Name: 人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）用绿色荧光蛋白逆转录病毒载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 了解利用GFP逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导多能干细胞的方法。该技术通过荧光标记实现iPSC克隆的高效筛选与鉴定，为干细胞生物学和再生医学研究提供可靠工具。

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本工作由耶鲁医学院和查尔斯·胡德基金会的儿童健康研究奖资助。

1. 通过表达重编程因子的逆转录病毒进行重编程
<ol>
 <li>在成纤维细胞培养基（含10%胎牛血清及青霉素/链霉素的DMEM）中培养人成纤维细胞。</li>
 <li>感染前一天，将1×105个人成纤维细胞接种至6孔板的一个孔中。</li>
 <li>吸除培养基以去除死细胞，加入2 ml新鲜成纤维细胞培养基，并加入硫酸鱼精蛋白至终浓度为5 μg/ml。</li>
 <li>小心加入适量的表达GFP的病毒，使感染复数（MOI）为55。</li>
 <li>感染后一天，移除病毒上清液，用2 ml PBS洗涤三次，然后加入2 ml成纤维细胞培养基。</li>
 <li>感染后三天，观察GFP荧光，并补充2 ml成纤维细胞培养基。</li>
 <li>感染后四天，将经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层细胞以1×104 /cm2的密度接种于已涂有0.1%明胶的10 cm培养皿中，使用成纤维细胞培养基，37 °C过夜培养。</li>
 <li>感染后五天，用1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37 °C消化5分钟，使感染的人成纤维细胞脱落，200 g离心5分钟。吸除上清液，用10 ml成纤维细胞培养基重悬细胞，转移至预先包被的10 cm培养皿中。</li>
 <li>24小时后，更换为hESC培养基（含20% Knock-Out血清替代物、DMEM/F12、0.1 ml非必需氨基酸、4 ng/ml bFGF、青霉素/链霉素/谷氨酰胺、β-巯基乙醇），每日更换培养基。感染后第20至27天开始出现类似胚胎干细胞的克隆。</li>
</ol>
2. 诱导多能干细胞的分离与扩增
<ol>
 <li>在荧光显微镜下检查具有类似人胚胎干细胞形态的克隆是否无GFP荧光。</li>
 <li>使用10 μl移液器挑取单个诱导多能干细胞克隆，并将其放入经明胶和小鼠胚胎成纤维细胞包被的12孔板中的一个孔内，加入人胚胎干细胞培养基。每日更换培养基。</li>
 <li>传代时，用1 ml DMEM/F12洗涤孔板，然后加入0.5 ml胶原酶，在37 °C孵育10分钟。</li>
 <li>用DMEM/F12洗涤细胞两次。</li>
 <li>加入2 ml新鲜人胚胎干细胞培养基。使用细胞刮将克隆消化成小块，并使残留细胞从孔板上脱落。</li>
 <li>将重悬的克隆小块转移至经明胶和小鼠胚胎成纤维细胞包被的6孔板中的一个孔内。</li>
</ol>
3. 多能性标志物的免疫荧光分析
<ol>
 <li>用 PBS 洗涤细胞三次，室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。</li>
 <li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次，加入含 0.2% Triton X-100 的 PBS 室温孵育 30 分钟以进行通透处理。</li>
 <li>用含 3% BSA 的 PBS 室温孵育细胞 2 小时，以封闭非特异性结合位点。</li>
 <li>加入一抗，4 °C 条件下孵育过夜。</li>
 <li>用 PBS 洗涤细胞三次，避光条件下加入特异性二抗，室温孵育 1 小时。</li>
 <li>用 PBS 洗涤细胞三次，在最后一次洗涤时加入 DAPI，室温孵育 5 分钟。</li>
 <li>使用荧光显微镜检测染色结果。</li>
</ol>
4. 多能性标志物的定量实时 PCR 检测
<ol>
 <li>使用Qiagen的RNeasy试剂盒从人成纤维细胞来源的人诱导多能干细胞（iPSCs）中提取总RNA。</li>
 <li>使用SuperScript II逆转录酶合成第一链cDNA。</li>
 <li>采用先前报道的引物进行qPCR检测多能性基因。6</li>
</ol>
5. 代表性结果
<ol>
 <li>重编程过程中的形态学变化 
 我们使用携带OCT4、SOX2、KLF4和MYC的逆转录病毒混合物感染人成纤维细胞BJ1和Detroit 551，并能够观察到重编程过程中的形态学变化（图1）。感染后21天，我们可通过类似人胚胎干细胞（hESC）的形态识别出小型iPSC克隆。此外，我们还可通过GFP荧光来识别iPSC。多能干细胞（如ESCs和iPSCs）具有抑制前病毒基因表达的分子机制7-9。我们独特的逆转录病毒载体通过逆转录病毒LTR同时表达GFP和重编程基因。因此，持续表达GFP的细胞被认为存在转基因表达且未发生前病毒基因沉默。成功重编程并获得多能性分子网络的iPSC克隆则表现为无GFP表达（图2）10。 </li>
 <li>人iPSC多能性的表征 
 我们通过免疫组织化学方法，使用Tra-1-81、Tra-1-60、SSEA-4、SSEA-3、OCT4和NANOG抗体对来自Detroit-551成纤维细胞的克隆进行了分析（表2）。成功重编程的iPSC表达所有这些标志物（图3A）。我们还通过定量RT-PCR分析检测了基因表达。结果显示，与亲代成纤维细胞相比，OCT4、SOX2、KLF4、MYC和NANOG的表达显著升高，并与H9人胚胎干细胞（hESCs）的表达水平相当（图3B）。</li>
</ol>
<img alt="在显微镜装置下观察细胞培养图像，用于识别细胞生长和分化阶段。" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 感染逆转录病毒的人成纤维细胞的形态学变化。 （A-D）感染重编程因子的 Detroit-551 成纤维细胞克隆中逐步发生的形态学变化。第5天（A），第10天（B），第14天（C），第21天（D）。21天后，细胞呈现出类似人胚胎干细胞（hESC）的形态。
<img alt="显微镜和荧光成像中的细胞分化阶段；实验室设置中的分析" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 细胞重编程过程中代表性 GFP 荧光表达。 BJ 和 Detroit 551 成纤维细胞被表达四种重编程因子的逆转录病毒感染4，并在 hESC 培养基中培养四周。BJ 成纤维细胞（A, B）和 Detroit 551（C, D）表现出相似的形态学特征。从第 21 天开始，出现 GFP 阴性克隆，代表真正的诱导多能干细胞（iPSCs）10。（E, F）显示未完成正确重编程的转化 Detroit 551 细胞。（A, C, E）为相差显微镜下的克隆图像。（B, D）为正确重编程后显示 GFP 沉默的细胞。（F）为转化克隆中强烈的 GFP 荧光表达。
<img alt="干细胞标志物分析的免疫荧光染色结果和基因表达柱状图。" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 人诱导性多能干细胞的表征。 (A) 人 551-iPS-K1 细胞克隆表达多能细胞常见的标志物。DAPI 染色显示每个视野中的总细胞含量。(B) 对亲代成纤维细胞、551-iPS-K1 诱导性多能干细胞（iPSCs）以及 H9 人胚胎干细胞（hESCs）中 OCT4、SOX2、KLF4 和 MYC 的表达进行定量实时 PCR（RT-qPCR）分析。数据以 β-actin 看家基因为内参进行标准化，并相对于亲代成纤维细胞中的表达水平进行绘图4。

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
<li>Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin,, Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

表达四种转录因子可将人类成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）。为获得临床应用安全的iPSCs，研究人员已多次尝试采用非整合性或非遗传学方法来生成人类iPSCs。然而迄今为止，这些方法的效率极低，仍需进一步优化以提高可重复性11-14逆转录病毒或慢病毒方法常用于人iPSC的衍生与应用 体外 疾病模型，这类模型对病毒整合所引起的安全问题依赖性较低。本文所述的重编程方法可用于高效获得人诱导多能干细胞（iPSCs）。人iPSCs的筛选主要依据其克隆形态，该形态类似于人胚胎干细胞（ESCs）。更重要的是，本方法利用了逆转录病毒长末端重复序列（LTR）在多能干细胞中发生沉默的特性7,15本方案中使用的逆转录病毒载体包含通过内部核糖体进入位点（IRES）与重编程因子相连的GFP基因，以及5GFP 表达由前病毒 LTR 驱动。被这些病毒转导的成纤维细胞最初会表现出强烈的 GFP 表达。一旦重编程完成，诱导性多能干细胞（iPSCs）将失去 GFP 表达，这一变化可在荧光显微镜下清晰观察到。在本方案中，我们描述了从胎儿和新生儿成纤维细胞（Detroit 551 和...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80%</td></tr><tr><td>无血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20%</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（10 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇（14.3 M）或 MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表1. 培养基&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD 生物科学</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD 生物科学</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD 生物科学</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>明胶，猪源</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0.2%</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3%</td></tr><tr><td>MEF 饲养层细胞</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>康宁</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜：配备GFP滤光片的倒置显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表2. 试剂与仪器&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

利用携带gfp的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（ipscs）

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

人类胚胎干细胞（hESCs）具有多能性，是细胞治疗和再生医学中极为宝贵的细胞来源 体外 疾病建模与再生医学1. 既往研究已表明，通过异位表达四种转录因子，可将人类体细胞重编程为多能性状态（Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc）并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）2-4 与人类胚胎干细胞（hESCs）类似，人类诱导多能干细胞（iPSCs）具有多能性，是自体细胞移植的潜在来源。本文描述了利用包含绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒载体，将四种重编程因子导入人类成纤维细胞以实现重编程的实验方案。4采用以下方案，在人胚胎干细胞培养条件下，可在3-4周内生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）。人iPSC克隆在形态上与人胚胎干细胞（hESCs）极为相似，并因逆转录病毒转基因沉默而表现出绿色荧光蛋白（GFP）荧光信号的消失。在荧光显微镜下通过机械法分离的iPSC克隆，其生长特性与hESCs相似。在这些细胞中，我们检测到多种多能性基因及表面标志物的表达。

本文描述了一种通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和MYC异位表达来生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。同时还讨论了一种基于GFP表达识别人iPSC克隆的实用方法。

利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

人类胚胎干细胞（hESCs）具有多能性，是体外疾病建模和再生医学不可或缺的细胞资源¹。它具有……

本实验的总体目标是通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc过表达，并结合GFP报告系统，生成人类诱导多能干细胞（iPS细胞）。首先加入适量的表达GFP的单个逆转录病毒，随后将感染了GFP表达病毒的细胞转移至经0.1%明胶包被并含有小鼠胚胎成纤维细胞的培养板中。该实验步骤的第三步是用人类胚胎干细胞培养基替换原有培养基。最后，分离出GFP沉默的诱导性多能干细胞（iPS）克隆，这些克隆的形态与人类胚胎干细胞相似。最终结果通过免疫荧光染色和实时定量聚合酶链式反应（R-T-Q-P-C-R）显示内源性多能性标志物的表达。该技术相较于现有方法（如使用多能性表面标志物进行活体染色并观察形态学变化）的主要优势在于理想的 iPad。可通过 GFP 表达的丢失作为多能性细胞的标志，从而易于分离细胞克隆。开始培养时，在感染前一天将人成纤维细胞接种于成纤维细胞培养基中：将一乘以十的五次方个人成纤维细胞接种至六孔板的一个孔中；次日，吸除培养基以去除死细胞，并加入两毫升新鲜成纤维细胞培养基，其中含有每毫升五微克的硫酸鱼精蛋白。然后根据感染复数为五的要求，小心加入相应量的表达GFP的病毒。感染后一天，在37摄氏度下将细胞培养过夜。移除病毒上清液，用2毫升PBS洗涤三次。然后在感染后第三天加入 2 毫升成纤维细胞培养基。观察 GFP 荧光，并在次日补充 2 毫升成纤维细胞培养基。随后，将经照射的小鼠胚胎成纤维细胞或甲醇处理的饲养细胞以每平方厘米 1 × 10⁴ 个细胞的密度，接种于已包被 0.1% 明胶的 10 厘米培养皿中，培养基为成纤维细胞培养基。将细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，用1毫升0.05%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下处理5分钟，使感染的人成纤维细胞脱落，并在200 ×g下离心5分钟。用10毫升成纤维细胞培养基重悬细胞，并将细胞重新接种至预先用0.1%明胶和mfs包被的培养皿中，24小时后观察。更换为 HESC 培养基，并每天更换培养基。感染后 20 至 27 天，在荧光显微镜下观察到类似 ESC 的克隆出现。检查呈现类似 HSC 形态的克隆中是否无 GFP 荧光。使用10微升移液器，挑取单个IPSC克隆，并将其放入经明胶和甲醇酸包被的12孔板中的一个孔内，加入HESC培养基。每天更换培养基，通过加入一毫升DMEM/F12洗涤培养板来传代细胞。然后加入 0.5 毫升胶原酶，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。用 DMEM/F12 培养基洗涤细胞两次。接着，加入 2 毫升新鲜的 hESC 培养基。然后使用细胞刮将集落打散成小块，并从培养板上脱离剩余的细胞。将重悬的集落碎片转移至经明胶和MEF包被的六孔板中的一个孔内，在37摄氏度下孵育两天。通过免疫荧光检测细胞。用 PBS 洗涤细胞三次，室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。用 PBS 轻柔洗涤细胞三次，再用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 处理 30 分钟以进行透化。用含3% BSA的PBS孵育细胞两小时，以阻断非特异性结合。接着，在4°C条件下，将细胞与一抗共同孵育过夜。然后用PBS洗涤细胞三次，并在避光条件下室温孵育二抗一小时。在最后一次洗涤时，用 PBS 清洗细胞三次。加入 DAPI，室温孵育五分钟。使用荧光显微镜对细胞进行定量实时成像。采用RNA提取试剂盒从人成纤维细胞来源的人胰岛样细胞簇（IPCs）中提取总RNA。利用逆转录酶合成第一链cDNA。然后将其用作qPCR的模板，以检测多能性基因。图中显示的是感染了携带OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc的逆转录病毒混合物的人成纤维细胞BJ株，在重编程过程中第5、10、14和21天观察到的形态学变化。经过21天后，细胞开始呈现类似人胚胎干细胞（HESC）的形态，诱导性多能干细胞（IPCs）可通过GFP荧光识别。诸如 ESCs 和 IPCs 之类的多能干细胞表达能够抑制前病毒基因表达的分子机制。然而，此处所用的逆转录病毒载体通过逆转录病毒 LTR 表达 GFP 及重编程基因。因此，持续表达 GFP 的细胞被认为在不存在前病毒基因沉默的情况下表达外源基因；而如本处准确所示，获得多能性分子网络的重编程 iPSC 克隆则不表达 GFP。该图显示了利用抗体对来自底特律 5 51 成纤维细胞的克隆进行的免疫组织化学分析，所用抗体包括 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4、T4 和纳米抗体，结果清晰可见。重编程后的诱导性多能细胞（IPCs）表达所有这些标志物。此外，通过定量逆转录聚合酶链反应（R-T-P-C-R）分析基因表达，结果显示与亲代成纤维细胞相比，T4、SOX2、KLF4、M 和纳米基因的表达显著上调，且其表达水平与 H9 胚胎干细胞（HSCs）相当。观看本视频后，您应充分了解如何感染病毒，并通过荧光显微镜识别和挑选完全脂质编程的 IPA 细胞。

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人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）用绿色荧光蛋白逆转录病毒载体

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

尽管基因修饰技术已取得近期进展，人类胚胎干细胞（HESCs）的转染仍是一个不稳定的过程。据我们所知，目前尚未有报道关于系统性且高效转染人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。本文中，我们描述了高效转染和核转染人类iPSCs的可靠方案。...

转染和核转染人诱导性多能干细胞

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。...

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

通过TALEN介导的基因编辑技术对安全港AAVS1位点进行操作，可在人诱导多能干细胞（iPSCs）中实现高效的外源基因插入。本实验方案详细描述了为TALEN系统和供体质粒递送而准备iPSCs、转染iPSCs，以及筛选和分离iPSC单克隆细胞系的操作步骤，以实现绿色荧光蛋白（GFP）基因的靶向整合，从而构建报告细胞系。...

人类诱导性多能干细胞中利用TALEN技术将GFP基因靶向AAVS1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

了解利用GFP逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导多能干细胞的方法。该技术通过荧光标记实现iPSC克隆的高效筛选与鉴定，为干细胞生物学和再生医学研究提供可靠工具。

利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

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