Name: 单细胞的多巴胺释放，同时电压钳和电流分析法测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学习使用电压钳与电流分析法同步测量多巴胺转运体介导的单细胞多巴胺释放技术。该方法通过膜片钳控制神经元电压，实时记录逆向转运过程，为研究多巴胺能信号传导提供精准工具。

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感谢 Sanika Chirwa 博士对本文稿的审阅。本研究由美国国立卫生研究院（DA026947、DA021471 和 NS071122）资助。

1. 仪器与试剂
<ol>
	<li>将法拉第笼安装在防震台（TMI）上方，以降低背景噪声。</li>
	<li>同步膜片钳安培法记录系统需要配备优质微分干涉差（DIC）光学系统和长工作距离物镜的倒置显微镜。将显微镜灯塔连接至汽车蓄电池。该系统的直流光源可进一步降低电噪声。</li>
	<li>液压微操纵器（Siskiyou）可进一步减少噪声。在我们的配置中，使用右手操纵器进行全细胞记录，左手操纵器用于安培法检测。</li>
</ol>
2. 准备用于记录的电极
<ol>
	<li>使用石英毛细管在P-2000拉制仪（Sutter）上制备膜片电极。我们的拉制过程持续约5秒，包含两个加热周期。该加热时间可使全细胞记录用膜片电极的电阻保持稳定（3–4 MΩ）。</li>
	<li>用含有2 mM多巴胺的电极内液填充电极，并将其安装至右侧操纵器上。将盛有多巴胺溶液的容器用铝箔包裹，置于冰上保存。多巴胺易被氧化，将其置于冰上并避光可降低其氧化速率。</li>
	<li>小心地从储存盒中取出ProCFE（Dagan）低噪声碳纤维安培电极，填充汞后安装至安培适配器上（如图1所示），再将其固定在右侧操纵器上。操作时应握住碳纤维的远端，避免损伤其尖端。使用实验室显微镜检查电极，确保其尖端清洁且完好无损。</li>
	<li>将安培电极置于含外部溶液的玻璃底培养皿中，检测其完整性。在无多巴胺条件下记录基线电流，随后向培养皿中加入10 μl的1 mM DA溶液。性能良好的安培电极应能记录到氧化电流的上升。每次实验开始和结束时均需重复此步骤，以确保安培电极功能正常。</li>
</ol>
3. 在玻璃底培养皿中制备多巴胺神经元或表达多巴胺转运体的工程化细胞的原代神经元培养
<ol>
	<li>用预热的外部溶液轻轻清洗细胞或多巴胺能神经元三次。</li>
	<li>将玻璃底培养皿安装到显微镜载物台上。</li>
</ol>
4. 观察细胞并进行实验
<ol>
	<li>找到正确的焦距，以清晰观察细胞。对膜片电极施加正压。然后，轻柔地将两个电极下移进入溶液，并靠近细胞。</li>
	<li>将安培电极置于细胞旁（左侧），膜片电极置于右侧。</li>
	<li>使用膜片电极在细胞上形成吉欧姆（gigaohm）密封。通过抽吸破裂密封，以获得全细胞记录构型。</li>
	<li>使含多巴胺的内液在细胞内透析 5–8 分钟。</li>
	<li>采用所需的电压阶跃或电压斜坡方案。在通过膜片电极控制膜电位的同时，同步采集膜片移液管和安培电极的数据，以测量全细胞电流以及多巴胺通过多巴胺转运体的逆向转运。</li>
</ol>

<ol><li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li>
<li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li>
<li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li>
<li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na%2B-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li>
<li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li>
<li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li>
<li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382(2010).</li>
<li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

同时进行电压钳和安培法具有以下优点：所有细胞类型均可获取并用于记录，且记录所用细胞或神经元的鉴定简单直接。特别是当目标蛋白带有荧光标记时，实验者可轻松选择特定的靶细胞或神经元。该实验配置可通过膜片钳电极或向灌流液中添加药物，实现药理学试剂的均匀且可控递送10。同时进行的膜片钳-安培法技术可在控制细胞膜 电位的同时，以毫秒级时间分辨率研究不同离子通道和转运体对可氧化递质释放的影响。此类信息无法通过生化方法获得8。该方法的一个独特之处在于，可通过膜片钳电极进行透析，从而调控细胞内环境7,11。然而，该技术的缺点在于安培检测电极仅能检测可氧化的递质。此外，当存在大量基础性或自发释放的可氧化物质时，安培电极的灵敏度会下降；因此，例如在预先加载可自发释放的可氧化化合物后检测释放情况，可能导致氧化电流降低。该技术的主要缺点是需要较高的技术熟练度和昂贵的设备。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>带法拉第笼的防震台</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>63-500 系列</td><td>我们使用型号 63-543</td></tr><tr><td>尼康 TE-2000 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>已停产</td><td>现为 Eclipse Ti</td></tr><tr><td>两台低噪声放大器 Axopatch 200B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5577</td></tr><tr><td>1-CV 203 BU 探头</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5578</td></tr><tr><td>1-HL-U 玻璃微电极夹</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5579</td></tr><tr><td>Digidata 1440A 模数转换器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5580</td></tr><tr><td>两台 Siskiyou 操纵器（左、右手型）</td><td>Siskiyou</td><td>MX6600R MX6600L</td><td>877-313-6418</td></tr><tr><td>激光微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>888-883-0128</td></tr><tr><td>低噪声碳纤维安培电极</td><td>ProCFE</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dagan.com&quot; target=&quot;_blank">www.dagan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>低噪声石英移液管</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-70-7.5</td><td>888-883-0128</td></tr><tr><td>12 伏汽车蓄电池</td><td></td><td></td><td>广泛可得</td></tr><tr><td>汽车蓄电池充电器</td><td></td><td></td><td>广泛可得</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>右旋葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁 (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙 (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0)</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0)</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr></tbody></table>

同时进行电压钳制与安培法的单细胞多巴胺释放测量

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

多巴胺释放到突触间隙后，通过作用于其突触前和突触后靶点发挥生物学效应1。多巴胺信号的终止依赖于扩散2-3、细胞外酶4以及膜转运体5。位于多巴胺神经元突触周围间隙的多巴胺转运体可通过内向多巴胺流（摄取）清除释放的胺类物质。该多巴胺转运体也可反向工作，将胺类物质从细胞内释放至细胞外，此过程称为多巴胺的外向转运或外排5。二十多年前，Sulzer et al. 报道了多巴胺转运体可呈现两种活性模式：正向（摄取）和反向（外排）5。通过转运体介导的外排所释放的神经递质可将大量多巴胺输送至细胞外空间，并已被证明在细胞外多巴胺稳态调控中发挥重要作用6。本文介绍如何在控制膜电位的条件下，利用同时进行的膜片钳与安培法记录，以毫秒级时间分辨率测量通过外排机制释放的多巴胺。具体方法为使用Axopatch 200B放大器（Molecular Devices，全细胞电流记录时低通贝塞尔滤波器设置为1,000 Hz）同时测量全细胞电流和氧化（安培）信号。安培法记录时，将一根碳纤维电极连接至第二个放大器（Axopatch 200B），并置于质膜附近，电极电位维持在+700 mV。可同步记录全细胞电流和氧化（安培）电流，并通过电压阶跃方案生成电流-电压关系曲线。与通常需要转换为浓度的安培法校准不同，本方法直接报告电流值，而不考虑有效体积7。因此，所得数据代表多巴胺外排的下限值，因为部分递质会损失至主体溶液中。

联合膜片钳与安培法可测量电压依赖性多巴胺转运体（DAT）介导的多巴胺（DA）外排。图2A展示了当细胞内环境和膜电位由全细胞膜片钳电极固定时，DAT介导的DA外排的代表性实验装置及记录结果。利用该技术，表达YFP-DAT蛋白的细胞通过全细胞膜片钳电极进行电压钳制，同时将安培电极置于质膜表面（图2A）。全细胞电极内填充含有2 mM DA的灌注液。接触质膜的安培电极维持在+700 mV，该电位高于DA的氧化还原电位。DAT介导的电流（全细胞电流—图2C，安培电流—图2D）通过将全细胞电极的膜电位从钳制电位-40 mV阶跃至-60至+100 mV之间进行记录（图2B）。为确定特异性DAT介导的DA外排，可在无或有DAT拮抗剂存在下分别记录安培电流。DAT介导的安培电流通过将含有DAT拮抗剂时记录的电流轨迹从无拮抗剂时的安培轨迹中减去而获得。安培电流中向上的偏转（正向偏转，图2D）对应于DA的外向流动。将碳纤维电极移离膜片区域会导致氧化反应信号变...

安培法通过检测多巴胺自发氧化产生的氧化电流，来测量单个细胞释放的多巴胺。同时采用电压钳制与安培法技术，可揭示多巴胺转运体的整体“活性”与其对多巴胺逆向转运调控作用之间的机制关系。

多巴胺释放到突触间隙后，通过作用于突触前和突触后靶点发挥其生物学效应¹。多巴胺信号的……

本实验的目的是通过同时采用膜片钳技术和荧光测温法，在电压钳制的神经元中测量多巴胺转运蛋白（DAT）介导的多巴胺逆向转运。首先需利用多巴胺检测荧光测温电极的完整性，随后将荧光测温电极置于细胞附近，并使用膜片钳电极对神经元实现全细胞记录模式。接下来，使用膜片钳电极控制细胞的电压，同时利用热电极记录由细胞释放的、经多巴胺转运体（DAT）介导的多巴胺信号。最后一步是加入DAT阻断剂，再次记录全细胞电流和热电极电流，从而通过差减法获得特异性由多巴胺转运体介导的电流。该技术的重要意义在于能够在实时控制多巴胺能神经元电压的同时，检测通过多巴胺转运体介导的多巴胺逆向转运过程。同时进行膜片钳和测压记录的系统需要配备优质微分干涉差（DIC）光学系统和长工作距离物镜的倒置显微镜，以产生系统的直流光源。为降低电噪声，将显微镜的照明装置连接至汽车蓄电池。使用液压显微操作器是因为在本系统的配置中，它们对噪声水平的影响可忽略不计。使用右手操作器进行电压钳和全细胞记录，左手操作器用于测温。为准备全细胞记录电极，需使用P 2000拉制仪拉制石英移液管。通常，我们使用电阻为3至4兆欧姆的移液管。接下来，用含有1毫摩尔多巴胺的移液管溶液填充电极。然后将其安装到右侧操纵器的移液管固定器上。确保将盛有多巴胺移液管溶液的容器用铝箔包裹，并在不使用时置于冰上保存。由于多巴胺具有可氧化性，将溶液置于冰上并避光保存可降低其氧化速率。将银丝穿入电极 holder 中，然后将安培参数适配器旋入电极 holder。接着，向三电极体系中加入足量汞，使其与银丝接触。将电极安装到适配器时，务必在显微镜下检查 pro CFE 低噪声碳纤维和参数电极，确保尖端清洁且完好无损。操作时应握住碳纤维的远端，以保护碳纤维尖端免受损伤。然后安装 pro CFE Tric 电极。随后将组装好的电极安装到左侧液压操纵器上，以检测三电极体系的完整性。将其浸入盛有外部溶液的玻璃底培养皿中。在无多巴胺的条件下记录基线电流。然后向培养皿中加入 10 µL 的 1 毫摩尔多巴胺溶液。一个性能良好的安培电极应记录到氧化电流的增加。务必在实验前后检查安培电极的完整性。在此步骤中，从培养箱中取出置于玻璃底培养皿中的多巴胺能神经元或经基因工程改造表达多巴胺转运体的细胞。用预热的外部溶液轻轻洗涤细胞或多巴胺能神经元三次。为观察细胞并进行实验，将玻璃底培养皿安装到显微镜载物台上，并调节至合适的焦平面，以清晰观察细胞。接着，向膜片电极施加正压。使用1毫升注射器，轻轻将两个电极通过显微操作器下降至溶液中，并靠近细胞。然后将参比电极置于细胞左侧，膜片电极置于细胞右侧。当膜片电极接触细胞时，通过嘴或注射器施加轻微负压，以在细胞上形成吉欧封接。随后，通过负压破裂封接，实现全细胞记录模式，并等待五到八分钟，使含多巴胺的内液充分透析进入细胞内。然后通过移液管从负40毫伏的钳制电位开始，将细胞膜电压在负60至正100毫伏之间进行阶跃，记录多巴胺转运体（DAT）介导的电流。为确定特异性的DAT介导的多巴胺转运，需在无和有DAT拮抗剂存在的情况下分别记录电化学计量电流。特异性的DAT介导的净电流通过将含有DAT拮抗剂时记录的电流轨迹从无拮抗剂时记录的电化学计量轨迹中减去而获得。三相电流中的向上偏转对应于此处所示的多巴胺外向流。通过在细胞膜电压从保持电位负40毫伏逐步改变20毫伏（范围从负60毫伏至正100毫伏）的条件下记录由DAT介导的电流，记录时微电极内含2毫摩尔多巴胺，采用全细胞膜片钳模式。此处为与全细胞电流同时获取的电化学电流。观看本视频后，您应该能够充分理解如何在电压钳制的神经元中测量多巴胺通过多巴胺转运体的逆向转运。请务必在实验前后检查参数电极的完整性，并切记将无拮抗剂时记录的轨迹减去在拮抗剂存在下记录的轨迹。

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单细胞的多巴胺释放，同时电压钳和电流分析法测量

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一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法

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