷雾润湿小鼠体表。</li>
 <li>使用无菌剪刀和镊子，从腹部下端沿中线向上至下颌作一纵向皮肤切口。</li>
 <li>从腹股沟区域向下沿两侧大腿切开腹部皮肤。将皮肤剥离并用图钉固定，暴露腹股沟淋巴结。</li>
 <li>沿前肢（左右两侧）切开皮肤，以便剥离并固定皮肤，暴露腋窝附近的腋下淋巴结。</li>
 <li>使用两对镊子协同操作，分离覆盖和环绕腹股沟淋巴结的结缔组织。清除结缔组织后，将一对镊子置于淋巴结下方，将其从机体分离。将分离的淋巴结放入盛有无菌PBS的35 mm培养皿中。</li>
 <li>使用两对镊子分离覆盖两个腋下淋巴结的结缔组织。分离淋巴结后将其放入培养皿中。操作时需格外小心，避免损伤穿过该区域的血管，以免出血影响淋巴结的识别。</li>
 <li>收集全部淋巴结后，将培养皿转移至生物安全柜中。用两对镊子轻轻撕碎并分散淋巴结组织，相互研磨。也可使用3 mL塑料注射器的推杆平端，在培养皿底部按压淋巴结进行破碎。</li>
 <li>将分散后的淋巴结细胞悬液通过尼龙网筛过滤，以去除膜状物和碎片。</li>
 <li>用无菌PBS将淋巴结细胞悬液补至50 mL。以1000 rpm离心10分钟。弃上清，将沉淀重悬于培养基中。进行活细胞计数，并调整细胞浓度至4 × 106 个/mL。使用含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM MEM丙酮酸钠、0.1 mM MEM非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 mM HEPES缓冲液和5 × 10-5 M 2-巯基乙醇（2-ME）的RPMI 1640培养基。重悬细胞前需预先将培养基温育至适宜温度。</li>
 <li>将细胞接种于24孔培养板中，每孔2 mL（最终细胞浓度为8 × 106 个/孔）。向每孔加入抗原，终浓度为100 μg/mL。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，培养5天。</li>
</ol>
4. 培养开始5天后收获培养的淋巴结细胞
<ol>
 <li>使用巴斯德玻璃移液管或小体积移液器，通过反复吹打混匀每个孔中的细胞。将细胞收集至50 mL离心管中。</li>
 <li>以1000 rpm离心10分钟。用少量PBS重悬细胞沉淀。</li>
 <li>计数细胞，并用无菌PBS将活细胞浓度调整至2.5 × 108 个细胞/mL。将细胞悬液吸入配有26号针头的注射器中。</li>
 <li>在受体小鼠笼子上方放置加热灯，以帮助扩张尾静脉。</li>
 <li>使用小鼠固定器，将小鼠尾巴从固定器的狭缝中拉出并伸直。牵拉以充分伸展尾巴，定位静脉。</li>
 <li>每只小鼠注射0.2 mL细胞悬液，相当于5 × 107 个细胞。</li>
</ol>
5. 细胞转移后20天对受体小鼠进行抗原攻击及疾病症状的产生
<ol>
 <li>对未表现出疾病症状的受体小鼠进行抗原攻击。操作步骤与第2节“供体小鼠免疫”中的方法相同。</li>
 <li>抗原攻击后7至10天观察瘫痪性疾病的发展情况。
 <ol><li>疾病最初表现为尾巴无力。当尾巴变得松弛时，疾病评分为1分；当小鼠一条后肢瘫痪时，评分为2分；当双侧后肢均瘫痪，且小鼠向前爬行时拖动双侧后肢，评分为3分；当小鼠双侧前肢失去功能，导致完全无法移动时，评分为4分；当小鼠处于濒死状态，身体蜷缩时，评分为5分；死亡记为6分4。</li></ol>
 </li>
 <li>按照本方案在C57BL/6小鼠中诱导的MBP特异性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）为单相型。小鼠可能从疾病中恢复，但不会发生自发性复发。</li>
</ol>
6. 典型结果
接受过预先致敏并在体外扩增的供体淋巴结细胞的小鼠未出现实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）疾病症状，表明其对疾病诱导具有抵抗性。然而，在抗原攻击后，小鼠出现了严重疾病（表 I），证明抗原攻击能够逆转这种抵抗机制。抗原攻击诱导疾病时有两个显著特征：抗原剂量以及攻击的时间动力学。如表 III所示，仅需极低剂量的抗原即可诱导疾病。令人意外的是，即使在一年前接受供体细胞的小鼠，经抗原攻击后仍可发展为严重疾病（表 IV）。这两个观察结果强烈提示“长寿”T细胞在维持EAE抵抗性中发挥了作用。本方案适用于多种EAE抵抗性小鼠品系4。
<img alt="MBP-CFA 诱导 EAE 过程示意图；从淋巴结到体外培养；细胞转移至小鼠。" src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1."> 
图 1. 在公认抵抗性小鼠品系中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验设计流程图。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td colspan="3">过继转移后 
 临床EAE</td>
 <td colspan="3">抗原攻击后 
 临床EAE</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>品系</td>
 <td>抗原 </td>
 <td>发病率</td>
 <td>平均疾病评分 
 （范围）</td>
 <td>平均发病时间 
 （范围）</td>
 <td>发病率</td>
 <td>平均疾病评分 
 （范围）</td>
 <td>平均发病时间 
 （范围）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SJL</td>
 <td>MBP</td>
 <td>21/21</td>
 <td>4.0 (3-5)</td>
 <td>8.0 (6-10)</td>
 <td>N.D.</td>
 <td>N.D.</td>
 <td>N.D.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6</td>
 <td>MBP</td>
 <td>0/10</td>
 <td>- -</td>
 <td>- -</td>
 <td>7/7</td>
 <td>3.85 (3-5)</td>
 <td>9.28 (9-10)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balb/c</td>
 <td>MBP</td>
 <td>0/7</td>
 <td>- -</td>
 <td>- -</td>
 <td>5/5</td>
 <td>3.2 (3-4)</td>
 <td>7.0 (7)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C3H/HeJ</td>
 <td>MBP</td>
 <td>0/7</td>
 <td>- -</td>
 <td>- -</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.2 (3-4)</td>
 <td>8.0 (8)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6</td>
 <td>MBP60-80</td>
 <td>0/4</td>
 <td>- -</td>
 <td>- -</td>
 <td>4/4</td>
 <td>2.75 (2-4)</td>
 <td>10.2 (9-11)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表 I。MBP介导的C57BL/6小鼠EAE诱导。将致敏并在体外扩增的供体细胞进行过继转移后，未能在C57BL/6小鼠中诱导EAE。细胞转移后进行抗原攻击，使小鼠易于被诱导发病。Av.，平均值。N.D.，未进行。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td colspan="3">抗原攻击后的临床EAE</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>初始抗原</td>
 <td>攻击抗原</td>
 <td>发病率</td>
 <td>平均疾病评分 
 （范围）</td>
 <td>平均发病时间 
 （范围）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>CFA alone</td>
 <td>0/3</td>
 <td>- -</td>
 <td>- -</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>OVA-CFA</td>
 <td>0/3</td>
 <td>- -</td>
 <td>- -</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>3/3</td>
 <td>4.0 (4.0)</td>
 <td>7.7 (7-9)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表 II. 抗原攻击的特异性。受体小鼠被给予引发抗原以及其他无关抗原进行攻击。只有引发抗原诱导出严重疾病。OVA：鸡卵清蛋白。Av.：平均值。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td colspan="3">抗原攻击后临床EAE表现</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>攻击抗原剂量（μg/小鼠）</td>
 <td>发病率</td>
 <td>平均疾病评分 
 （范围）</td>
 <td>平均发病时间 
 （天数，范围）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.75 (3-4)</td>
 <td>8.25 (7-9)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.67 (3-4)</td>
 <td>7.5 (7-8)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.25 (3-4)</td>
 <td>8.25 (7-10)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.0 (3.0)</td>
 <td>8.25 (8-9)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.0 (3.0)</td>
 <td>8.76 (8-9)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>4/4</td>
 <td>2.5 (2-3)</td>
 <td>9.75 (9-10)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>2/4</td>
 <td>1.0 (1.0)</td>
 <td>16 (14-18)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0</td>
 <td>0/4</td>
 <td>- -</td>
 <td>- -</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表 III. 诱导疾病所需的攻毒抗原剂量。测试了用于攻毒受体小鼠的不同浓度的髓鞘碱性蛋白（MBP）。Av.，平均值。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td colspan="3">抗原攻击后临床EAE</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>攻击抗原</td>
 <td>攻击日</td>
 <td>发病率</td>
 <td>平均疾病评分 
 （范围）</td>
 <td>平均发病时间 
 （范围）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>5</td>
 <td>3/4</td>
 <td>1.33 (1-2)</td>
 <td>9.67 (9-10)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>10</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.0 (3.0)</td>
 <td>8.25 (7-9)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>15</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.75 (3-4)</td>
 <td>7.25 (7-8)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>25</td>
 <td>4/4</td>
 <td>4.0 (4.0)</td>
 <td>8.0 (7-9)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>35</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.5 (3-4)</td>
 <td>7.5 (7-8)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>60</td>
 <td>4/4</td>
 <td>3.75 (3-4)</td>
 <td>9.0 (8-10)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="5">- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>343</td>
 <td>3/3</td>
 <td>3.0 (3.0)</td>
 <td>10.33 (10-11)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MBP-CFA</td>
 <td>445</td>
 <td>3/3</td>
 <td>3.0 (3.0)</td>
 <td>7.0 (7.0)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表 IV. 抗原攻击的动力学。受体小鼠在过继性细胞转移后的不同时间点进行抗原攻击。Av.，平均值。

<ol><li>Swanborg, R. H. Experimental allergic encephalomyelitis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanborg%2C+RH+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Sabato, G. D. 162, Academic Press. New York, NY. 413-421 (1988).</li>
<li>Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelin+basic+protein-specific+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice%3A+Mapping+of+T+cell+epitopes+and+T+cell+Vb+gene+segment+usage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage.</a> J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).</li>
<li>McCarron, R., McFarlin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+SJL%2FJ%2C+PL%2FJ%2C+and+%28SJL%2FJ+x+PL%2FJ%29F1+mice.+Influence+of+I-A+haplotypes+on+encephalitogenic+epitope+of+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein.</a> J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).</li>
<li>Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge+induces+consistent+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice+and+other+reputed+resistant+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains.</a> J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-specific+T+cells+also+recognize+neuronal+autoantigen+in+a+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 15, 626-632 (2009).</li>
<li>Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+plays+an+important+role+in+the+homeostatic+regulation+of+the+autoreactive+reperteroire+in+na%C3%AFve+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in naïve mice.</a> J. Immunol. 173, 828-834 (2004).</li>
<li>Anderton, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+and+T-effector+cells+in+autoimmune+CNS+inflammation%3A+a+delicate+balance+easily+disturbed%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed.</a> Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).</li>
<li>Arnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+encephalomyelitis+-+susceptibility+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression.</a> Immunol. Rev. 55, 5(1981).</li>
<li>Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+mice+by+antibodies+against+IFN-g%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g.</a> J. Immunol. 140, 1506-1510 (1988).</li>
<li>Arbomson-Leeman, S., Alexander, J., Bronson, R., Corroll, J., Southwood, S., Dorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis-resistant+mice+have+highly+encephalitogenic+myelin+basic+protein+%28MBP%29-specific+T+cell+clones+that+recognize+a+MBP+peptide+with+high+affinity+for+MHC+class+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis-resistant mice have highly encephalitogenic myelin basic protein (MBP)-specific T cell clones that recognize a MBP peptide with high affinity for MHC class II.</a> J. Immunol. 154, 388-398 (1995).</li>
<li>Reddy, J., Illes, Z., Zhang, X., Encinas, J., Nicholson, L., Sobel, R. A., Wucherpfennig, K. W., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+proteolipid+protein-specific+CD4%2BCD25%2B+regulatory+cells+mediate+genetic+resistance+to+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Myelin proteolipid protein-specific CD4+CD25+ regulatory cells mediate genetic resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15434-15439 (2004).</li>
<li>Korn, T., Reddy, J., Gao, W., Bettelli, E., Awasthi, A., Petersen, T. R., Backstrom, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-+specific+regulatory+T+cells+accumulate+in+the+CNS+but+fail+to+control+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Myelin- specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation.</a> Nature Med. 13, 423-431 (2007).</li>
<li>Shaw, M. K., Li, J., Ho, P. P., Hao, H., Lisak, R. P., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific adoptive experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Longevity of donor T cells and lack of disease relapses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+MK+%22Neuroimmunology+Research+Focus%22">Neuroimmunology Research Focus</a>. Broglie, P. V. , Nova Science Publisher. New York. 175-191 (2007).</li>
</ol>

无财务披露。

在小鼠中进行EAE研究时，通常使用神经抗原髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白（PLP）或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。早期的研究主要使用MBP。PLP可在SJL小鼠中诱导强烈且一致的免疫反应。近年来，MOG成为常用的神经抗原，因为B6小鼠对该抗原易感，可成功诱导疾病。许多基因靶向小鼠品系均建立在B6遗传背景上。有趣的是，B6小鼠对MOG诱导的EAE易感，但对MBP诱导的疾病具有抗性。
以往关于阐明实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）机制的研究，主要集中于疾病诱导机制、细胞因子产生效应以及调节性T细胞介导的恢复过程5-7。然而，为何某些公认的EAE抵抗型小鼠能够阻断疾病诱导，这一问题尚未得到广泛研究。这可能是因为难以量化“无应答”状态所致。Arnon8于1981年首次发现，用环磷酰胺处理B6小鼠后，这些小鼠会对髓鞘碱性蛋白（MBP）诱导的EAE产生易感性。其他研究也表明，使用抗γ干扰素处理同样可成功诱导B6和Balb/c小鼠发病9,10。需要注意的是，这些研究均针对非抗原特异性的标志物。相比之下，本文所述方案聚焦于...

<table><tbody><tr><td>豚鼠脊髓</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland Immunochemicals</a></td><td>GP-T065</td><td> 冷冻的</td></tr><tr><td>弗伦德&amp;rsquo;佐剂，完全H37Ra </td><td>Difco 实验室</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>多功能可互换注射器 </td><td><a href="http://www.bd.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD 生物科学</a></td><td>512133</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td><a href="http://www.cellgro.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mediatech, Inc.</a></td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>B6 小鼠：0000664</td><td>缅因州巴港</td></tr></tbody></table>

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae）抵抗性小鼠品系的无应答状态

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种中枢神经系统（CNS）的炎性疾病，已被用作研究人类脱髓鞘疾病多发性硬化症（MS）的动物模型。EAE的特征是单核细胞病理性浸润中枢神经系统，并出现瘫痪性疾病的临床表现。与MS相似，EAE也受到遗传控制，即某些小鼠品系易感该疾病，而其他品系则具有抗性。通常情况下，用髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫的C57BL/6（H-2b）小鼠不会出现瘫痪症状。这种无反应性显然并非由于MBP抗原加工或抗原呈递缺陷所致，因为本文所描述的一种实验方案已成功用于在C57BL/6小鼠以及其他公认具有抗性的小鼠品系中诱导出严重的EAE。此外，已成功分离并扩增了来自C57BL/6和Balb/c小鼠、对MBP有反应的致脑炎性T细胞克隆。
实验方案涉及使用一种细胞过继转移系统，其中将MBP致敏的（200 μg/小鼠）C57BL/6供体淋巴结细胞分离，并在抗原存在下培养五天，以扩增MBP特异性T细胞群体。培养结束后，通过尾静脉将5000万个活细胞转移至未经处理的同系受体小鼠体内。经此处理的受体小鼠通常不会发生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），从而再次证实其抵抗表型，且可长期保持正常状态。细胞转移后第10天，受体小鼠在两侧 flank 区域的四个位点接受完全弗氏佐剂（CFA）乳化的MBP攻击。这些小鼠在攻击后10至14天开始出现严重的EAE症状。结果显示，疾病诱导具有抗原特异性，因为使用无关抗原进行攻击不会引发疾病的临床体征。值得注意的是，通过对抗原攻击剂量进行滴定实验表明，低至5 μg/小鼠的剂量仍可诱导疾病。此外，对抗原攻击时间点的动力学研究表明，早在细胞转移后5天或长达445天以上进行抗原攻击，均能有效诱导疾病。这些数据强烈提示存在一个“长寿”的T细胞群体参与维持免疫无应答状态。然而，该系统中调节性T细胞（Tregs）的作用尚未明确。

某些小鼠品系能够抵抗以髓鞘碱性蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。本文介绍了一种简单的免疫接种方案，可逆转这些小鼠品系的无反应状态，并在多种典型的EAE抗性小鼠品系中诱导出麻痹性疾病。

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种中枢神经系统（CNS）的炎性疾病，已被用作……的动物模型。

本实验的总体目标是在任何小鼠品系中稳定且简便地诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），包括那些被认为对EAE诱导具有抗性的品系。首先，用髓鞘特异性蛋白或肽抗原与完全弗氏佐剂乳化后免疫供体小鼠。10天后，分离供体小鼠的淋巴结，并在体外用相同的抗原重新刺激淋巴结细胞，培养4至5天。随后将这些细胞过继转移至未经处理的受体小鼠体内。易感小鼠品系将在8至14天内发生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），以在抗性品系中诱导EAE。过继转移后14天，对受体小鼠用完全弗氏佐剂（CFA）中的抗原进行免疫。采用该方法，可在具有抗性的小鼠品系中诱导EAE。通过适应性转移和攻击方案诱导EAE的主要优势在于能够实现可靠的疾病诱导，临床疾病发生率极少低于100%。我们可以针对不同疾病诱导方法和易感小鼠品系进行方案优化，但更重要的是，本方案可用于在许多先前被认为对疾病具有抗性的小鼠品系中成功诱导EAE。今日演示操作流程的是我们的首席研究助理，cha ching。首先配制浓度为 2 毫克/毫升的 MBP 溶液，溶剂为 PBS。使用带有螺口接头的研磨玻璃注射器，为每只待免疫小鼠吸取 100 微升抗原溶液。使用另一个注射器，吸取等体积的完全弗氏佐剂 H 37 ra。然后通过三通旋塞将两个注射器连接，来回推动推杆，使抗原与佐剂混合，直至形成乳剂。为确认乳化完成，将溶液转移至其中一个注射器中，并断开空的注射器。将空注射器的活塞稍微向后拉动，然后将残留混合物的一滴排入盛有室温清洁水的烧杯中。如果液滴散开，则重新连接注射器并继续混合。若液滴保持完整且已形成乳状液，则重复该测试以收集乳状液。用于免疫。将一个1毫升的塑料注射器连接到已移除推杆的玻璃注射器上。小心地将溶液转移至塑料注射器中，直至充满至边缘。然后插入塑料推杆，挤出部分乳剂，使剩余恰好为 1.2 毫升。注射器中不应有气泡残留。若该操作正确执行。断开塑料注射器，安装26号针头，并推动活塞至1毫升刻度处，以填充针头的空隙体积。牢固地抓握小鼠颈部皮肤，并用无名指和小指将尾巴向后固定，以便于接触胸腹部。皮下注射。在右侧腋窝正上方的胸部注入50微升乳剂。如果注射操作正确，注射部位会出现一个微小的白色隆起。在左侧腋窝上方重复此操作，然后松开尾巴，抓住右脚，暴露小鼠的右侧 flank（ flank 指体侧，腰胁部）。在肋骨下方皮下注射50微升溶液。松开右后肢。将小鼠翻转方向，在左侧重复注射。免疫后7至10天，处死动物并采集其淋巴结。首先将小鼠仰卧放置，四肢伸展，并用图钉固定在解剖板上。用乙醇喷洒小鼠。然后使用无菌工具，从下腹部向上至下巴处沿纵向切开小鼠皮肤。从腹部沿一条后肢向下做另一个切口，再沿另一条后肢向下做切口。将小鼠的皮肤剥离，并用大头针固定在解剖板上。同时沿四肢切开皮肤。然后用镊子将皮肤瓣的上部在两侧固定，腹股沟和腋窝淋巴结通常位于腹股沟或腋窝附近，此时应可见为皮下直接可见的小块不透明组织。使用两把精细镊子轻轻去除第一个淋巴结上方的结缔组织。注意操作过程中不要破坏血管。待结缔组织清除后，将一对镊子置于淋巴结下方，将其从机体分离。将淋巴结转移至含有无菌 PBS 的 35 毫米培养皿中，并以相同方法采集其余三个淋巴结。所有淋巴结采集完毕后，将培养皿转移至生物安全柜中。使用无菌注射器活塞的尾部研磨淋巴结，使细胞充分释放，去除组织碎片，随后将悬液通过尼龙滤网过滤至锥形管中。然后用无菌 PBS 将体积调至 50 毫升，离心细胞 10 分钟。离心后，将细胞重悬于少量预热的细胞培养基中，并计数活细胞。将细胞浓度调整为每毫升 4 × 10⁶ 个细胞。然后将细胞以每孔2毫升的体积接种至24孔板中。向每孔加入MVP抗原，使终浓度为100微克/毫升。抗原加入后。将细胞在37摄氏度下孵育五天。细胞重新刺激后，轻轻吹打混匀以收获细胞，并转移至50毫升锥形管中。以1000转/分钟离心10分钟，弃上清，将沉淀重悬于少量无菌PBS中。然后计数细胞，并用 PBS 将活细胞浓度调整至每毫升 2.5 × 10⁸ 个细胞。将细胞吸入注射器中，并安装 26 号针头以进行过继转移。每只小鼠尾静脉注射 0.2 毫升细胞，以在过继转移后数周对耐药小鼠进行攻毒实验。以与免疫供体小鼠相同的方法，将200微克抗原溶于200微升乳剂中注射至动物体内。攻击后7至10天，将出现麻痹性疾病，并可监测其进展。疾病最初表现为尾巴无力。当尾巴无力时，疾病评分为一级。若小鼠一条后肢出现瘫痪，则评分为二级；若两条后肢均瘫痪，则评分为三级。当两条前肢均出现瘫痪时，评分为四级。5级时，小鼠症状更为明显。6级时，小鼠死亡。如图所示，在攻毒后7至14天，小鼠将出现单相性麻痹疾病，可依据经典的EAE标准进行分级。尽管小鼠可能会恢复，但不会出现自发性复发。疾病诱导需要特异性抗原攻击。仅使用CFA或无关抗原进行攻击均无法诱发疾病。观看本视频后，您应充分理解用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的过继转移与抗原攻击方法。通过将抗原特异性淋巴结细胞的过继转移与增强性抗原攻击相结合，可轻松在任何小鼠品系中诱导EAE。该方法使我们能够克服某些小鼠品系固有的抗性机制，从而实现对疾病抗性机制的研究。此外。该技术应易于适用于研究任何自身免疫性疾病过程。

overcoming-unresponsiveness-experimental-autoimmune-encephalomyelitis

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抗性品系小鼠继转移和抗原挑战克服反应迟钝

本视频展示了一种高效的均质化技术，用于制备抗原-佐剂乳剂，以在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。该乳剂的水相中含有自身抗原——髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），周围由包含灭活病原菌的连续油相包裹。该乳剂可实现抗原的持续释放，从而引发持久的免疫反应。...

制备抗原-佐剂乳剂以诱导自身免疫性脑脊髓炎

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种成熟动物模型。通过用髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫C57BL/6小鼠，可诱导中枢神经系统中自身反应性免疫细胞引发的上行性弛缓性瘫痪。本文将讨论疾病诱导与监测的相关方案。...

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。...

一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

了解实验性自身免疫性脑脊髓炎诱导方法，通过供体小鼠免疫、淋巴结细胞体外再刺激及过继转移，在EAE抗性小鼠品系中成功建立疾病模型。该技术为研究多发性硬化等自身免疫疾病机制提供可靠方案。

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

探索更多视频