Name: 简单的微流控芯片的成像 C.线虫果蝇和斑马鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习使用PDMS膜微流控芯片对C. elegans、Drosophila和斑马鱼幼虫进行无麻醉活体成像。该技术可实现心跳、细胞分裂和神经元运输的高分辨率延时成像。

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我们感谢 Krishanu Ray 博士为本研究 果蝇 stocks，Tarjani Agarwal 负责维持 a 黑腹果蝇 笼子，Peter Juo 用于 nuIs25 以及 CGC 用于 秀丽隐杆线虫 菌株。SPK 制备 jsIs609 感谢Michael Nonet实验室的贡献。感谢Arpan Agnihotri（BITS Pilani）在活细胞成像技术中对线粒体运输过程的时间序列成像所提供的帮助 jsIs609 微流控装置中的动物实验。我们感谢Vatsala Thirumalai博士和Surya Prakash为我们提供斑马鱼胚胎。感谢Krishna博士以及NCBS的CIFF中心提供旋转盘共聚焦显微镜的使用权限，该设备由印度科学技术部—纳米技术中心资助（编号：SR/55/NM-36-2005）。我们还感谢Kaustubh Rau、V. Venkatraman和Chetana Sachidanand参与讨论。本研究由DBT博士后奖学金（S.M.）、DST快速通道计划（S.M.）以及DBT对S.P.K.的资助项目提供经费支持。S.A.的研究得到了DST和CSIR对S.P.K.的资助支持。

1. SU8 母版制作
<ol>
 <li>使用 Clewin 软件设计微流控结构，并使用 65,024 DPI 激光绘图仪在电路板膜上打印，最小特征尺寸为 8 μm。</li>
 <li>用 20% KOH 清洗带有天然氧化层的 2 cm × 2 cm 硅片 1 分钟，然后用去离子水冲洗；每个流动层及其对应的控制层各使用一片硅片。</li>
 <li>用氮气吹干硅片，并在热板上 120 °C 下脱水 4 小时。待硅片冷却至室温后，再进行下一步操作。</li>
 <li>依次将硅片放置在旋涂机卡盘上，打开真空。在硅片表面覆盖约 20 μl 六甲基二硅氮烷（HMDS），使用 SPIN150 旋涂仪以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 3,000 rpm 旋转 30 秒进行涂覆。</li>
 <li>在硅片上完全覆盖约 1.5 ml SU8-2025（<a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</a>），使用 SPIN150 旋涂仪以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 2,000 rpm 旋转 30 秒进行涂覆。该旋涂程序可获得约 40 μm 厚的光刻胶层，适用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）早期幼虫阶段的控制层和流动层。</li>
 <li>使用 SPIN150 旋涂仪对约 1.5 ml SU8-2050 以 500 rpm 旋转 5 秒，随后以 2,000 rpm 旋转 30 秒，获得约 80 μm 厚的光刻胶层，适用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）晚期幼虫阶段的流动层、果蝇（Drosophila）/斑马鱼幼虫的基础流动层及其相应的控制层。</li>
 <li>将涂有 SU8 的硅片放置在热板上，光刻胶层朝上。在 65 °C 下预烘 1 分钟，随后在 95 °C 下烘 10 分钟。待硅片冷却至室温后，再进行下一步操作。</li>
 <li>将预烘后的硅片放置在曝光台上，SU8-2025 涂层朝上并面向紫外灯。对于秀丽隐杆线虫（C. elegans）早期幼虫阶段的流动层和控制层图案，分别使用带有设计 I（L1，图 1B）和设计 II（L2，图 1B）的光掩模。将光掩模置于 SU8 层上方，并确保其与涂层紧密贴合。打开紫外灯快门，通过光掩模对预烘后的 SU8 硅片进行 200 瓦紫外灯曝光 15 秒。</li>
 <li>在涂有 SU8-2050 的硅片（步骤 1.6 制备）上，使用带有设计 I（L1，图 1B）和设计 II（L2，图 1B）的光掩模，分别制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）晚期幼虫阶段的流动层和控制层。在涂有 SU8-2050 的硅片（步骤 1.6 制备）上，使用带有设计 I（L1，图 1C）和设计 II（L2，图 1C）的光掩模，分别制备果蝇（Drosophila）/斑马鱼幼虫的基础流动层和控制层。通过光掩模对 SU8 表面进行 200 瓦紫外灯曝光 15 秒。</li>
 <li>将曝光后的硅片放置在热板上，涂层朝上。在 65 °C 下后烘 1 分钟，随后在 95 °C 下烘 10 分钟。待硅片冷却后再进行下一步操作。</li>
 <li>使用 SU8 显影液对硅片显影 20 分钟。用异丙醇（IPA）冲洗硅片，并用氮气吹干。</li>
 <li>将硅片放入干燥器中，SU8 图案朝上。在干燥器中用 50 μl 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气对硅片进行 2 小时的表面修饰。</li>
</ol>
注意事项：进行KOH处理、光刻胶涂覆和显影时，需采取化学品操作的安全防护措施。硅烷蒸气涂覆应在通风良好的区域内的干燥器中进行。避免SU8光刻胶过度暴露于光照。使用紫外光源时，应佩戴护目镜。
2. PDMS 模具的制备
<ol>
 <li>将50 g Sylgard 184基础剂与5 g固化剂加入塑料杯中，配制10:1的PDMS。手动混合约3分钟。将混合物置于真空干燥器中脱气，以去除混合过程中产生的所有气泡。</li>
 <li>在带有设计II型SU8图案的硅片上，轻轻倾倒一层5 mm厚的PDMS混合物，用于控制层，避免产生气泡。若倾倒过程中形成气泡，需在低真空条件下对SU8图案上的PDMS进行脱气处理，以彻底去除所有气泡。</li>
 <li>将带有设计I型SU8-2025图案的硅片（用于流体层）放置在旋涂机载物台上，并打开真空以固定硅片。在硅片上覆盖约1 ml PDMS混合液，使用SPIN150旋涂仪以500 rpm转速旋涂5秒，随后以1,500 rpm转速旋涂30秒。</li>
 <li>在带有设计I（L1）80 μm SU8-2050图案的硅片上涂覆约1 ml PDMS混合物， 图1B），用于晚期幼虫阶段的流体层 秀丽隐杆线虫 使用SPIN150旋涂仪，先以500 rpm转速旋转5秒，随后以1,000 rpm转速旋转30秒。在带有SU8-2050流动层设计I型（L1）图案的硅片上涂覆一层较厚的PDMS混合液， 图1C）用于 果蝇斑马鱼幼体，使用SPIN150旋转仪在500 rpm下旋转35秒。</li>
 <li>将设计I的PDMS包被硅片与用于控制层的含PDMS的设计II晶圆一同烘烤 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇斑马鱼幼体在50 °C的热风对流烘箱中处理6小时。</li>
 <li>从含有SU8图案II的硅基底上切下PDMS片 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇使用锋利的刀片将斑马鱼幼鱼切开。在PDMS模具中，利用Harris打孔器在连接主捕获区域的储液池顶部打一个直径约1 mm的小孔。</li>
 <li>将打孔的PDMS块（含有40 μm厚的控制层L2模具）放置在塑料托盘上，使控制层的模制面朝上。将涂有PDMS并带有40 μm厚SU8设计I的硅片放置在同一托盘上，PDMS涂层表面朝上。将托盘放入等离子清洗仪腔室内，开启真空泵抽真空2分钟。随后打开等离子电源，降低腔室压力，直至腔室内呈现淡粉色。在低真空条件下，用18瓦的空气等离子处理两个表面2分钟。</li>
 <li>将从含有晚期幼虫阶段图案II的80 μm厚SU8模具上取下的打孔PDMS块放置于 秀丽隐杆线虫 或 果蝇将斑马鱼幼体置于塑料托盘上，控制层的模压面朝上。将相应的经旋涂并烘焙的PDMS层（该PDMS层旋涂于含80 μm厚设计I的硅片上）放置一旁备用 C. elegans 阶段或 黑腹果蝇将斑马鱼幼鱼同时放置在同一托盘上，确保其平坦的PDMS涂层表面朝上。采用上述相同的方案，将其暴露于空气等离子体中。</li>
 <li>将两个经等离子体处理的表面放置于 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇将斑马鱼幼鱼轻轻压平后，置于50 °C的热空气对流烘箱中烘烤2小时。</li>
 <li>使用 SU8 设计 I 从硅基底上切割出键合的器件 秀丽隐杆线虫 和/或 黑腹果蝇斑马鱼幼体。在流道的入口和出口储液池处打穿通孔。</li>
 <li>将键合好的PDMS模具放置于塑料托盘中 C. elegans，使流体层设计的模制面朝上。取洁净的玻璃盖玻片（22 × 22 mm，1号厚度）并置于同一塑料托盘上。将载有PDMS模具和玻璃盖玻片的托盘放入等离子体腔室中。在低压条件下，对装置底部的PDMS表面和玻璃盖玻片施加18瓦的空气等离子体处理2分钟。将两个经等离子体处理的表面轻轻压合，并在50 °C的热对流烘箱中烘烤2小时。</li>
 <li>将设备存放在洁净环境中，以备后续使用。 </li>
</ol>
3. 额外步骤 果蝇斑马鱼装置
<ol>
 <li>在干燥器中，将 2 cm × 2 cm 的洁净玻璃表面暴露于 50 μl 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气中处理 2 小时。</li>
 <li>将步骤2.1中制备的约1 ml 10:1 PDMS混合物滴加在硅烷化玻璃表面，使用SPIN150匀胶机以500 rpm转速旋转35秒。将涂有PDMS的玻璃基底放入热风烘箱中，在50 °C下烘烤6小时，涂层面向上。待PDMS层冷却至室温后，再进行下一步操作。</li>
 <li>使用定制的锋利金属冲头在PDMS中间位置冲压涂层层，以形成PDMS间隔层。该金属冲头的形状设计与流道设计相似 果蝇斑马鱼（L1， 图1C).</li>
 <li>暴露PDMS间隔层以及单键合模块（流体层和控制层，按步骤2.9制备） 黑腹果蝇将斑马鱼幼鱼置于低真空条件下，用18瓦空气等离子体在等离子清洗机中处理，随后将两个经等离子体处理的表面贴合，并在50 °C热风烘箱中烘烤2小时。 </li>
 <li>从玻璃上切割下已键合的装置，在进样口和出样口储液区打孔，并使用等离子清洗仪按照步骤2.11所述方法将其键合到玻璃盖玻片（22 × 22 mm，1号厚度）上。该装置可用于固定一龄幼虫 果蝇 幼虫通道高度约为500 μm。对于斑马鱼幼鱼，需复制PDMS间隔层的制备过程，并增加一个键合步骤。双层PDMS-S可为30 hpf斑马鱼幼鱼提供900 μm的通道高度。 </li>
</ol>
注意事项：在器件制备过程中应避免灰尘颗粒。两个经等离子清洗的表面必须完全无尘，以确保良好的键合效果。在没有专用洁净室的情况下，应将器件存放在干燥器中，以尽量减少灰尘颗粒在器件上的积聚。
4. 使用PDMS膜
<ol>
 <li>将微细软管一端（内径约1.6 mm，外径约4.8 mm）连接至加压氮气供应调节器，另一端通过一根18号针头（外径约1.25 mm，用胶固定于软管上）连接至主捕集器储液池。在软管连接中间安装一个三通旋塞阀，用于对膜施加或释放压力。</li>
 <li>在将连接至PDMS装置的管子与主捕集器的储液槽连接之前，先向该管子中加入10 cm高的蒸馏水液柱 秀丽隐杆线虫 和/或 果蝇斑马鱼幼虫装置 </li>
 <li>将氮气供应阀调节至读数为14 psi，并在倒置显微镜低倍镜下观察主捕集阱膜向流动通道方向的形变情况。当三通旋塞打开时，微柔性管中水柱长度会被压缩。在透射光下可观察到形变膜的边缘（图1I 和 1J膜的形变导致PDMS膜下方的尘埃颗粒/气泡发生位移，并将其推向通道边界。</li>
 <li>等待液体前沿完全充满微通道，且无任何气泡残留。 </li>
 <li>使用三通旋塞阀释放压力，使膜松弛至其静息位置。 </li>
</ol>
5. 将 C. elegans、Drosophila 和斑马鱼幼虫装入装置，并在柔性的 PDMS 膜下固定
<ol>
 <li>用 M9 缓冲液 [3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO₄4，H20至1升，通过高压灭菌进行灭菌]用于 秀丽隐杆线虫 18 或 1× PBS [8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，H20至1升，通过高压灭菌进行灭菌] 果蝇实验前将斑马鱼幼鱼在 19°C 下孵育 10 分钟。</li>
 <li>定位单个 秀丽隐杆线虫 在NGM平板上所需发育阶段的 18 （或一龄幼虫） 果蝇 来自琼脂卵板或人工去壳的30小时斑马鱼幼鱼（30 hpf），置于液体培养基中 20) 使用低倍立体显微镜进行观察。用微量缓冲液将单个动物样本吸入微尖移液头中。使用末端经切割处理的微尖移液头，以容纳较大的样本 果蝇 或缓冲液中的斑马鱼幼鱼。 </li>
 <li>将单个生物体通过流动通道入口推入。调节移液压力，使单个动物位于主捕获区域下方。 </li>
 <li>缓慢增加PDMS膜的压力，使动物紧贴通道边界，并以14 psi的压力将其固定 秀丽隐杆线虫，7 psi 用于 果蝇 斑马鱼幼虫为3 psi。</li>
 <li>将固定好的动物置于显微镜视野中心。使用倒置显微镜，根据需要设置高分辨率明场或荧光成像条件。以预设的帧率采集单张或延时荧光图像。</li>
 <li>释放捕获压力，在低倍镜下观察动物运动 5-10 分钟。 </li>
 <li>冲洗动物并放入新的动物以重复上述步骤。 </li>
 <li>使用注射器将蒸馏水注入废液储液池，清洗所有动物样本。随后用注射器向通道内推入空气，将其干燥，以备后续重复使用。 </li>
</ol>
注意事项：需要较高移液压力才能进入主通道的动物在从捕获区释放后，往往表现出运动能力差或健康状况不佳，应避免用于成像。清除流道中残留的缓冲液痕迹，防止结晶导致通道堵塞。若使用油浸进行高分辨率成像，需清洁玻璃盖玻片，以确保后续实验具有良好的信噪比。

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<li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104%2FKIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200(2010).</li>
<li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li>
<li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A.+Mol.+Integr.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li>
<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

PDMS 微流控装置具有光学透明性，因此可用于任何透明或半透明模式生物的高分辨率 in vivo 成像。我们的设计适用于在完整活体动物中对细胞及亚细胞事件进行高倍率时空成像。采用软光刻技术进行微加工，可方便地调节装置尺寸以适应不同大小的模式生物。我们已制备出适用于不同发育阶段的 C. elegans、Drosophila 幼虫和斑马鱼幼虫的多种尺寸装置。其流体层通道高度分别为 40 μm 和 80 μm 的装置，可分别显著改善早期（L1）和晚期（晚L4）C. elegans 的固定效果以及成像后的存活状态。我们在制备用于 C. elegans 以及 Drosophila/斑马鱼的装置时，实现了 100% 的成功率为，无任何缺陷装置。该装置可重复使用，直至控制通道被灰尘颗粒或细菌污染为止。与使用麻醉剂处理的动物相比，装置固定的 C. elegans 在野生型和突变型个体中均表现出更高的货物运输通量。该固定方法避免了技术上较为困难的解剖操作，尤其适用于 Drosophila 幼虫的早期发育阶段<su...

<table><tbody><tr><td>硅片</td><td>University Wafer</td><td>150 mm (100) 机械级 SSP Si</td><td></td></tr><tr><td>Clewin 软件</td><td>WieWeb 软件</td><td>版本 2.90</td><td></td></tr><tr><td>激光绘图仪</td><td>Fine Line Imaging</td><td>65,024 DPI</td><td></td></tr><tr><td>HMDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>Microchem</td><td>SU8-2025, SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>显影液</td><td>Microchem</td><td>SU8 显影液</td><td></td></tr><tr><td>硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Oriel</td><td>66943</td><td>200W Hg Oriel 光源</td></tr><tr><td>热风烘箱</td><td>Ultra Instruments</td><td>定制</td><td>设定为 50 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>加热板</td><td>IKA 实验室设备</td><td>3810000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ika.com&quot; target=&quot;_blank">http://www.ika.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>匀胶机</td><td>半导体生产系统公司</td><td>SPIN150-NPP</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.SPS-Europe.com&quot; target=&quot;_blank">www.SPS-Europe.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Gold Seal</td><td>22 × 22 mm，No. 1 厚度</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; 遗传中心（CGC）</td><td>&lt;em&gt;e1265, ayIs4&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington</td><td>P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼</td><td>印度野生型</td><td>野生型</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>Sigma</td><td>Z279803</td><td></td></tr><tr><td>微针</td><td>Sigma</td><td>Z118044</td><td>切成 1 cm 长的片段</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Sigma</td><td>S7521</td><td></td></tr><tr><td>Harris 打孔器</td><td>Sigma</td><td>Z708631</td><td></td></tr><tr><td>压缩氮气</td><td>本地气体供应商</td><td></td><td>使用减压阀控制压力</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Andor Olympus</td><td>Yokogawa 转盘共聚焦显微镜</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rsbweb.nih.gov/ij&quot; target=&quot;_blank">www.rsbweb.nih.gov/ij&lt;/a&gt;</td><td>基于 Java 的图像处理程序</td></tr></tbody></table>

简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

微加工流体装置为微环境研究提供了便捷的平台 体内 小型生物研究。利用软光刻技术可采用简单的制造工艺制备微流控装置 1-3微流控设备已用于亚细胞成像 4,5, 体内 激光显微手术 2,6 以及细胞成像 4,7. 体内 成像需要对生物体进行固定。这可通过使用负压吸附来实现。 5,8，锥形通道 6,7,9可变形膜 2-4,10，附加冷却的抽吸 5麻醉气体 11，温度敏感凝胶 12，氰基丙烯酸酯胶水 13 以及左旋咪唑等麻醉剂 14,15常用的麻醉剂影响突触传递 16,17 已知会对神经元亚细胞运输产生不利影响 4本研究中，我们展示了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜的装置，该装置可实现对完整遗传模式生物的无麻醉固定，例如 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫), 果蝇 幼虫和斑马鱼幼鱼。这些模式生物适用于 体内 由于其直径较小且身体具有光学透明或半透明特性，可在微流控装置中进行研究。早期幼虫阶段的体径范围约为 10 μm 至 800 μm。 秀丽隐杆线虫 斑马鱼幼体需要不同尺寸的微流控装置，以通过压缩氮气经液柱施加压力实现完全固定，从而进行高分辨率的延时成像。固定后的生物体利用倒置显微镜进行观察，释放后动物在10分钟内恢复正常的运动活动。
我们展示了延时成像在C. elegans中的四种应用，即神经元中线粒体运输的成像、在运输缺陷型突变体中突触前囊泡的运输、谷氨酸受体的运输以及Q神经母细胞的分裂。通过此类影像获得的数据表明，与麻醉动物相比，微流控固定是一种获取细胞及亚细胞事件体内数据的有效且精确的方法（图1J和3C-F 4）。
设备尺寸经过调整，以实现对不同阶段的延时成像 秀丽隐杆线虫一龄幼虫 果蝇 幼虫和斑马鱼幼虫。在完整的一龄幼虫中，感觉神经元内由GFP标记的突触结合蛋白（syt.eGFP）所标记的小泡运输显示出胆碱能感觉神经元中突触小泡标志物的定向运动 果蝇 幼虫。类似装置已被用于对受精后约30小时（hpf）的斑马鱼幼虫进行心跳延时成像。这些数据表明，我们开发的简单装置可应用于多种模式系统，以研究多种细胞生物学和发育学现象。 体内.

固定装置是一种双层PDMS模块，通过键合两层制成：流体层（第一层）和控制层（第二层），如图所示。 图1主要陷阱装置通过调压阀和三通旋塞连接至氮气钢瓶，以通过液柱向膜施加所需的3-14 psi压力。图1A）。发生偏转的膜实现固定 秀丽隐杆线虫, 果蝇 或在具有不同尺寸设计的流道中的斑马鱼幼鱼（图1B 和 1C）。光刻掩模用于设计具有不同几何结构的固定化装置层 秀丽隐杆线虫 (图1D), 果蝇 幼虫（图1F）和斑马鱼幼鱼（图1G）。流体层的通道高度（h1 在 图1E，1K）通过调节不同的旋涂速度，以适应不同直径的生物体在流动通道内的需求。流动层高度在制备时设定为 40 μm, 80 μm, 500 μm 和 900 μm 用于 秀丽隐杆线虫 幼虫阶段，成虫 秀丽隐杆线虫</em...

一种无需麻醉的简易微流控装置已被开发出来 体内 成像 秀丽线虫完整 果蝇 幼虫和斑马鱼幼鱼。该装置利用可变形的PDMS膜固定这些模式生物，从而对心跳、细胞分裂和亚细胞神经元运输等多种过程进行延时成像。我们展示了该装置的使用方法，并呈现了从不同模式系统中采集的各类数据示例。

微加工流体装置为小型生物体的体内研究提供了可及的微环境。简单的制造工艺可实现……

大家好，我是Shamal，来自印度国家生物科学中心TUR Kika实验室的博士后研究员。在本视频中，我将向您展示如何在常规实验室环境中，利用软光刻技术制备生物微装置。我将使用这些装置对遗传模式生物进行高分辨率的细胞及亚细胞成像。本方案将使研究人员能够在无需麻醉的完整生物体中进行延时成像。现在让我们开始。我们已开发出一种简单的微型装置，可用于对遗传模式生物（如秀丽隐杆线虫、完整的幼虫以及斑马鱼幼体）进行无需麻醉的活体成像。本研究中，我们展示了一种基于膜的透明固定装置，该装置通过软模塑法使用PDMS制备而成。为了固定单个生物体，我们在体视显微镜下定位单个动物，使用微量移液器吸取少量缓冲液将动物拾取，随后将其置入流动通道中，并利用PTMS膜对其进行固定。通过三通球阀连接加压氮气实现操作。使用清洁软件设计微弗雷迪克结构。将2厘米×2厘米的硅片在20% KH中清洗1分钟，然后用去离子水冲洗。用氮气吹干硅片，并在122摄氏度下脱水4小时。将硅片上的六金属在500 RPM转速下旋涂5秒，再在3000 RPM转速下旋涂30秒。在硅晶圆上以500 RPM旋涂SU 8 2 0 2 5持续5秒，然后以2000 RPM旋涂30秒。将涂覆后的硅片在65摄氏度下预烘1分钟，再在95摄氏度下预烘10分钟。将涂有SU-8光刻胶的晶圆通过掩膜版置于200瓦紫外灯下曝光，其中设计一和设计二分别用于流体层和控制层。曝光后，将晶圆在65摄氏度下后烘1分钟，再在95摄氏度下烘烤10分钟。使用SUA显影液显影20分钟。将样品置于干燥器中，用三氯三氟丙烯硒蒸气处理两小时。按10:1的质量比混合聚二甲基硅氧烷基料与固化剂。对混合物进行脱气处理，以去除混合过程中产生的所有气泡。在带有设计图案的SC重量掩模的硅片上倒入厚度为五毫米的PDMS混合物。倾倒时需轻柔操作，以避免产生气泡。使用旋涂法在带有图案的硅片上形成均匀的PDMS层，用于流体层的制备：先以500 RPM转速旋涂5秒，再以1500 RPM转速旋涂30秒。将含有PDMS的设计一和设计二的两部分在50摄氏度下烘烤六小时。使用带有SCH图案二的刀片从硅基底上切割出PDMS部分。在PDMS模具中连接主捕获区域的储液池顶部打一个小孔。使用最高穿刺强度或18号针头。将控制层的底面和流动层的顶面暴露于18瓦空气等离子体中处理两分钟。将两个经等离子体处理的表面轻轻压合在一起，并在50摄氏度下烘烤两小时。使用 SUH 设计一将键合好的器件从硅基底上切割下来，并在流道的入口和出口储液区打孔。暴露器件底部的 PD 和一块干净的玻璃盖片。用 18 伏空气等离子体处理两分钟。将两个经过等离子体处理的表面轻轻压合，并在50摄氏度下烘烤两小时。将器件存放在洁净环境中以备后续使用。在器件制备完成后，我将向您展示如何使用PDMS膜将秀丽隐杆线虫（C. elegans）固定在器件内。将一段Microflex管的一端连接至加压氮气源的调压阀，另一端通过18号针头连接至主捕获储液池。在管路连接中间使用三通旋塞阀，可对膜施加或释放压力。在将管路连接至主捕获装置的储液腔之前，先用10厘米高的蒸馏水柱充满管路，并连接至PDMS装置。打开氮气供应阀，使压力读数为PSI，并在倒置显微镜的低倍镜下观察主捕获装置的膜向流动通道方向弯曲的情况。因此，松开三通旋塞阀，使膜恢复至静止位置。用缓冲液冲洗流道10分钟。在实验开始前，使用低倍放大体视显微镜找到一条单独的海兔（sea elegance）。使用少量缓冲液将单个动物样本吸入微量吸头中，通过流动通道入口推入该样本。调节移液压力，使单个动物位于主捕获区域下方。缓慢增加PDMS膜的压力，将动物推至通道边界并以7至14 PSI的压力将其固定。使用倒置显微镜调整至所需的高分辨率透射光或荧光成像设置。以预设的帧率实时采集单张或时间序列荧光图像。释放捕获压力，观察动物的运动行为。在低倍镜下持续观察五分钟，冲洗动物并更换新的动物。若需重复 DevOp 操作步骤，可使用切去尖端的微量移液器吸头挑取单个 oph 幼虫，并将其插入较大尺寸的微铁装置中。将单个幼虫通过流动通道入口推入。缓慢增加PDMS膜的压力，使用七次ESI压力将其固定。在倒置显微镜下以低倍镜进行荧光成像，采集时间序列荧光图像以观察运输过程。释放捕获压力，在低倍镜下观察幼虫的运动行为。使用相同的装置原理固定受精后30小时的斑马鱼，并获取其延时成像图像。Val心脏。观看本视频后，您将能够在自己的实验室中制备类似的微装置，并成功将其用于固定生物体，开展高分辨率的精彩实验。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。

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生物工程

简单的微流控芯片的<em在体内</em&gt;成像<em&gt; C.线虫</em&gt;<em&gt;果蝇</em&gt;和斑马鱼

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

大规模二维电子显微镜（EM），即纳米解剖学，是指在组织范围内应用纳米级分辨率的电子显微镜技术。本文介绍了一种通用的纳米解剖学方法，用于研究健康状态下以及无创性脑损伤后的斑马鱼幼体脑组织。...

大规模扫描透射电子显微镜（纳米解剖学）对健康与损伤斑马鱼脑组织的成像

本文介绍了一种改良的"嗅觉芯片"，用于高效进行秀丽隐杆线虫（C.

使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

斑马鱼胚胎和幼鱼的显微注射是一种在多种斑马鱼模型中至关重要的技术，但也具有挑战性。本文介绍了一系列微尺度工具，可用于在显微注射和成像过程中辅助稳定和定向斑马鱼样本。...

用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

为了理解机械应力如何激活生化通路并引发生物学反应，机械生物学研究需要新的工具。本文展示了一种新方法，利用微流控捕获装置对固定化的动物进行选择性机械刺激，从而实现对细胞反应的高分辨率成像。...

使用微流控装置进行机械刺激与高分辨率成像 秀丽隐杆线虫

本文中，我们利用一种定制的微流控装置，对单个线虫进行活体成像。在该装置中，多条线虫被分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重化、长期监测。...

用于纵向成像的微流控平台 秀丽隐杆线虫

本方案描述了一种简单的微流控芯片设计及微加工方法，可用于在持续供应食物的条件下培养秀丽隐杆线虫（C.

一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片 秀丽隐杆线虫

我们展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜对发育中斑马鱼视顶盖内的小胶质细胞进行活体成像的方法，从而实现对这些细胞动态行为的分析 体内.

活体成像与斑马鱼胚胎小胶质细胞动态的表征

一种利用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）层压技术制备微流控器件的创新方法，显著降低了对多个活体斑马鱼胚胎进行捕获和成像的成本与复杂性。...

低成本聚对苯二甲酸乙二醇酯层压微流控设计用于多重斑马鱼成像

RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。...

一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

本方案描述了基于微流控技术的秀丽隐杆线虫（C.

高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

学习使用PDMS膜微流控芯片对C. elegans、Drosophila和斑马鱼幼虫进行无麻醉活体成像。该技术可实现心跳、细胞分裂和神经元运输的高分辨率延时成像。

简单的微流控装置体内成像秀丽隐杆线虫, 果蝇和斑马鱼

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