单细胞的多巴胺释放，同时电压钳和电流分析法测量

本实验的目的是通过同时采用膜片钳和焦测法测量多巴胺转运体（DAT）介导的多巴胺释放，来测定在电压钳制条件下的神经元中多巴胺的逆向转运。该目标首先通过多巴胺检测焦测电极的完整性来实现；第二步是将焦测电极置于细胞附近，并使用膜片钳电极对神经元形成全细胞记录模式。

接下来，使用膜片钳电极控制细胞的电压，同时利用热电极记录由多巴胺转运体（DAT）介导的细胞释放的多巴胺。最后一步是加入DAT阻断剂，再次记录全细胞电流和热电极电流，从而通过差减法获得特异性由多巴胺转运体介导的电流。该技术的重要意义在于能够在同时控制多巴胺能神经元电压的条件下，测量多巴胺通过多巴胺转运体的逆向转运过程。

同时进行膜片钳和压力记录的系统需要配备优质微分干涉差（DIC）光学器件和长工作距离物镜的倒置显微镜，以产生系统的直流光源。为降低电噪声，将显微镜的照明系统连接至汽车蓄电池。本实验采用液压微操纵器，因其在本系统配置中对噪声水平的影响可忽略不计。

使用右手操纵器进行电压钳和全细胞记录，左手操纵器用于测温。为准备全细胞记录电极，需使用P 2000拉制仪拉制石英移液管。通常，我们使用电阻为3至4兆欧姆的移液管。

接下来，用含有1毫摩尔多巴胺的移液管溶液填充电极。然后将其安装到右侧操纵器的移液管固定器上。确保将盛装含多巴胺移液管溶液的容器用铝箔包裹，并在不使用时置于冰上保存。

由于多巴胺具有可氧化性，将溶液置于冰上并避光保存可降低其氧化速率。将银丝穿入电极 holder 中，然后将安培参数适配器旋入电极 holder。接着，向三电极体系中加入足量汞，使其与银丝接触。

将电极安装到适配器时，务必在显微镜下检查 pro CFE 低噪声碳纤维和参数电极，确保尖端清洁且完好无损。操作时应握住碳纤维的远端，以保护碳纤维尖端免受损伤。然后安装 pro CFE Tric 电极。

随后将组装好的电极安装到左侧液压操纵器上，以检查三电极系统的完整性。将其浸入含有外部溶液的玻璃底培养皿中。在无多巴胺的情况下记录基线电流。

然后向培养皿中加入 10 µL 的 1 毫摩尔多巴胺溶液。一个性能良好的安培电极应记录到氧化电流的增加。务必在实验前后检查安培电极的完整性。

在此步骤中，从培养箱中取出置于玻璃底培养皿中的多巴胺神经元或经基因工程改造以表达多巴胺转运体的细胞。用预热的外部溶液轻轻洗涤细胞或多巴胺神经元三次。为观察细胞并进行实验，将玻璃底培养皿安装到显微镜载物台上，并调整至合适的焦平面，以清晰观察细胞。

接下来，对膜片电极施加正压。使用1毫升注射器，轻轻将两个电极通过显微操作器下降至溶液中，并靠近细胞。然后将参比电极置于细胞左侧，膜片电极置于细胞右侧。

当膜片电极接触细胞时，通过口吸或注射器施加轻微负压，以在细胞上形成吉欧封接。随后，通过负压破裂封接，实现全细胞记录构型，并等待五至八分钟，使含多巴胺的胞内溶液充分透析进入细胞。

然后通过记录电极在保持电位为 -40 mV 的条件下，将细胞膜电压从 -60 mV 阶跃至 +100 mV，记录多巴胺转运体（DAT）介导的电流。为确定特异性 DAT 介导的多巴胺流，需在无 DAT 拮抗剂和存在 DAT 拮抗剂的情况下分别记录容积电流。特异性 DAT 介导的净电流通过将无拮抗剂时记录的容积电流减去存在 DAT 拮抗剂时记录的电流轨迹来确定。

三相电流中的向上偏转对应于此处所示的多巴胺外向流。通过在全细胞膜片钳模式下，将膜电压从保持电位负40毫伏逐步改变20毫伏，在负60至正100毫伏之间记录到由多巴胺转运蛋白（DAT）介导的电流，此时移液管内含有2毫摩尔的多巴胺。此处为同时采集的电化学电流与全细胞电流。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何在电压钳制的神经元中测量多巴胺通过多巴胺转运体的逆向转运。请务必在实验前后检查参数电极的完整性，并切记将使用拮抗剂时记录的曲线从未使用拮抗剂时记录的原始曲线中扣除。