利用停流分光光度法监测黄素依赖性单加氧酶的还原与氧化半反应

本实验采用停流装置检测 SID A 的不同光谱形式并测定反应速率。SID A 催化的反应可分为 FAD 的还原半反应和氧化半反应。氧化型黄素与 NADPH 结合并反应生成还原型黄素和 NADP⁺；分子氧的反应及鸟氨酸的结合导致 C4 的生成。

鸟氨酸羟基化后生成羟基黄素，该羟基黄素脱水形成氧化态酶。NADP⁺在整个催化循环中保持结合状态，并且是最后释放的底物。停流装置可实现反应物小体积的快速混合并进行记录。

随时间变化的光谱变化可使人们利用停流分光光度法测量酶催化反应中瞬时中间产物的生成速率。我实验室的两位成员 Rita Robinson 和 Enviro Romero 将以对香兰素单加氧酶为模型系统演示这些实验。将 250 毫升 100 毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液倒入含有搅拌子的 500 毫升布氏烧瓶中。

用橡胶塞密封烧瓶，然后将其置于搅拌台上，将烧瓶的短管连接至Schlenk管线。在室温下对缓冲液进行抽真空脱气1小时，同时持续搅拌，随后用氩气吹扫。重复此过程五次。

最后用氩气冲洗烧瓶10秒。将烧瓶从真空歧管上拆下并放入手套箱中。保持烧瓶敞口，继续剧烈搅拌。

用每毫升18.13单位的葡萄糖氧化酶和100毫摩尔的葡萄糖溶液填充储液器注射器。现在将驱动阀设置为加载位置。填充驱动注射器。

接下来，将 F 阀门转至驱动位置。使用 Pro Data 控制软件，点击排空停止注射器，然后通过手动提升相应的驱动活塞，将缓冲液从驱动注射器 F 经流路推送。继续对其他三个驱动注射器进行操作，平衡一小时。

现在重新填充储液器注射器，并重复冲洗停止流动的系统。为制备饱和氧气缓冲液，将溶液在搅拌条件下通入100%氧气鼓泡一小时。

然后从药瓶上取下短针头，等待10秒。接着取下长针头，并将密封的药瓶放入手套箱中。适用于N-A-D-P-H溶液。

将含有1毫克N-A-D-P-H的1.5毫升离心管放入手套箱中。加入300微升无氧的100毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7.5）溶解。

取 30 微升用于测定 NADPH 浓度。接下来，为去除酶储备液中的氧气，将溶液转移至含有搅拌子、带隔垫和橡胶塞以及铝盖的 25 毫升小瓶中。置于冰上。

连接至施兰克线，然后在真空条件下脱气20分钟，再用氩气吹扫。最后，用氩气冲洗样品瓶10秒，并将其从真空歧管上断开。将样品瓶置于手套箱内的冰上。

在 pro data 控制软件的控制面板窗口中，选择光电二极管阵列、外部触发和对数刻度。同时启动 pro data 查看器软件，并定义数据文件的存储目录。

现在将储液器注射器 C 和 F 中的溶液更换为无氧的 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7.5）。将 C 和 F 的阀门转至驱动位置。在 Pro Data 控制软件中点击排空停止注射器。

然后通过手动升高相应的驱动活塞，将缓冲液从两个驱动注射器推入流路中。再使用储液注射器 C 和 F 重复冲洗三次。为确保彻底清除流路中的葡萄糖氧化酶，请继续在 pro data 控制软件中点击基线（baseline）。

将储液器注射器 F 中的溶液更换为酶溶液。将 F 阀转向驱动位置。在 Pro Data 控制软件中点击排空停止注射器。

通过手动抬升相应的驱动活塞，将驱动注射器 F 中的酶溶液推入流路。返回 pro data 控制软件，将采集时间设置为 60 秒。确认两个驱动注射器均已装入对应的溶液，并且驱动活塞已与驱动注射器的活塞接触。

将两个阀门均转至驱动位置，然后在Pro Data控制软件中点击“采集”以执行驱动。利用驱动获得的452纳米处的A值，重复三次测定酶氧化形式的光谱数据。在混合前确定酶的浓度，并配制4毫升NADPH溶液。

用N-A-D-P-H溶液将填充储液器注射器C的浓度提高至1.5倍，并像之前所示那样将停止注射器排空并重新填充三次。现在，在酶被还原的过程中采集光谱，并用无氧的100毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7.5）冲洗流路中的内容物。接着，点击Pro Data控制软件中的基线按钮。

然后将200微升酶储备液与1000微升无氧的100毫摩尔磷酸钾缓冲液混合，pH 7.5。将储液器注射器A中的溶液替换为酶溶液。

在 Pro Data 控制软件中将 A 阀转至驱动位置。单击停止注射器排空。通过手动提升相应的驱动活塞，将酶溶液从 A 驱动注射器推过流路系统。

将延迟时间设置为0.5秒，采集时间设置为60秒。确认所有驱动注射器均已装入相应的溶液，且驱动推杆与驱动注射器的活塞接触。然后将所有驱动阀门转至驱动位置，在Pro Data控制软件中点击采集。

以三份平行样获取酶氧化形式的光谱数据。接着，将储液器注射器 B 中的溶液更换为 N-A-D-P-H 溶液，其浓度为注射器 A 中酶溶液浓度的 1.5 倍。将 B 阀门转至驱动位置，并如先前在控制面板窗口中所示，对停流注射器进行三次排空和重新填充。

将延迟时间设置为 0.5 秒。在 20 秒时进行采集，将储液器注射泵中的溶液更换为充氧缓冲液。将 C 阀转向驱动位置。

在 pro 数据控制软件中冲洗三次。将延迟时间设置为 15 秒，采集时间设置为 900 秒。在停流仪中继续采集完全还原酶重新氧化过程中的光谱。

利用452 nm处的吸收值监测黄素氧化还原状态的变化，可追踪SID A在NADPH作用下的厌氧还原过程。通过记录从氧化态SID A到完全还原态SID A的最终光谱随时间变化的光谱数据，可确定该酶促反应步骤的速率，方法是将数据拟合至适当的方程。此外，通过停流装置的双混合模式，还可测定AF Sid A反应中的氧化速率及反应中间产物。其中，C4a-羟基黄素中间体的λmax为380纳米，可被明确检测到，而氧化态酶的λmax为450纳米。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在四到六小时内完成。请务必确保溶液处于厌氧状态。观看本视频后，您应能充分理解如何进一步开展针对自由生活阿米巴（FLA）相对丰度及溃疡性离子的下游实验，例如快速化学分析。

Quentin 可以帮助阐明这些中间体的不稳定性质。