荧光显微镜筛选和新一代测序:参与细胞器完整性的基因鉴定的有用工具

本实验的目的是鉴定负责植物细胞器形态和功能完整性的一个或多个基因。这是通过首先将 Ethel 甲烷磺酸盐作为化学试剂添加到携带细胞器荧光标记物的诱变原特应性种子中来实现的。第二步是从第一代诱变剂的单个植物中收集种子，以培养后续突变体一代 M 2 的品系。

接下来，使用共聚焦或荧光显微镜观察诱变剂 A Eliana 种子以识别异常的器官表型。最后一步是产生第三代诱变剂并确认突变表型的存在。最终，可以使用下一代测序工具对隐性突变进行定位。

一旦确定了突变基因的位置，用野生型基因进行转化应该可以恢复异常的有机表型。这种方法可以帮助回答维持植物细胞器形态和功能完整性的关键问题。Atil 甲烷，sta 种子顶部的磺酸盐处理诱导基因组中的胞嘧啶时间变化，导致胞嘧啶 gwan 到时间。

添加突变。EMS 治疗是该方案中的关键步骤，以确保 M 两个个体内的完美比例突变。首先获得野生型 Columbia Ecotype 的拟南芥种子，这些种子先前已被设计为携带相关的细胞器荧光标记。

将 0.8 克或约 40， 000 颗种子转移到 50 毫升的猎鹰管中。然后加入 25 毫升蒸馏水和 0.2% 乙爷甲烷磺酸盐。孵育后，将混合物在突变混合器上低速孵育 16 小时，吸出液体并将其丢弃到含有 1 摩尔氢氧化钠的泡沫中。

要灭活 EMS，请在含有种子的 Falcon 管中加入 25 毫升水。关闭试管并倒置五次以清洗种子。所有种子沉淀后，吸出水并丢弃到一磨牙氢氧化钠烧瓶中。

最后一次洗涤后，重复此洗涤步骤最多 10 次，Reese 将种子浸入最少量的水中。加入 25 毫升 10% 漂白剂并剧烈摇晃 30 秒，进行种子灭菌。种子沉降到底部后，倒掉漂白剂并用 25 毫升无菌水冲洗。

除去无菌水后，加入 25 毫升 70% 乙醇。摇动试管 30 秒，让种子沉降到底部。倒出乙醇并用 25 毫升无菌水冲洗。

重复无菌水洗两次。然后将种子倒入装有 3 毫米滤纸的塑料培养皿上。在 4 摄氏度下将种子孵育两天后，让种子在引擎盖下晾干。

将种子以每板约 250 至 300 颗种子的 150 毫米培养皿中，放入含有战斗凝胶的半 Magi 和 scoog 培养基中。作为果冻剂，将 M1 代的种子在平板上培养两周。将幼苗移植到土壤中，让植物继续生长。

30 到 45 天后，植物将达到成熟阶段，因此可以清楚地看到泄漏。此时，从单个 M1 植物中收集 M 2 种子，以产生 1000 个独立的 M 2 品系。为了用共聚焦或荧光显微镜观察幼苗，在塑料培养皿上从每条 M 2 行培养 60 颗种子，持续 7 到 10 天，对半。

含有战斗凝胶的 Moreish 和 scoog 培养基也在同一平板上培养 EMS 未处理对照的五株幼苗。幼苗长大后，将 5 到 10 个 cos 导入物与 ABAC 密封侧朝向显微镜载玻片上的 40 倍镜头安装，并在荧光下用盖玻片封闭，观察从皮质到内侧区域的每个油酸是否改变细胞器标志物的亚细胞分布。将阳性植物移植到土壤中并生长幼苗后，如刚才所述，确认突变表型在 M 第三代。

如书面方案中所述，通过至少三次回交到含有所需有机荧光标记物的野生型基因组来去除污染的背景突变。要开始作图，请使用 cogen DN Easy Z 植物迷你试剂盒从 M 3 中提取大约 3 μg 的基因组 DNA，它代表纯合突变 Columbia DNA。将此 DNA 提交给 Illumina 基因组分析仪进行二 14 测序。

下一步是杂交 zago 突变体 Colombia 将 Las Berger 在自花授粉后产生一个后代，其中可以发生组合。聋牙的产生将产生并最终作为包含目标基因的标测群体，该基因导致了突变。通过将该群体的基因组 DNA 与井型植物的基因组 DNA 进行比较，可以确定突变在基因组中的位置。

在 F 两株植物生长后，收集 70 到 100 个 F 两个显示异常表型的个体和相同数量的 F 两种具有野生型表型的植物，使用整个冲头从每株植物收集一个叶盘。叶盘应从相同年龄的叶子中收集。为确保 DNA 量相似，可以单独或分组处理样品以进行基因组提取。

在这种情况下，每个 eend orph 管可以收集 5 到 10 个样品，从而减少必须提取基因组 DNA 的试管。使用主纯植物叶 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA。然后，可以使用 NanoDrop 对从每个样品中获得的基因组 DNA 进行定量。

然后，从每个样品中混合等量的 DNA，最多总共 300 ng，将突变型和野生型样品分开，首先进行标记反应，加入 60 微升 2.5 x 随机引物溶液和 42 微升水。将大于 95 摄氏度的 DNA 变性 5 到 10 分钟后，将样品放在冰上使 DNA 变性。加入 15 微升 10 X DN tps。

与生物素 DCTP 混合，并加入 3 μL。Glen 聚合酶。将样品在 25 摄氏度下孵育过夜。

第二天，加入 15 微升三摩尔乙酸钠和 400 微升冷 100% 乙醇。将混合样品在零下 80 摄氏度下孵育 1 小时，然后以 20 倍 G 离心 500 倍 G 离心 15 分钟。第二次旋转后，用 500 微升冷的 75% 乙醇洗涤沉淀。

在 37 摄氏度下干燥 DNA 沉淀 10 分钟。将沉淀重新悬浮在 100 微升水中，并使用 5 微升检查凝胶生物的产量和质量。将 Prime 随机标记反应加载到来自野生型 F 2 植物池和突变型 F 2 植物池的 1%aros 凝胶上。

作为最后一步，发送 95 微升野生型和突变体标记反应，用于基因芯片拟南芥 ath 一个基因组阵列杂交。扫描橡皮擦后，使用我们的软件分析得到的点 CL 文件。安装我们的软件后，打开程序并粘贴在书面程序中找到的 bioconductor 字符串。

然后按 Return 键，这将从阵列、基因分型和图谱网站安装标准 BIOCONDUCTOR 软件包。将文本中列出的文件下载并解压缩到桌面上的新文件夹中。将从基因芯片实验获得的数据保留到野生型 C、L 和突变体 C 中，现在将野生型 C 和突变体 C 的基因芯片数据复制到文件夹中。

接下来，打开 R for a pc。单击 file （文件），然后单击 change directory （更改目录）。选择包含文件的文件夹，单击文件加载工作区，然后选择 A one V five R 数据打开读取 C do R 使用记事本并将整个文本复制到 Mac 的 R，单击 mis，然后单击更改工作目录。

选择包含文件的文件夹。单击工作区加载工作区文件，然后选择 ATH one V five R 数据。同样，使用文本打开 SFP R 和 MAP R，在控制台窗口中编辑文本并将其复制到 R。

将出现一条消息，用于在拟南芥信息资源或 TAIR 中搜索基因。将文本中找到的链接复制并粘贴到 Internet 浏览器中。将出现一个窗口，要求打开或保存文件。

选择 保存。选择文件名并附加扩展名。Do x ls.

然后单击 Save （保存）。此处显示的是预期的典型结果。在分析了从基因芯片拟南芥 H one 基因组阵列获得的数据后，该图代表了使用基因芯片拟南芥（一种 H one 基因组杂交）绘制哥伦比亚零突变的实例，其中水平条表示检测阈值。

本例中的突变位于 1 号染色体上，由竖线分隔。打开文件点 XLS 以查找映射区域内突变体的坐标。在突变基因组的组装 Illumina 读数中，鉴定单核苷酸多态性中的特定 EMS 转换。

一旦掌握了描述该协议的方法，与传统的作图方法相比，可以使用三个较短的时间框架来绘制基因。