Name: 荧光显微镜筛选和新一代测序:参与细胞器完整性的基因鉴定的有用工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 了解荧光显微镜与新一代测序技术，用于鉴定维持植物细胞器形态与功能完整性的关键基因。该方法结合化学诱变与遗传作图，为植物细胞生物学研究提供高效工具。

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我们感谢美国能源部科学办公室基础能源科学司化学科学、地球科学和生物科学部（资助号 DE-FG02-91ER20021）以及国家科学基金会（MCB 0948584）（F.B.）提供的支持。我们感谢 Karen Bird 女士对稿件的编辑工作。

1. EMS 处理
Arabidopsis thaliana 种子使用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）作为诱变剂进行诱变处理3,4，该试剂可诱导基因组中发生C-to-T的碱基替换，从而导致C/G到T/A的突变5-7。
<ol>
	<li>称取携带细胞器荧光标记的拟南芥种子 0.8 g（约 40,000 粒），本研究中使用 ssGFPHDEL（信号序列-GFP-HDEL 四肽）作为内质网标记。</li>
	<li>将种子转移至 50 ml 离心管中，加入 25 ml 蒸馏水。</li>
	<li>加入 0.2%（v/v）甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate）。</li>
	<li>在低速摇床上孵育 16 小时。</li>
	<li>抽吸液体并弃入含有 1.0 M NaOH 的烧杯中，以灭活 EMS。</li>
	<li>向含有种子的离心管中加入 25 ml 水，盖紧后倒置混匀 5 次以清洗种子；待所有种子沉降后，吸去上清液并弃入 1.0 M NaOH 烧杯中。</li>
	<li>重复上述清洗步骤，共清洗 10 次。</li>
	<li>最后一次清洗后，将种子重悬于少量水中。</li>
	<li>进行种子灭菌：加入 25 ml 10% 次氯酸钠溶液，剧烈震荡 30 秒；待种子沉降后，倒去次氯酸钠溶液，用 25 ml 无菌水冲洗；倒去无菌水后加入 25 ml 70% 乙醇，震荡 30 秒；待种子沉降后，倒去乙醇，再用 25 ml 无菌水冲洗；重复无菌水冲洗两次，然后将种子转移至含有 3 MM 滤纸的塑料培养皿中，在通风橱内晾干。于 4 °C 保存 2 天。</li>
	<li>将种子接种于 ½ MS 琼脂培养基（Murashige 和 Skoog 培养基半浓度）的 150 mm 培养皿中（每皿约 250–300 粒种子）。</li>
	<li>在培养皿中培养 M1 代种子 2 周，然后移栽至土壤中。</li>
	<li>从单株 M1 植株收获 M2 代种子，建立 M2 群体（共 1000 个独立株系）。</li>
</ol>
2. M2 和 M3 群体的共聚焦筛选
在本部分中，我们将描述如何使用共聚焦或荧光显微镜观察幼苗，方法如前所述8。
<ol>
	<li>将每个M2代品系的六十粒种子种植在塑料培养皿中，使用½ MS琼脂培养基，培养7至10天；在同一培养皿中同时种植5株未用EMS处理的幼苗（对照）。</li>
	<li>取5到10片子叶，将远轴面朝向物镜（40倍）放置于显微镜载玻片上，并加盖盖玻片。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察每片子叶，从皮层区域至中脉区域，检查细胞器标记物的亚细胞定位是否发生异常。</li>
	<li>将阳性植株移栽至土壤中，收集其种子，并在M3代中再次筛选，以确认突变表型的遗传稳定性。</li>
	<li>通过与野生型植株（可能携带目标细胞器荧光标记）至少回交三次，以消除背景中的污染性突变。
	<ol>
		<li>从母本植株上，使用精细剪刀或镊子去除成熟的角果和开放的花朵。</li>
		<li>从分生组织上移除过小的花芽。</li>
		<li>用一对镊子的尖端插入花瓣与萼片之间，打开一个花蕾，并完全去除其中的雄蕊。</li>
		<li>用另一对镊子取父本植株上开放的成熟花朵，将花药在去雄植株的柱头上轻轻摩擦授粉。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 绘图
本部分主要介绍如何利用Borevitz9改进的实验方案对隐性突变进行定位，该方法相较于传统的定位方法10,11更为快速。该方法采用高密度寡核苷酸芯片，可在单次检测中识别大量单特征多态性（SFP）位点12。使用Affymetrix拟南芥ATH1基因芯片阵列，可分析约24,000个基因。将表现突变表型的F2个体群体与同一分离群体中采集的野生型F2植株群体进行比较。随后，突变位点将定位于突变群体中富集突变基因型等位基因的区域；相应地，在该同一区域，野生型群体将富集来自野生型亲本的等位基因13。
<ol>
	<li>使用 Qiagen DNeasy 植物小型试剂盒从纯合突变体 Columbia (M3) 中提取基因组 DNA（3 μg），并提交至 Illumina Genome Analyzer II (GA II)14 进行测序。</li>
	<li>将纯合突变体 Columbia (M3) 与 Landsberg erecta 杂交，以构建作图群体。</li>
	<li>在 70 至 100 株表现出异常表型的 F2 个体及其同等数量的野生型表型 F2 植株中进行基因定位。</li>
	<li>使用打孔器从每株植物采集一片叶圆片（0.60 mm）。应从相同年龄的叶片上采集叶圆片，以确保获得相近量的 DNA。样品可单独或分组进行基因组 DNA 提取。在此情况下，可将 5–10 个样品收集至同一个 Eppendorf 管中，最终减少需要提取基因组 DNA 的离心管数量。</li>
	<li>使用 MasterPure 植物叶片 DNA 纯化试剂盒（Epicentre）提取基因组 DNA。使用 Nanodrop 对每个样品获得的基因组 DNA 进行定量。</li>
	<li>将每个样品等量的基因组 DNA 混合，总 DNA 量为 300 ng（约 30 μL）；加入 60 μL 2.5X 随机引物溶液 [125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mM MgCl2, 25 mM 2-巯基乙醇, 750 μg/ml 寡脱氧核糖核苷酸引物（随机八聚体）]（Bioprime 试剂盒）以及 42 μL 水（终体积为 132 μL）。</li>
	<li>在 >95 °C 下变性 DNA 5 至 10 分钟。</li>
	<li>置于冰上冷却。</li>
	<li>向每份变性 DNA 中加入 15 μL 含生物素-dCTP 的 10X dNTP 混合液 [1 mM 生物素-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP，溶于 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA]（Bioprime 试剂盒），再加入 3 μL Klenow 聚合酶（Bioprime 试剂盒）补足。</li>
	<li>在 25 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>次日，加入 15 μL 3 M NaOAc 和 400 μL 冷的 100% 乙醇；混匀。</li>
	<li>在 -80 °C 下孵育 1 小时，然后在 20,500×g 下离心 15 分钟，弃去上清液，并用 500 μL 冷的 75% 乙醇洗涤。</li>
	<li>在 20,500×g 下离心 10 分钟。</li>
	<li>在 37 °C 下干燥 DNA 沉淀 10 分钟，然后溶于 100 μL 水中。</li>
	<li>取 5 μL 样品在琼脂糖凝胶上检测产量和质量（图 2）。</li>
	<li>将 95 μL 标记反应产物（分别来自野生型和突变体）送样进行 GeneChip 拟南芥 ATH1 基因组阵列杂交。</li>
	<li>对芯片进行扫描，获得的 .CEL 文件使用 R 软件（<a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a>）进行分析。</li>
	<li>安装 R 软件后，打开程序并粘贴以下字符串： 
	source("<a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a>") 
	biocLite() 
	然后按回车键——这将安装标准的 Bioconductor 软件包（<a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a>）。</li>
	<li>在桌面新建一个文件夹，从以下网站（<a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a>）下载以下文件： 
	 readcel.R 
	 SFP.R 
	 Map.R 
	 ath1V5.RData 
	 ColLerCEL.zip 
	将文件 ColLerCEL.zip 解压，并将解压后的文件复制到新建的文件夹中。</li>
	<li>将 GeneChip 实验获得的数据重命名为 wildtype.CEL 和 mutant.CEL。</li>
	<li>将 GeneChip 数据（wildtype.CEL 和 mutant.CEL）复制到该文件夹中。</li>
	<li>打开 R 软件，a) Mac 系统：点击“Misc”，然后点击“Change working directory”；b) PC 系统：点击“File”，然后点击“Change directory”。</li>
	<li>a) Mac 系统：选择包含上述文件的文件夹，点击“Workspace”，选择“Load workspace file”并加载 ath1V5.RData；b) PC 系统：选择包含上述文件的文件夹，点击“File”，然后点击“Load workspace”，选择 ath1V5.RData。</li>
	<li>使用记事本打开 readCEL.R，将全部文本复制到 R 中。</li>
	<li>使用记事本打开 SFP.R，将全部文本复制到 R 中。</li>
	<li>使用记事本打开 Map.R，将全部文本复制到 R 中。</li>
	<li>在控制台窗口中将看到以下信息： 
	Chromosome x limits Mb y z 
	Search genes at TAIR paste in this link 
	3<a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z</a></li>
	<li>将链接复制并粘贴至浏览器中。弹出窗口将提示打开或保存文件；请选择“保存”。输入文件名并添加“.xls”扩展名，然后点击“保存”。</li>
	<li>打开“.xls”文件，其中可找到突变体的定位坐标（结果在 图 3 中以图形方式展示）。</li>
	<li>在突变体基因组组装的 Illumina 测序读段中，于已定位区域内识别单核苷酸多态性中的特异性 EMS 转换4。通过标准转化程序15，使用野生型基因对突变体表型进行互补验证。</li>
</ol>
4. 代表性结果
图1展示了利用共聚焦显微镜筛选鉴定分泌途径突变体的方法。图2展示了一种用于芯片杂交的标记基因组DNA的典型制备过程。图3展示了分析GeneChip拟南芥ATH1基因组芯片获得的数据后预期得到的典型结果。
<img alt="拟南芥诱变过程；EMS处理，M1-M3代植株；共聚焦显微镜观察；基因测序。" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 表达ssGFPHDEL（内质网标记）的拟南芥转基因植株（1）被培养以获得足够用于EMS处理的种子（2）。经EMS处理的种子播种后产生M1代植株（3）。每株M1代植株代表一个不同的突变系，其种子被单独收集。M2代种子被点种于½ MS培养基上（4），并通过共聚焦显微镜检测内质网形态缺陷（5）。在筛选过程中，我们发现了保持野生型内质网形态的植株（6）以及表现出内质网异常表型的植株（7）。这些植株被继续培养以获得M3代，并确认表型的稳定性（8）。提取M3代植株的基因组DNA用于Solexa Illumina测序（a）。同时，该植株也与Ler-wt进行杂交，以获得F2作图群体（b）。
<img alt="DNA凝胶电泳结果，比较野生型和突变型样品，蛋白质分析。" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. Bioprime随机标记反应（100 μL中的5 μL）上样于1%琼脂糖凝胶。泳道a来自野生型F2植株混合样品，泳道b来自突变型F2植株混合样品。（Marker为1 Kb DNA Ladder-N3232，NEB公司产品）。
<img alt="1-5号染色体上的等位基因频率差异图；遗传变异分析，图表形式。" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 该图展示了利用GeneChip拟南芥ATH1基因组阵列杂交技术对Col-0突变进行定位的一个示例。本示例中的突变位于1号染色体上，由垂直线标出范围。水平线表示检测的阈值。

<ol><li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li>
<li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3%2C+a+non-essential+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , Forthcoming (2011).</li>
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<li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li>
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<li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li>
<li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li>
<li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li>
<li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li>
<li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
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<li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文描述了一种基于共聚焦显微镜的筛选方法，用于鉴定内膜系统突变体。该方法可轻松扩展至细胞中其他具有特异性荧光蛋白标记物的细胞器。该筛选基于识别那些在靶细胞器中或在本不应含有该标记物的细胞器中表现出荧光标记物异常分布的突变体。相应地，这些突变体分别代表了细胞器对标记物进行亚区室化的能力受损，或标记物在细胞器之间无法正常转运的群体。在筛选过程中，我们注意到某些突变体在萌发后7天的早期发育阶段即表现出表型；然而，另一些突变体仅在发育的较晚阶段才表现出表型。尽管这可能与多种因素有关（包括突变等位基因的表达具有发育依赖性），但建议在不同生长阶段（至少萌发后7至14天）对植株进行观察，以确保不会遗漏潜在的重要突变体。
本方案中描述的方法使我们能够在相对较短的时间内完成基因定位，与传统的定位方法相比具有明显优势。事实上，用于GeneChip阵列的F2群体所需个体数量较少，因此收集这些个体所需时间远少于传统精细定位所需的F2植株。然而，该过程中存在若干关键步骤必须严格遵守。在选择表现出或不表现出目标表型的F2群体样本时应格外谨慎，因为即使误加入少量表型判断错误的植株，也可能导致最终结果出现偏差。...

<table><tbody><tr><td>甲基磺酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0880</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>JT Baker</td><td>3722-05</td><td></td></tr><tr><td>含甘博格维生素的Murashige和Skoog基础培养基</td><td>Phyto Technolog Laboratorie</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Master Pure 植物叶片DNA纯化试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MPP92100</td><td></td></tr><tr><td>Bioprime DNA标记系统</td><td>Invitrogen</td><td>18094-011</td><td></td></tr><tr><td>200度酒精</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>JT Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Chip 拟南芥 ATH1 基因组芯片阵列</td><td>Affymetrix</td><td>900385</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon管</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm滤纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>往复式（摇摆）振荡器</td><td>Heidolph</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

荧光显微镜筛选与高通量测序：鉴定参与细胞器完整性的基因的有用工具

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

本方案描述了一种基于荧光显微镜的筛选方法 拟南芥 幼苗，并描述如何定位隐性突变，这些突变会改变分泌途径中特定标记荧光标记物的亚细胞分布。 拟南芥 是一种强大的生物学模型，适用于遗传学研究，因其基因组大小、世代时间以及在不同生物界之间分子机制的高度保守性。与基于分子标记的传统方法相比，采用基因分型芯片作为定位突变的方法具有优势，因其相对更快速，并可在极短时间内实现多个突变体的定位。该方法可用于鉴定可能影响植物中任何细胞器完整性的蛋白质。在此，我们以实例提出一种用于定位影响内质网（ER）完整性的关键基因的筛选策略。然而，我们的方法可轻松拓展至其他植物细胞器（例如参见1,2因此，这代表了理解其他亚细胞结构分子基础的重要一步。

细胞生物学的一个基本研究目标是阐明构成真核细胞的细胞器身份特征背后的机制。本文提出一种利用荧光显微镜和下一代测序技术鉴定植物细胞器形态与功能完整性的相关基因的方法。

本实验方案描述了一种基于荧光显微镜的拟南芥幼苗筛选方法，并介绍了如何定位改变...的隐性突变

本实验的目的是鉴定负责植物细胞器形态和功能完整性的基因。首先，将甲基磺酸乙酯作为化学诱变剂加入携带细胞器荧光标记的突变型种子中进行诱变处理。第二步，收集第一代诱变植株的单株种子，用于培育下一代突变体群体 M2 代株系。接下来，使用共聚焦或荧光显微镜观察经诱变处理的Eliana种子，以鉴定其异常的器官表型。最后一步是获得第三代诱变植株，并确认突变表型的存在。最终，可利用新一代测序工具对隐性突变进行定位。一旦确定了突变基因的位置，利用野生型基因进行转化应能恢复异常的细胞器表型。该方法有助于解答植物细胞器形态和功能完整性维持中的关键问题。亚砜胺类化合物处理 sta 突变体种子可诱导基因组中胞嘧啶发生碱基替换，导致胞嘧啶转变为胸腺嘧啶。引入突变。EMS处理是本方案中的关键步骤，旨在确保M2代个体中获得理想的突变比例。首先，获取已通过基因工程改造、携带相关细胞器荧光标记的野生型哥伦比亚生态型拟南芥种子。将0.8克或约40,000粒种子转移至一个50毫升的离心管中。然后加入25毫升蒸馏水和0.2%乙基甲烷磺酸。将混合物在突变摇床中低速孵育16小时。孵育结束后，吸去液体并弃入含有1摩尔氢氧化钠的烧杯中。为灭活EMS，向含有种子的Falcon管中加入25毫升水。盖紧管盖，颠倒混匀5次以清洗种子。待所有种子沉降后，吸除上清液并弃入1摩尔氢氧化钠溶液瓶中。最后一次洗涤后，重复此洗涤步骤最多10次，然后将种子置于最小量的水中。加入25毫升10%的次氯酸钠溶液进行种子灭菌，并剧烈振荡30秒。待种子沉降至容器底部后，倒去次氯酸钠溶液，再用25毫升无菌水冲洗。移除无菌水后，加入25毫升70%乙醇。将试管振摇30秒，静置使种子沉降至管底。倒去乙醇，用25毫升无菌水冲洗。用无菌水重复清洗两次。然后将种子倒入含有三毫米滤纸的塑料培养皿中。在4°C条件下孵育种子两天后，于超净工作台中让种子干燥。将种子放置于直径150毫米的培养皿中，每皿约250至300粒种子，置于含fighter gel作为凝固剂的半量Magi和Scoog培养基上。将M1代种子在培养皿中培养两周，然后将幼苗移栽至土壤中，使其继续生长。30 至 45 天后，植株将进入成熟阶段，此时成熟的渗漏现象可清晰观察到。在此阶段，从每株 M1 植株中收集 M2 代种子，以建立 1000 个独立的 M2 代株系。为了在共聚焦或荧光显微镜下观察幼苗，将每个 M2 代株系的 60 粒种子置于塑料培养皿中，在 1/2 浓度培养基上培养 7 至 10 天。在含有 fighter gel 的 Moreish 和 scoog 培养基上，同时在同一培养皿中培养五株未经 EMS 处理的对照种子苗。待种子苗生长后，取 5 至 10 个 cos 引物，将 ABAC 密封面朝向显微镜载玻片上的 40 倍物镜，加盖盖玻片，在荧光显微镜下观察每株 olein 从皮层至中轴区域细胞器标记物的亚细胞分布是否发生改变。将阳性植株移栽至土壤中，并按上述方法继续培养种子苗，确认突变表型存在于 M3 代。通过将含有目标细胞器荧光标记的野生型基因组进行至少三次回交，去除污染的背景突变，具体操作详见书面实验方案。开始定位前，使用cogen DN Easy Z植物微量提取试剂盒从M三代中提取约三微克基因组DNA，该样本代表纯合突变体Columbia的DNA。将提取的DNA送交进行Illumina基因组分析仪2×14测序。下一步是将zago突变体Colombia与Landsberg erecta杂交，通过自花授粉产生后代，从而获得可能发生目标基因组合的单株。由此产生的后代将作为作图群体，其中包含引起突变的感兴趣基因。通过将该群体的基因组DNA与野生型植株的基因组DNA进行比较，即可在基因组中确定该突变的位置。在F2代植株生长后，收集70至100株表现出异常表型的F2个体，以及相同数量的野生型表型F2植株，使用打孔器从每株植株上采集一片叶盘。叶盘应取自相同年龄的叶片。为确保DNA量相近，样品可单独或分组进行基因组DNA提取处理。在此情况下，可对每个离心管收集五到十个样本，从而减少需要提取基因组 DNA 的离心管数量。使用 MasterPure 植物叶片 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA。随后可使用 NanoDrop 对每个样本获得的基因组 DNA 进行定量。然后，将每个样本的等量 DNA 混合，总量达到 300 纳克，保持突变型和野生型样本分开，以首先进行标记反应，加入 60 微升 2.5 × 随机引物溶液和 42 微升水。将 DNA 在高于 95 摄氏度的条件下变性 5 到 10 分钟后，将样本置于冰上冷却以使 DNA 变性。加入 15 微升 10 × dNTPs。加入生物素-dCTP并补至三微升。Glen聚合酶。25摄氏度下孵育样品过夜。第二天，加入15微升3摩尔的醋酸钠和400微升冰冷的100%乙醇。将混合样品在–80摄氏度孵育1小时，随后在20,500 ×g离心15分钟。第二次离心后，用500微升冰冷的75%乙醇洗涤沉淀。将 DNA 沉淀在 37 摄氏度下干燥 10 分钟。用 100 µL 水重悬沉淀，并取 5 µL 在琼脂糖凝胶上检测产量和质量。将随机引物标记反应产物上样到 1% 琼脂糖凝胶，样品来自野生型 F2 植株混合样本和突变型 F2 植株混合样本。最后一步，将95微升的野生型和突变型标记反应产物用于基因芯片拟南芥ATH1全基因组阵列杂交。擦除扫描后，所获得的相应CL点文件通过我们的软件进行分析。安装软件后，打开程序并将书面实验步骤中提供的Bioconductor字符串粘贴至软件中。然后按回车键，这将从阵列、基因分型和图谱网站安装标准的 BIOCONDUCTOR 软件包。将文本中列出的文件下载并解压缩到桌面的一个新文件夹中。保留从基因芯片实验中获得的野生型 C、L 和突变型 C 的数据。现在将野生型 C 和突变型 C 的基因芯片数据复制到该文件夹中。接下来，打开适用于 PC 的 R。点击“文件”，然后点击“更改目录”。选择包含文件的文件夹，点击“文件加载工作空间”，然后选择 A one V five R 数据，使用记事本打开 read C do R，并将全部文本复制到 R 中。对于 Mac，点击“mis”，然后点击“更改工作目录”。选择包含文件的文件夹。单击工作区，加载工作区文件，然后选择 ATH one V five R 数据。类似地，使用文本编辑器打开 SFP R 和 MAP R，复制文本内容，并将其粘贴到 R 的控制台窗口中。将出现一条消息，提示在拟南芥信息资源库（Arabidopsis information resource）或TAIR中搜索基因。请将文本中找到的链接复制并粘贴到互联网浏览器中。随后将弹出一个窗口，提示打开或保存文件。选择保存。输入文件名并添加扩展名。执行 x ls 操作。然后点击保存。此处显示的是预期的典型结果。在分析基因芯片拟南芥H1基因组芯片获得的数据后，该图展示了利用基因芯片拟南芥H1基因组杂交进行哥伦比亚0突变定位的一个示例，其中水平条形表示检测的阈值。本示例中的突变位于第一条染色体上，由垂直条线标示其范围。打开文件 dot XLS，以查找该突变体在定位区域内的坐标。在该突变体基因组的Illumina测序读段组装结果中，从单核苷酸多态性中鉴定出特定的EMS转换突变。一旦掌握，本方案所述方法可在较短的时间内用于基因定位，相较于传统定位方法具有显著的时间优势。

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