简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

大家好，我是Shamal，来自印度国家生物科学中心TUR Kika实验室的博士后研究员。在本视频中，我将向您展示如何在常规实验室环境中，利用软光刻技术制备生物微装置。我将使用这些装置对遗传模式生物进行高分辨率的细胞及亚细胞成像。

本方案将使研究人员能够在无需麻醉的完整生物体中进行延时成像。现在让我们开始。我们已开发出一种简单的微型装置，可用于对遗传模式生物（如秀丽隐杆线虫、完整的幼虫以及斑马鱼幼体）进行无需麻醉的活体成像。

本研究中，我们展示了一种基于膜的透明固定装置，该装置通过软模塑法使用PDMS制备而成。为了固定单个生物体，我们在体视显微镜下定位单个动物，使用微量移液器吸取少量缓冲液将动物拾取，随后将其置入流动通道中，并利用PTMS膜对其进行固定。通过三通球阀连接加压氮气实现操作。

使用清洁软件设计微弗雷迪克结构。将2厘米×2厘米的硅片在20% KH中清洗1分钟，然后用去离子水冲洗。用氮气吹干硅片，并在122摄氏度下脱水4小时。

将硅片上的六金属在500 RPM转速下旋涂5秒，再在3000 RPM转速下旋涂30秒。在硅晶圆上以500 RPM旋涂SU 8 2 0 2 5持续5秒，然后以2000 RPM旋涂30秒。将涂覆后的硅片在65摄氏度下预烘1分钟，再在95摄氏度下预烘10分钟。

将涂有SU-8光刻胶的晶圆通过掩膜版置于200瓦紫外灯下曝光，其中设计一和设计二分别用于流体层和控制层。曝光后，将晶圆在65摄氏度下后烘1分钟，再在95摄氏度下烘烤10分钟。使用SUA显影液显影20分钟。

将样品置于干燥器中，用三氯三氟丙烯硒蒸气处理两小时。按10:1的质量比混合聚二甲基硅氧烷基料与固化剂。对混合物进行脱气处理，以去除混合过程中产生的所有气泡。

在带有设计图案的SC重量掩模的硅片上倒入厚度为五毫米的PDMS混合物。倾倒时需轻柔操作，以避免产生气泡。使用旋涂法在带有图案的硅片上形成均匀的PDMS层，用于流体层的制备：先以500 RPM转速旋涂5秒，再以1500 RPM转速旋涂30秒。

将含有PDMS的设计一和设计二的两部分在50摄氏度下烘烤六小时。使用带有SCH图案二的刀片从硅基底上切割出PDMS部分。在PDMS模具中连接主捕获区域的储液池顶部打一个小孔。

使用最高穿刺强度或18号针头。将控制层的底面和流动层的顶面暴露于18瓦空气等离子体中处理两分钟。将两个经等离子体处理的表面轻轻压合在一起，并在50摄氏度下烘烤两小时。

使用 SUH 设计一将键合好的器件从硅基底上切割下来，并在流道的入口和出口储液区打孔。暴露器件底部的 PD 和一块干净的玻璃盖片。用 18 伏空气等离子体处理两分钟。

将两个经过等离子体处理的表面轻轻压合，并在50摄氏度下烘烤两小时。将器件存放在洁净环境中以备后续使用。在器件制备完成后，我将向您展示如何使用PDMS膜将秀丽隐杆线虫（C. elegans）固定在器件内。将一段Microflex管的一端连接至加压氮气源的调压阀，另一端通过18号针头连接至主捕获储液池。

在管路连接中间使用三通旋塞阀，可对膜施加或释放压力。在将管路连接至主捕获装置的储液腔之前，先用10厘米高的蒸馏水柱充满管路，并连接至PDMS装置。打开氮气供应阀，使压力读数为PSI，并在倒置显微镜的低倍镜下观察主捕获装置的膜向流动通道方向弯曲的情况。

因此，松开三通旋塞阀，使膜恢复至静止位置。用缓冲液冲洗流道10分钟。在实验开始前，使用低倍放大体视显微镜找到一条单独的海兔（sea elegance）。

使用少量缓冲液将单个动物样本吸入微量吸头中，通过流动通道入口推入该样本。调节移液压力，使单个动物位于主捕获区域下方。

缓慢增加PDMS膜的压力，将动物推至通道边界并以7至14 PSI的压力将其固定。使用倒置显微镜调整至所需的高分辨率透射光或荧光成像设置。以预设的帧率实时采集单张或时间序列荧光图像。

释放捕获压力，观察动物的运动行为。在低倍镜下持续观察五分钟，冲洗动物并更换新的动物。若需重复 DevOp 操作步骤，可使用切去尖端的微量移液器吸头挑取单个 oph 幼虫，并将其插入较大尺寸的微铁装置中。

将单个幼虫通过流动通道入口推入。缓慢增加PDMS膜的压力，使用七次ESI压力将其固定。在倒置显微镜下以低倍镜进行荧光成像，采集时间序列荧光图像以观察运输过程。

释放捕获压力，在低倍镜下观察幼虫的运动行为。使用相同的装置原理固定受精后30小时的斑马鱼，并获取其延时成像图像。Val心脏。

观看本视频后，您将能够在自己的实验室中制备类似的微装置，并成功将其用于固定生物体，开展高分辨率的精彩实验。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。