Name: 推导人类纤维原细胞的皮肤穿刺活检植文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学习从人类皮肤穿刺活检中分离培养纤维原细胞的标准方法，使用明胶包被培养板和DMEM培养基。该技术可在4至8周内获得1500至2000万个低代次细胞，适用于皮肤生物学和再生医学研究。

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本方案的开发由加州再生医学研究所（CIRM，TR1-01246）和帕金森联盟资助。

采用标准操作程序获取的皮肤钻孔活检样本3 (例如 使用4毫米圆形Visipunch器械获取的组织样本应置于含20%胎牛血清的完全DMEM培养基中并置于冰上保存。样本送达实验室后，应尽快处理活检组织。
1. 皮肤钻孔活检的制备
步骤 1.1–1.3 需在生物安全柜内进行
<ol>
 <li>预先准备：在6孔板的每孔中加入1 ml 0.1% 明胶。静置30–60分钟。吸除明胶溶液，并在每孔中加入800 μl含20% FBS的完全DMEM培养基。确保培养基完全覆盖孔内表面。</li>
 <li>将无菌10 cm组织培养皿的皿盖倒置，在其中央加入1.5 ml含20% FBS的DMEM培养基，并用血清移液管尖端将液滴均匀铺开。</li>
 <li>使用无菌镊子，将皮肤活检组织置于培养皿中的培养基内。</li>
</ol>
2. 皮肤穿刺活检的解剖
步骤 9 2.1-2.2 需在水平层流洁净台内进行
<ol>
 <li>将10 cm培养皿的底部置于倒置的皿盖上，并将皮肤活检组织转移至超净台内的解剖显微镜下。</li>
 <li>使用一把手术刀固定活检组织，另一把手术刀沿单一方向以滚动动作将其切割成大小均匀的12–15块，每块呈约4 mm圆形，边缘整齐。边缘不规则的组织块会影响贴壁效果和细胞爬出。</li>
</ol>
3. 将解剖后的皮肤活检组织转移至组织培养板
步骤 3.1-3.6 必须在生物安全柜内进行
<ol>
 <li>将10 cm组织培养皿的底部置于倒置的皿盖上方，并将培养皿转移回生物安全柜中。</li>
 <li>使用尖头镊子将2-3块活检组织放入已准备好的6孔板的每个孔中，每孔含800 μl培养基，切勿放入干燥的孔中。可通过轻敲或滑动的方式使组织块贴附于孔底。使用手术刀有助于将组织块从镊子上取下。</li>
 <li>将6孔板放入37 °C培养箱中。在第一周内每天观察，确保每个孔底部均有培养基形成的液膜；每2天补充约200 μl培养基，以补充蒸发损失的液体。</li>
 <li>一周后，将每孔培养基量增加至2 ml完全DMEM/20%FBS，并每2-3天更换一次培养基。</li>
 <li>当各孔中的成纤维细胞达到汇合状态，即细胞生长至孔边缘时，用胰酶消化并传代至2个T75培养瓶中（第1代）。可同时转移组织块，但它们不会贴壁，并将在下次换液时被冲走。</li>
 <li>当成纤维细胞再次达到汇合状态时，将其转移至3个T175培养瓶中（第2代），并以每管1×106 个细胞/ml的密度悬浮于含10% DMSO的完全DMEM培养基中进行冻存。</li>
</ol>
4. 通过免疫染色对成纤维细胞进行表征
<ol>
 <li>将成纤维细胞接种于经明胶包被的8孔腔室载玻片中进行培养。</li>
 <li>当细胞达到80%融合度时，吸除各孔中的培养基。</li>
 <li>用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟。</li>
 <li>用1X PBS洗涤各孔3次。</li>
 <li>加入150 μl含0.3% Triton X-100的PBS溶液，在室温下对细胞进行通透处理，持续5分钟。</li>
 <li>用1X PBS洗涤各孔3次。</li>
 <li>每孔加入200 μl封闭液（PBS + 5%正常山羊血清（Vector, S-1000）），室温孵育1小时。</li>
 <li>用封闭液将抗SERPINH-1抗体（兔源单克隆抗体，Sigma, S5950-200 μl）按1:250比例稀释。</li>
 <li>吸除封闭液，每孔加入150 μl稀释后的抗SERPINH-1抗体溶液。室温孵育1–2小时，或4 °C过夜。</li>
 <li>用1X PBS洗涤各孔3次。</li>
 <li>用封闭液将山羊抗兔单克隆抗体（Alexa Fluor Goat anti-rabbit IgG(H+L), Invitrogen, A11008）按1:200比例稀释。</li>
 <li>每孔加入150 μl稀释后的山羊抗兔单克隆抗体，室温避光孵育1小时。</li>
 <li>用1X PBS洗涤各孔一次。</li>
 <li>吸除PBS，小心移除腔室，露出载玻片表面。</li>
 <li>滴加2–3滴含DAPI的封片剂（Vector, H-1200）对载玻片进行封片。</li>
 <li>在荧光显微镜下观察载玻片样本。</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过本方案，可获得相对纯净的皮肤成纤维细胞培养物。成纤维细胞具有典型的形态学特征，包括细长的纺锤形细胞体、圆形至椭圆形的细胞核，且在汇合时呈平行排列并成束生长。培养基支持成纤维细胞的生长，而其他细胞群体 例如 角质形成细胞需要额外的补充物和生长因子，或有丝分裂活性较低，因此可获得相对纯净的成纤维细胞培养物。 
成纤维细胞随后以1:3至1:5的比例用胰蛋白酶传代。在4至8周内将培养物扩增至所需数量的成纤维细胞（1500万至2000万个）。
利用该技术，我们的实验室已成功建立了70多个成纤维细胞系。我们对每个细胞系都进行了支原体污染检测，并在培养基中添加抗生素以防止其他细菌污染。在最初的组织块培养中，我们发现培养基中含20%胎牛血清（FBS）可支持细胞生长，但在后续传代培养中，10% FBS已足够。偶尔，我们观察到成纤维细胞直接从皮肤组织块中长出，这可能是由于皮肤切片的角度以及去除了含有角质形成细胞的表皮层所致。
使用盖玻片压住皮肤组织片的类似技术在我们...

<table><tbody><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养培养皿</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>6孔组织培养板 </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢一次性无菌手术刀（2 把），刀片编号 15，Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>无菌尖头镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表A. 特异性试剂与仪器设备表&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>1X DMEM：高糖</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>20% 胎牛血清</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM 非必需氨基酸 </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X 青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;&lt;强&gt;表B. 试剂&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

皮肤穿孔活检组织块培养法获取原代人成纤维细胞

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

源自患者的组织和细胞系是研究疾病相关细胞表型的理想材料。本方案中使用的患者来源成纤维细胞已成功用于诱导性多能干细胞的制备，以建立疾病模型1这些成纤维细胞的早期传代也可用于基于细胞的功能性检测，以研究特定的疾病通路和机制。2 以及后续的药物筛选方法。本方案相较于酶解法的优势在于：1）可利用老年患者来源的少量组织实现技术的可重复性， 例如 受帕金森病影响的患者；2）与使用酶处理等更复杂的方法相比，该方法在技术上更为简便；3）时间因素：本方案耗时15–20分钟，可在皮肤活检样本到达后立即进行。酶处理方法可能需要长达4小时，且存在消化过度、细胞活力下降以及细胞处理不当时贴壁能力降低等问题。本方案描述了4毫米人皮肤活检组织的分离与制备过程，用于建立成纤维细胞培养，具有很高的成功率，这在处理患者来源的组织样本时尤为重要。在此培养体系中，角质形成细胞在制备后的第一周内即从活检组织中迁移出来。成纤维细胞则在角质形成细胞首次外延生长后7–10天出现。使用添加20%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基有利于成纤维细胞的生长，成纤维细胞将逐渐覆盖角质形成细胞。经过两次传代后，角质形成细胞被稀释殆尽，最终获得相对均一的表达成纤维细胞标志物SERPINH1（HSP-47）的成纤维细胞培养物。采用该方法，可在4–8周内获得1500万至2000万个成纤维细胞，用于细胞保藏。皮肤组织分离过程约需15–20分钟，细胞接种后每日在显微镜下观察一次，细胞贴壁并开始外延生长后，每2–3天更换一次培养基。

在分离后仅48小时，即可观察到角质形成细胞从活检组织块中生长出来。处理约一周后，可观察到成纤维细胞的初步生长。当培养孔达到汇合状态后，成纤维细胞再传代两次，以获得三个150 cm²培养瓶（T150），随后进行细胞冻存。通过该方法，我们可获得1500万至2000万个细胞。这些成纤维细胞表达抗SERPINH1抗体（也称为HSP-47）（图1），HSP-47是一种定位于内质网的胶原特异性分子伴侣。HSP47在皮肤成纤维细胞的胶原生物合成中发挥着关键作用（Kuroda, et al., 2004）5。
时间线
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td fo:width="1in">天数</td>
 <td fo:width="3in">预期结果</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第3天–第7天</td>
 <t...

通过人皮肤钻孔活检样本进行成纤维细胞组织块培养的实验方案是一种技术上稳健且简单的方法，可在4-8周内获得皮肤细胞，并以较低的传代次数保存约1500万至2000万个细胞。

来源于患病个体的组织和细胞系是研究疾病相关细胞表型的理想材料。患者来源的成纤维细胞……

您好，欢迎观看皮肤活检样本处理视频教程。首先，将所需材料放入组织培养超净台中。所有进入超净台的物品必须用70%乙醇喷洒并擦拭干净，在培养皿上标记PI编号、日期、 initials、培养基类型，并向每个培养皿中加入1毫升0.1%明胶，轻轻旋转培养皿，确保底部被明胶均匀覆盖。使用前将培养皿静置一小时。第一步是将活检组织从试管转移至切割皿中。切割皿是指直径为10厘米的培养皿的皿盖，活检组织将在其上进行解剖。向切割皿的中央加入 1.5 毫升含 20% FBS 的 DMEM 培养基。将培养基从中央向四周铺开。此处可见皮肤活检组织。下一步是将活检组织从试管转移到切割皿的中央。使用无菌镊子将皮肤活检样本置于中央。操作时需小心谨慎，必须保持无菌状态。盖上切割皿，并将其转移至超净工作台内的解剖显微镜下。下一步是将活检组织切成 12 到 18 个大小均匀的组织块。操作手术刀时需小心谨慎。当准备就绪后，揭开活检组织。使用一把手术刀固定活检样本，用第二把手术刀沿单一方向上下移动进行切片。将活检组织切成两半，继续将每块组织对半切割，直至获得12至18块组织。每块活检组织的理想大小约为倒置显微镜左侧目镜测微尺的70%至80%。避免使用小于微米计数50%的组织块，确保有12至18块。下一步操作将在组织培养罩内进行。盖上切割皿，并将其放回组织中。在超净台中从六孔板中吸出明胶，每孔加入700微升DMEM 20%FBS。将培养基沿容器壁加入是一种良好的操作习惯。确保孔内覆盖有一层薄薄的培养基。使用镊子将两到三个活检组织块放入六孔板每个孔的壁上。使用轻敲或滑动动作使组织块贴附于培养板底部。可用手术刀将卡在镊子上的活检组织块移除。在此培养板上生长的细胞将处于零代传代状态。这是培养板最终应有的外观。这是在倒置显微镜下观察到的其中一个组织块。此为第1天的皮肤活检样本。通常在1到3天内可见细胞贴壁。一周内开始出现角质形成细胞。两周内可见成纤维细胞。有时可能观察不到角质形成细胞。通常需要三周时间，成纤维细胞才能生长至铺满培养容器，达到可进行包装的阶段。

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推导人类纤维原细胞的皮肤穿刺活检植文化

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细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。...

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

本文介绍了一种基于组织块培养的方法，用于分离和培养原代的、患者特异性的许多人主动脉平滑肌细胞和皮肤成纤维细胞。此外，还提出了一种测量细胞收缩及进行后续分析的新方法，可用于研究这些细胞在不同患者间的特异性差异。...

分离患者特异性原代主动脉平滑肌细胞及半定量实时收缩测量 体外

研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的体外相互作用。本方案描述了从人包皮中分离、培养和鉴定这些原代细胞的方法。...

人包皮来源的施万细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的分离、培养与鉴定

本研究描述了一种优化的从瘢痕疙瘩组织中建立原代成纤维细胞的实验方案，可有效且稳定地提供纯净且具有活性的成纤维细胞。...

从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和鉴定原代真皮成纤维细胞

本文描述了一种两步法方案，用于从皮肤成纤维细胞生成患者特异性的足细胞 通过...

从皮肤活检样本中生成患者来源的足细胞

学习从人类皮肤穿刺活检中分离培养纤维原细胞的标准方法，使用明胶包被培养板和DMEM培养基。该技术可在4至8周内获得1500至2000万个低代次细胞，适用于皮肤生物学和再生医学研究。

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