监视依赖黄素单加氧酶和氧化还原半反应，用停流分光光度法
March 18th, 2012
我们描述了一停流仪器的使用调查还原和氧化半反应曲霉一个铁载体（SIDA），黄素依赖型单加氧酶。然后，我们显示相应的在思达反应的物种的光谱，并计算其形成的速率常数。
该程序使用停流仪器检测 SID A 的不同光谱形式并测量速率。SID A 催化的反应可分为 FAD 的还原半反应和氧化半反应。氧化的黄素与 N-A-D-P-H 结合并反应形成还原黄素和 NADP，加上分子氧的反应和鸟氨酸的结合导致 C 4 的形成。
一种羟基黄素 鸟氨酸羟基化后，羟基黄素脱水形成氧化酶。NA DP plus 在整个催化循环中保持结合，是最后释放的底物。停流仪有助于快速混合小体积反应物和记录。
物质损失分光光度计随时间的光谱变化允许测量形成速率和酶催化反应的速率，特别是瞬时中间体的形成速率。我实验室的两名成员 Rita Robinson 和 Enviro Romero 将使用风味单加氧酶的集合 A 作为模型系统来演示这些实验。将 250 mL 100 mL磷酸钾缓冲液倒入装有搅拌棒的 500 mL Buchner 烧瓶中。
用橡胶塞密封烧瓶，然后将其放在搅拌板上，并将烧瓶的短管连接到 sch 侧面线。在室温下搅拌，在真空下对缓冲液脱气 1 小时，然后用 argonne 冲洗。重复 5 次。
最后用 Argonne 冲洗培养瓶 10 秒钟。断开烧瓶与真空装置的连接，并将其放入手套箱内。打开培养瓶继续剧烈搅拌。
用每毫升 18.13 单位的葡萄糖氧化酶和 100 毫摩尔葡萄糖溶液填充储液槽注射器。现在将驱动阀设置到负载位置。填充驱动器注射器。
接下来，将 F 阀转到驱动位置。使用 pro 数据控制软件，单击清空停止注射器，然后通过手动升高相应的驱动柱塞，将缓冲液从驱动注射器 F 推过流动回路。继续用其他三个驱动注射器平衡一小时。
现在重新填充储液槽注射器并重复冲洗停止流动系统。制备氧饱和缓冲液。将溶液与 100% 氧气一起搅拌 1 小时。
然后从样品瓶中取出短针并等待 10 秒钟。继续取出长针，将封闭的小瓶放入手套箱中。对于 N-A-D-P-H 解决方案。
将含有 1 毫克 N-A-D-P-H 的 1.5 毫升 einor 管放入手套箱中。溶于 300 μL 厌氧、100 毫摩尔磷酸钾缓冲液中。pH 值 7.5。
取出 30 微升以确定 N-A-D-P-H 浓度。现在，为了去除酶原液中的氧气，将溶液转移到一个 25 毫升的小瓶中，该小瓶中包含一个带有小麦和塞子的搅拌棒盖以及铝密封件。置于冰上。
连接到 schlink 管线，然后通过真空脱气 20 分钟，然后用 argonne 冲洗。最后，用 Argonne 冲洗样品瓶 10 秒钟，然后将其与真空装置断开。将样品瓶放在手套箱内的冰上。
在 pro 数据控制软件的控制面板窗口中。选择光电二极管阵列、外部触发和对数刻度。同时启动 pro data viewer 软件并定义数据文件存储目录。
现在用 pH 7.5 的厌氧 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液更换储液芯注射器 C 和 F 中的溶液。将 C 和 F 阀转到驱动位置。在 pro 数据控制软件中单击清空止动注射器。
然后通过手动升高相应的驱动柱塞，将缓冲液从两个驱动注射器推过流动回路。用储液式注射器 C 和 F 重复冲洗 3 次。为确保从流路中完全去除葡萄糖氧化酶，请继续单击 pro 数据控制软件中的基线。
用酶溶液替换储液注射器 F 的溶液。将 F 阀转到驱动位置。在 pro 数据控制软件中单击清空止动注射器。
通过手动升高相应的驱动柱塞，将来自驱动注射器 F 的酶溶液推过流动回路。返回 pro 数据控制软件，将采集时间设置为 60 秒。验证两个驱动注射器是否都填充了相应的溶液，并且驱动柱塞是否与驱动注射器接触。活塞。
将两个阀转到驱动位置，然后单击 pro 数据控制软件中的 acquire 以执行驱动。使用从驱动器获得的 A 4 52 纳米值一式三份获取酶氧化形式的光谱数据。混合前测定酶浓度，并制备 4 毫升 N-A-D-P-H 溶液。
将 N-A-D-P-H 溶液加注 1.5 倍浓缩的储液槽注射器 C，然后清空并重新填充止动注射器，如前所述 3 次。现在，使用厌氧 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液 pH 7.5 从流路中减少酶冲洗内容物时获取光谱。现在单击 pro 数据控制软件中的基线。
然后将 200 微升酶储备液与 1000 微升厌氧、100 毫摩尔磷酸钾缓冲液混合。pH 值 7.5。用酶溶液替换储液注射器 A 的溶液。
将 A 阀转到 pro 数据控制软件中的驱动位置。单击停止注射器为空。通过手动升高相应的驱动柱塞，将来自驱动注射器 A 的酶溶液推过流动回路。
将延迟时间设置为 0.5 秒，将采集时间设置为 60 秒。确认所有驱动注射器都装满了相应的溶液，并且驱动柱塞与驱动注射器活塞接触。然后将所有驱动阀转到驱动位置，然后单击专业数据控制软件中的获取。
一式三份获得酶氧化形式的光谱数据。接下来，用 N-A-D-P-H 溶液替换储液罐注射器 B 的溶液。浓度比注射器中的酶溶液高 1.5 倍 A.将 B 阀转到驱动位置，排空并重新填充停止注射器 3 次，如前面的控制面板窗口中所示。
将延迟时间设置为 0.5 秒。在 20 秒时采集，用含氧缓冲液更换储液罐注射器 sea 的溶液。将 C 阀转到驱动位置。
在 pro 数据控制软件中刷新 3 次。将延迟时间设置为 15 秒，将采集时间设置为 900 秒。在停流仪器中完全还原的酶再氧化期间继续获取光谱。
可以通过在此处使用 452 的吸收剂测量黄素氧化还原状态来监测 SID A 与 N-A-D-P-H 的厌氧还原。记录从氧化的 SID A 到完全还原的 SID A 的最后一个谱图随时间的变化，该酶促步骤的速率可以通过将数据拟合到适当的方程来确定。氧化速率和反应中间体也可使用AF Sid A在该反应中停止流的双重混合模式测定，C四A氢xi黄素中间体的λ最大值为3 80纳米，氧化酶的λ最大值为450纳米。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四到六个小时内完成。请记住确保溶液是厌氧的。看完这个视频后，你应该对如何研究 FLA 非依赖性单体的相对离子和溃疡离子有一个很好的了解，进一步的下游实验，如快速化学。
Quentin 可以帮助阐明中间体的悲惨本质。
概述
本研究利用停流仪器分析Aspergillus fumigatus侧链载体A（SidA）的还原和氧化半反应，这是一种黄素依赖性单氧化酶。研究包括反应中间体的光谱分析和形成的速率常数计算。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 酶学
- 光谱学
背景
- Aspergillus fumigatus是一种重要的真菌病原体。
- 侧链载体A（SidA）在铁获取中起着至关重要的作用。
- 黄素依赖性单氧化酶对各种生化反应很重要。
- 了解反应机制可以帮助开发抗真菌策略。
研究目的
- 研究SidA的反应机制。
- 测量反应中间体的速率常数。
- 提供对黄素依赖性酶催化循环的洞察。
使用的方法
- 停流光谱学用于快速混合和光谱分析。
- 为酶反应制备厌氧条件。
- 测量随时间的光谱变化以确定反应动力学。
- 使用特定的缓冲液和试剂来促进反应。
主要结果
- 识别反应过程中SidA的不同光谱形式。
- 计算反应中间体形成的速率常数。
- 展示涉及NADP和氧气的催化循环。
- 表征反应路径中的瞬时中间体。
结论
- 停流技术对于研究酶动力学是有效的。
- 获得的见解可以为未来关于黄素依赖性酶的研究提供信息。
- 研究结果有助于理解真菌代谢。
常见问题
Executive Industry Relevance
Stopped-flow spectrophotometry enables precise kinetic dissection of flavin-dependent monooxygenase reactions, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By resolving reductive and oxidative half-reactions and quantifying transient intermediates, this approach enhances predictive confidence for enzyme-targeted portfolios. The method's adaptability to other flavin-dependent systems positions it as a reusable capability for biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of intrinsic rate constants for mechanistic hypothesis testing.
- Supports identification and characterization of catalytic intermediates for functional target validation.
- Facilitates biological de-risking by clarifying enzyme reaction pathways.
- Improves predictive confidence for advancing enzyme targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated spectral readouts for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative tracking of enzyme redox states for reliable compound evaluation.
- Supports preparation of robust biological systems for downstream screening workflows.
- Allows platform reuse across flavin-dependent monooxygenase targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic insights with disease-relevant enzyme systems when applicable.
- Ensures continuity from discovery-stage kinetic validation to preclinical model selection.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying catalytic mechanisms.
- Supports translational biomarker development through quantitative intermediate detection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing mechanistic clarity before preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving reductive and oxidative half-reactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spectral outputs for assay readiness.
- Analytics: Enables measurement of rate constants and detection of transient intermediates for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical model selection when enzyme targets are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to other flavin-dependent monooxygenases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and kinetic data analysis.
- Needs access to stopped-flow spectrophotometry and anaerobic handling infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer preparation and instrument calibration.
- Adaptable to various flavin-dependent monooxygenase systems with appropriate optimization.
- Dependent on maintaining strict anaerobic conditions for accurate half-reaction measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
