测量人体血浆中的凝血因子V活性，用酶联凝固分析
September 9th, 2012
本研究描述了一种新颖的微孔板法测量FV凝血活性在人血浆中的纤维蛋白凝块的形成还没有被以前的报告。该方法使用一个动能酶标仪人血浆中的纤维蛋白凝块的形成过程中，连续地测量在405nm处的吸光度变化。
以下程序的总体目标是开发一种微孔板测定法，用于测量人血浆中纤维蛋白凝块形成过程中凝血蛋白因子 V 的活性。作为对损伤的反应，血液凝固过程被激活并导致一系列 Xymogen 到蛋白酶的转化反应，最终导致凝血酶凝血酶的产生，凝血酶裂隙可溶性纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，然后结合形成不溶性纤维蛋白凝块。正常情况下，血液在健康或未受伤状态下保持为自由流动的液体，形成的纤维蛋白量等于纤维蛋白降解或分解的量。
然而，在某些疾病情况下，过多的凝血会导致心脏病和中风，而过少的凝血会导致出血倾向，这在血友病中很常见。因子 V 是血浆中的一种蛋白质，在其活化形式中，因子 5 A 是纤维蛋白凝块形成过程中凝血酶生成的关键加速器，作为凝血酶原酶复合物的一部分，凝血酶原由因子 10 A、蛋白酶因子 5 A、辅助因子脂质、表面和钙的四个成分组成。meline 因子 5 A 使因子 10 A 对其底物凝血酶原的催化效率或 kcat 增加约 3000 倍，从而显著增强凝血酶生成和纤维蛋白凝块形成。
微孔板平台是测量酶催化事件的首选平台，因为它方便、耗时、样品量小、连续监测和高通量。纤维蛋白凝块形成事件可以用酶标仪监测，方法是测量血浆的吸光度增加，因为它从不存在纤维蛋白凝块的透明黄色外观和最小的吸光度变为具有纤维蛋白凝块和最大吸光度的不透明混浊外观。与现有方法（如手动倾斜管分析或使用自动分析仪分析）相比，该技术的主要优点是该方法快速、成本低、样品量要求小且通量高。
该测定法测量意外激活和凝血酶激活的因子 5 的活性，以获得其总功能活性的完整定量评估。演示该技术的是实验室的硕士生 Derek Tilley。为了测量血浆样品中的因子 5 活性，有必要构建因子 5 一阶段活性，图 A 中纤维蛋白凝块形成时间的标准曲线和图 B 中纤维蛋白凝块形成的初始速率，使用正常人血浆或 NHP 作为标准，根据定义，包含每 ML 一个单位的因子 5 活性解冻因子 5 缺陷血浆， 正常人血浆，以及血浆未知物和凝血活酶样本，在 37 度下放置 10 分钟。
轻轻混合因子 5 缺陷血浆和血栓形成成形术转移至单独的塑料洗涤托盘中，并在冰上孵育。轻轻混合后，将正常人血浆和样品血浆未知物储存在冰上。将氯化钙 25 毫摩尔储存在蒸馏水中，在室温下放入单独的洗涤盘中，以获得因子 5 一阶段活性标准曲线。
使用 1.5 ml 微量离心管，在 HBS pH 7.4 中制备 0 2 4 8 16 32 64、1 28、2 56 和 512 倍的正常人血浆的两倍连续稀释液各 200 微升，涡旋充分并在冰上孵育。对于血浆样品未知物，使用 1.5 ML 微量离心管在 HBS pH 7.4 中制备 200 微升 40 倍稀释的正常人血浆和未知样品血浆。将五个微孔板条放入酶标仪的模板支架中。
打开酶标仪并使用多通道移液器访问 Softmax Pro 微孔板应用软件。使用单个移液器向所有样品微孔板孔中同时添加 50 微升因子五缺陷血浆，加入 50 微升制备的 10 次连续稀释的正常人血浆和 40 倍稀释的正常人血浆和样品血浆未知物，以使用多通道移液器分离微孔板孔，向所有样品孔中加入 50 微升血栓形成成形术。在 25 摄氏度的酶标仪中孵育 1 分钟，并在 1 分钟孵育的 15 至 25 秒内摇晃。
使用与 MICROPLATE reader 连接的计算机访问 Softmax Pro 微孔板应用软件。将酶标仪的吸光度波长设置为 405 纳米模式，将动力学温度设置为 25 摄氏度，并对酶标仪进行编程，使其在添加氯化钙后的前 5 秒内摇动，并在 405 纳米处每 5 秒测量一次吸光度，持续 6 分钟。此后，使用两个多通道移液器同时向装有样品的两个微孔板试板条中加入 50 μL 氯化钙，计算出的凝血时间不包括 5 秒的振荡间隔。
等待 15 秒，然后立即从计算机按下 Softmax Pro 中的开始图标以开始检测。对于分析的每个血浆样品，确定凝块形成的时间，并将其定义为达到吸光度最大增加一半的时间（以秒为单位）。凝块形成的初始速率定义为吸光度增加的线性部分与时间相关的前五个时间点上的吸光度增加速率。
凝块形成的程度定义为在运行结束时凝块形成事件期间达到的最大和最小吸光度之间的差值。使用 Softmax Pro 中的 ABSORBENCE 与时间曲线来确定正常人血浆连续稀释的时间、初始速率和凝块形成程度。为了构建因子 V，一期活性标准曲线，使用 40 倍稀释的正常人血浆和样品血浆未知物的凝块时间，我从因子 5 一阶段活性标准曲线中以每磨单位为单位插入因子 5 活性。
这表示因子 5 一期活动或没有凝血酶有意激活的活性。这是酶标仪生成的因子 5 测定中纤维蛋白凝块随时间变化形成的代表性示例。该图谱表示在单个微孔板中使用 32 倍稀释的正常人血浆形成纤维蛋白凝块。
嗯，纵轴表示由于纤维蛋白凝块形成而发生的 405 纳米吸收剂的变化。凝块形成的时间计算为吸光度与时间曲线的中点，即 36.4 秒。凝块形成的初始速率计算为每分钟 611.88 毫单位。
云形成的范围计算为 0.35 个单位。因子 5 测定准确测量云形成的时间初始速率和程度。分析完成后对孔的检查证实发生了凝块形成。
所有反应都达到了与 CloudFormation 大致相同的程度，在 405 纳米处的吸光度普遍变化在 0.35 到 0.45 个单位之间，介于血栓形成术和氯化钙之前的初始吸光度和最大吸光度之间。此外，还有因子 5 第一阶段活性的代表性示例，凝块时间（秒）与因子 5 活性的标准曲线（单位/密耳）以及爪的初始形成速率（毫米单位/分钟）与因子 5。正常人血浆的活度单位/mil 分别显示在图 A 和图 B 中。
由于因子 5 通常被凝血酶激活。活性辅因子 5 A 在添加凝血酶并与凝血酶孵育后进行第二次测定，对于准确测量因子 5 的两期活性至关重要，在因子 5 两期测定中，通过添加凝血酶有意激活血浆样品。在 HBS pH 7.4 中制备 200 至 300 微升终浓度为 100 纳摩尔的纯化凝血酶，并在冰上孵育，将 120 微升上述正常人血浆和样品血浆从 40 倍稀释至 100 倍与 170 微升含有 2.8 毫摩尔的 HBS pH 7.4。
氯化钙。向每个样品中加入 10 微升凝血酶以达到 10 纳摩尔的最终浓度。旋涡。充分混合并在 37 度下孵育 1 分钟，加入 400 微升 HBS pH 7.4，将正常人血浆和样品血浆稀释至 500 倍。
从soft max Pro中的吸光度与时间曲线确定每个样品血浆未知物测定中正常人血浆的凝块时间。考虑到500倍稀释度，使用每个样品的凝血时间，根据凝血时间与活性的因子5一阶段标准曲线计算因子5两阶段活性。这表示因子 5 两阶段活动或凝血酶有意激活的活动。
然后，可以将因子 5 的两阶段活动减去因子 5 的一阶段活动计算为因子 5。对数凝血时间与对数因子 5 活性的标准曲线用于测量 9 名弥散性血管内凝血或 DIC 患者（全部 9 名 DIC 患者）的正常人血浆和血浆中的因子 5 活性。表现出因子 5 一期活性和初始凝块形成率平均降低 54% 和 18%与正常人血浆相比，DIC 患者的因子 5 两期和总活性平均降低 44% 和 42%。
因子 5 和 DIC 患者导致纤维凝块形成的时间延长和速度降低。观看此视频后，您应该对如何在实验室中实施此方法有一个很好的了解。该方法可以很容易地适应测量血浆中任何凝血因子的活性，使其适用于广泛的研究和临床应用。
最终，因子 V 的这些信息将通过早期诊断和治疗血栓形成或出血性疾病（如 DIC）对医疗保健环境产生积极影响。
概述
本研究提出了一种新型微孔板检测方法，旨在测量人血浆纤维蛋白凝块形成过程中的第V因子凝血活性。该方法利用动态微孔板读数仪连续监测405 nm的吸光度变化，从而提供关于凝血过程的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 凝血生物学
- 止血
- 检测方法开发
背景
- 第V因子在凝血级联反应中起着关键作用，特别是在凝血酶生成过程中。
- 凝血失衡可能导致心脏病和血友病等疾病。
- 传统的凝血活性测量方法可能耗时较长，并且需要更大的样本体积。
- 微孔板检测提供了一种高通量的替代方法来评估凝血活性。
研究目的
- 开发一种快速有效的检测方法，用于测量纤维蛋白凝块形成过程中的第V因子活性。
- 提供对人血浆中第V因子功能活性的定量评估。
- 将新方法的效率与现有的凝血检测方法进行比较。
所用方法
- 准备正常人血浆的系列稀释用于标准曲线。
- 使用微孔板读数仪监测凝块形成过程中的吸光度变化。
- 计算凝块形成时间、初始速率和凝块形成程度。
- 将结果与传统检测方法进行比较。
主要结果
- 微孔板检测方法显示吸光度变化与凝块形成之间存在明显相关性。
- 使用开发的标准曲线可以准确量化第V因子活性。
- 该方法比传统检测方法更快，并且需要更少的样本体积。
- 结果表明该检测方法适合高通量筛查凝血活性。
结论
- 新型微孔板检测方法是测量人血浆中第V因子活性的有效工具。
- 该方法增强了对健康和疾病状态下凝血动力学的理解。
- 未来的应用可能包括临床诊断和凝血障碍研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microplate assay enables quantitative, high-throughput measurement of factor V activity in human plasma, supporting target validation in coagulation pathway research. By capturing time, rate, and extent of fibrin clot formation, it provides predictive confidence for mechanistic de-risking in thrombotic and bleeding disorder models. The assay’s sensitivity to low picomolar factor V levels and adaptability to other coagulation factors enhance its utility in early discovery and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures functional factor V activity to interrogate thrombin generation pathways and validate coagulation targets.
- Operational Value: Requires only microliter plasma volumes and completes in 6 minutes, enabling rapid hypothesis testing.
- Strategic Value: Distinguishes between basal and thrombin-activated factor V, improving target confidence in prothrombinase complex modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative absorbance-based readouts at 405 nm for time, initial rate, and extent of clot formation.
- Operational Value: Compatible with kinetic microplate readers, supporting automation and continuous monitoring.
- Strategic Value: Enables high-throughput screening of plasma samples for factor V deficiency or dysfunction in disease models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated reduced factor V activity in disseminated intravascular coagulation (DIC) patient plasma, supporting disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Adaptable to measure any coagulation factor, increasing assay reuse across preclinical programs.
- Strategic Value: Provides total functional activity (two-stage minus one-stage) to improve predictive validity in thrombotic disorder studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, particularly for coagulation pathway modulators and antifibrotic or antifibrinolytic candidates.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of factor V’s role in thrombin generation and fibrin clot formation.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of plasma-based coagulation activity in 96-well format.
- Analytics: Delivers time (seconds), initial rate (milliunits/min), and extent (absorbance units) of clot formation for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker development in coagulopathies like DIC, where factor V consumption correlates with disease severity.
- Enterprise Reuse: Platform design allows transfer to other coagulation factors, reducing redevelopment costs across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying both basal and thrombin-activated factor V contributions to total activity.
- Operational Value: Eliminates need for expensive automated coagulometers; uses standard microplate readers and low-cost reagents.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in coagulation target programs through early functional activity profiling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on factor V-dependent thrombin generation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in coagulation biochemistry and absorbance-based kinetic assays.
- Dependent on access to a temperature-controlled microplate reader with kinetic absorbance measurement at 405 nm.
- Necessitates standardized reagent preparation (factor V-deficient plasma, thromboplastin, calcium chloride, thrombin) and sample dilution protocols.
- Must account for pre-analytical variables in plasma sample handling (e.g., storage, freeze-thaw cycles) to avoid artifactual factor V activation.
- Limited to research use; not validated for clinical diagnostics or GMP manufacturing without additional regulatory qualification.
