人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）用绿色荧光蛋白逆转录病毒载体
2012年4月3日
的方法来产生人类诱导多能干细胞（iPS细胞）通过逆转录病毒介导的异位表达Oct4的，SOX2的，KLF4和MYC的描述。基于GFP的表达，以确定人类IPSC的殖民地一个切实可行的办法进行了讨论。
该程序的总体目标是通过使用 GFP 报告基因系统逆转录病毒介导的 OCT 4、SOX 2K LF 4 和 M 过表达来生成人 IPS 细胞。这是通过首先添加适量的表达逆转录病毒的单个 GFP 来实现的。接下来，将表达 GFP 的病毒感染细胞转移到带有小鼠胚胎成纤维细胞的 0.1% 明胶包被的板中。
该程序的第三步是用人胚胎干细胞培养基替换培养基。最后，分离出表现出与人胚胎干细胞相似形态的 GFP 沉默 IPS 集落。最终，结果通过免疫荧光染色和 R-T-Q-P-C-R 显示内源性多能标志物的表达。
现有方法的这种技术的主要优势，如用多能表面标记物进行生活方式染色和观察形态变化，是理想的 iPad。使用 GFP 表达缺失作为多能细胞的标志物，可以很容易地分离细胞集落开始培养。感染前一天将成纤维细胞培养基中的人成纤维细胞接种一倍，将 10 至第五个人成纤维细胞放入六孔板的一个孔中，第二天吸出培养基以去除死细胞，并加入 2 毫升新鲜成纤维细胞培养基，每毫升硫酸鱼精蛋白 5 微克。
然后小心地加入适量的每种 GFP 表达病毒，对应于 5 的感染倍数。感染后 1 天将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。用 2 毫升 PBS 去除病毒上清液洗涤液 3 次。
然后在感染后 3 天加入 2 毫升成纤维细胞培养基。检查 GFP 荧光并用 2 毫升补充孔。成纤维细胞培养基第二天将每平方厘米 10 至 4 倍的辐照小鼠、胚胎成纤维细胞或甲基饲养细胞在成纤维细胞培养基中接种到涂有 0.1% 明胶的 10 厘米培养皿上。
将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，用 1 毫升 0.05% tripsin EDTA 在 37 摄氏度下分离感染的人成纤维细胞 5 分钟，然后在 200 G 下离心 5 分钟，将细胞重悬于 10 毫升成纤维细胞培养基中，并在预涂有 mfs 的 0.1% 明胶上重放细胞。24 小时后。
用 HESC 培养基替换培养基，并每天更换培养基。在荧光显微镜下出现 ESC 样菌落后，感染后 20 至 27 天将开始出现 ESC 样菌落。检查显示与 HSC 相似形态的菌落中是否存在 GFP 荧光。
使用 10 微升移液器。挑选单个 IPSC 集落，并将它们放入明胶和冰毒包被的 12 孔板的一个孔中，并补充有 HESC 培养基。更换培养基，每天用 1 ml DMM F 12 洗涤板，传代细胞。
然后加入 0.5 毫升胶原酶，在 10 摄氏度下孵育 37 分钟。用 DM A MF 12 洗涤细胞两次。接下来，加入 2 mL 新鲜的 HESC 培养基。
然后使用细胞提升器将菌落分解成小块，并将剩余的细胞从板中分离。将重悬的菌落片段转移到明胶和 MEF 包被的 6 个明胶孔中。孔板并在 37 摄氏度下孵育两天。
通过免疫荧光检查细胞。用 PBS 洗涤 3 次，并在室温下用 4% 异构醛固定 20 分钟。用 PBS 轻轻洗涤细胞 3 次，然后用 0.2%tritton X 100 的 PBS 溶液渗透细胞 30 分钟。
通过将细胞与 3% BSA 的 PBS 溶液孵育 2 小时来阻断非特异性结合。接下来，将细胞与一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。然后用 PBS 洗涤细胞 3 次，并在室温下避光与二抗孵育 1 小时。
在最后一次洗涤期间，用 PBS 洗涤细胞 3 次。加入 dappy 并在室温下孵育 5 分钟。使用荧光显微镜对细胞进行实时定量成像。
PCR 从人成纤维细胞来源的人 IPC 中分离总 RNA。使用 RNA 分离试剂盒。使用逆转录酶合成第一链 cDNA。
然后将其用作 QPCR 检测多能性基因的模板。人成纤维细胞，BJ 一，感染了携带 OCT 4、SOX 2、KLF 4 和 Mick 的逆转录病毒混合物，这是从第 5 天开始重编程期间观察到的形态变化。今天的 10 、 14 和 21 天后，细胞在 21 天后开始呈现类似 HESC 的形态，IPCs 被 GFP 荧光识别。
多能干细胞（如 ESC 和 IPC）表达抑制前病毒基因表达的分子机制。然而，这里使用的逆转录病毒载体表达 GFP 以及逆转录病毒 LTR 的重编程基因。因此，连续表达 GFP 的细胞被认为表达转基因而没有前病毒基因沉默，如此处所示，获得多能性分子网络的重编程 IPSC 菌落显示不存在 GFP 表达。
该图显示了来自 Detroit 5 51 成纤维细胞的集落的免疫组织化学分析，以及 TRA 180 1、TRA one、60、SSEA 4、T、4 和 nano 抗体，如可以成功看到的那样。重新编程的 IPC 表达所有这些标志物。此外，进行定量 R-T-P-C-R 分析基因表达，发现与亲本成纤维细胞相比，T 4 SOX 2、KLF 4 M 和 nano 显著增加，但与 H 9 HSC 相称。
观看此视频后，您应该对如何使用荧光显微镜感染病毒、识别和拾取完全唇部编程的 IPA 细胞有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种利用逆转录病毒介导的关键多能性因子表达来生成人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。它还讨论了通过GFP表达识别iPSC集落的实用方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 细胞重编程
- 再生医学
背景
- 诱导多能干细胞（iPSCs）对于研究和治疗应用至关重要。
- 逆转录病毒载体常用于干细胞研究中的基因递送。
- GFP（绿色荧光蛋白）作为标记物用于识别成功重编程的细胞。
- 理解多能性对再生医学的进展至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的方法来生成人类iPSCs。
- 利用GFP报告系统来识别iPSC集落。
- 展示生成的iPSCs中多能性标记物的表达。
使用的方法
- 用表达GFP的逆转录病毒感染目标细胞。
- 将感染的细胞转移到铺有凝胶的培养板上，并与小鼠胚胎成纤维细胞共培养。
- 用人胚胎干细胞培养基替换培养基。
- 分离表现出胚胎干细胞样形态的GFP阳性iPSC集落。
主要结果
- 通过GFP表达确认成功生成iPSCs。
- 分离出形态与人胚胎干细胞相似的集落。
- 通过免疫荧光染色验证内源性多能性标记物的表达。
- 通过RT-qPCR定量分析多能性标记物。
结论
- 所描述的方法有效地生成人类iPSCs。
- GFP表达作为识别iPSC集落的可靠标记物。
- 这种方法可以促进干细胞生物学和再生医学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reprogramming human somatic cells into iPSCs using retroviral vectors with GFP enables robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides a reproducible platform for generating pluripotent cells, supporting predictive confidence in disease modeling and translational research. The method's quantitative outputs and marker-based selection streamline portfolio triage and accelerate preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of reprogramming hypotheses and pluripotency pathway activation.
- Enables biological de-risking by confirming endogenous pluripotency marker expression.
- Supports predictive confidence for downstream disease modeling and cell-based assays.
- Provides a standardized system for functional target validation in regenerative research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated iPSC lines for scalable compound screening and phenotypic assays.
- Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay standardization.
- Enables quantitative assessment of pluripotency via immunofluorescence and RT-qPCR.
- Supports reliable evaluation of reprogramming efficiency and transgene silencing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns iPSC generation with disease-relevant model development for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of cell-based therapies and biomarker studies.
- Provides mechanistic de-risking for preclinical validation of pluripotency and differentiation potential.
Pipeline & Workflow Integration
This iPSC reprogramming protocol integrates from early discovery through preclinical model development, supporting lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct assessment of pluripotency induction.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated iPSC lines for downstream assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative outputs via immunofluorescence and RT-qPCR for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by generating disease-relevant pluripotent cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating iPSCs from diverse somatic sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pluripotency induction.
- Operational Value: Standardizes iPSC generation and selection for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of cell-based programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative and disease modeling initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retroviral transduction and stem cell culture techniques.
- Demands access to fluorescence microscopy and quantitative PCR infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of marker validation and colony selection criteria.
- Adaptation may be needed for different somatic cell sources or feeder systems.
- Potential limitations include retroviral integration and transgene silencing variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Infecting Cells with Retrovirus Expression Reprogramming Factors
3:31
Isolation and Expansion of Induced Pluripotent Stem Cells
4:42
Analysis of Pluripotent Markers by Immunofluorescence and Quantitative Real-time PCR
6:06
Representative Cell-reprogramming Results
8:03
Conclusion
