使用微孔板凝固试验测定人血浆中V因子活性

以下实验方案的总体目标是建立一种微孔板检测方法，用于测定人血浆中纤维蛋白凝块形成过程中凝血因子V的活性。当机体受到损伤时，血液凝固过程被激活，引发一系列酶原向蛋白酶的转化反应，最终生成凝血酶；凝血酶将可溶性的纤维蛋白原切割为纤维蛋白单体，后者相互聚合形成不溶性的纤维蛋白凝块。在健康或未受损状态下，血液通常保持自由流动的液态，且生成的纤维蛋白量与降解或分解的量相等。

然而，在某些疾病情况下，过度凝血会导致心脏病和中风，而凝血不足则会引起出血倾向，后者常在血友病中观察到。因子V是血浆中的一种蛋白质，其活化形式因子Va是凝血酶原酶复合物的一部分，在纤维蛋白凝块形成过程中，作为凝血酶生成的关键加速因子。凝血酶原酶复合物由四个组分构成：因子Xa（蛋白酶组分）、因子Va（辅因子）、脂质表面以及钙离子。因子Va可使其酶组分因子Xa对底物凝血酶原的催化效率（kcat）提高约3000倍，从而显著增强凝血酶的生成及纤维蛋白凝块的形成。

微孔板平台因其操作便捷、耗时短、样品用量少、可连续监测以及高通量等优点，被广泛用于检测酶催化反应。纤维蛋白凝块的形成过程可通过微孔板读板仪进行监测，其原理是检测血浆在由无纤维蛋白凝块时的清澈黄色、光吸收最小状态，转变为有纤维蛋白凝块时的不透明浑浊状态、光吸收达到最大值的过程中，光吸收值的逐渐增加。与传统的手工倾斜试管法或自动化分析仪检测等现有方法相比，该技术的主要优势在于检测速度快、成本低、样品用量少，并具有高通量特性。

该检测通过测定意外激活以及凝血酶激活的因子V的活性，从而对其总功能活性进行完整的定量评估。演示该技术的是实验室的硕士研究生Derek Tilley。为了测定血浆样本中因子V的活性，必须利用正常人血浆（NHP）作为标准品建立因子V单阶段活性的标准曲线：在A图中为纤维蛋白凝块形成时间的标准曲线，在B图中为纤维蛋白凝块形成的初始速率标准曲线。正常人血浆按定义含有每毫升1单位的因子V活性。将因子V缺乏血浆、正常人血浆以及未知因子V活性的待测血浆样本与促凝血酶原激酶在37°C下孵育10分钟。

轻轻混匀缺乏因子V的血浆和凝血活酶，转移至 separate 塑料洗盘中，并在冰上孵育。将正常人血浆和待测血浆样本在轻轻混匀后置于冰上保存。将25毫摩尔的氯化钙溶于蒸馏水中，置于另一塑料洗盘内，在室温下保存，用于因子V一期活性标准曲线的制备。

使用1.5 ml微量离心管，用pH 7.4的HBS缓冲液将正常人血浆进行两倍系列稀释，分别配制0、2、4、8、16、32、64、128、256和512倍稀释液，每种200微升，充分涡旋混匀后置于冰上孵育。对于未知血浆样本，使用1.5 ml微量离心管，用pH 7.4的HBS缓冲液分别配制正常人血浆和未知样本血浆的40倍稀释液，每种200微升。将五条微孔条放入酶标仪的板架模板中。

打开酶标仪，并使用多通道移液器进入 Softmax Pro 酶标仪应用软件。使用单通道移液器向所有样本微孔板孔中同时加入 50 µL 的 5 因子缺乏血浆；使用多通道移液器，分别向不同的微孔板孔中加入已配制的正常人血浆 10 倍系列稀释液以及正常人血浆和待测样本血浆的 40 倍稀释液各 50 µL；再向所有样本孔中加入 50 µL 组织凝血活酶。在酶标仪中于 25 °C 孵育 1 分钟，孵育过程中在第 15 至 25 秒期间进行振荡。

使用与酶标仪连接的计算机，打开 Softmax Pro 酶标仪应用软件。将酶标仪的吸光度波长设置为 405 纳米，温度模式设为 25 摄氏度，并编程使酶标仪在加入氯化钙后的前 5 秒进行振荡，随后每 5 秒测量一次 405 纳米处的吸光度，持续 6 分钟。此后，在计算凝固时间时不包含 5 秒的振荡间隔。使用两支多通道移液器，同时向含有样品的两个酶标条中各加入 50 微升氯化钙。

等待15秒后，立即从计算机上的Softmax Pro软件中按下开始图标以启动检测。针对每份分析的血浆样本，凝块形成的时间被确定为吸光度达到最大增加值一半所需的时间（秒）。凝块形成的初始速率定义为吸光度随时间变化曲线上升线性部分前五个时间点的吸光度增加速率。

凝块形成的程度定义为在实验结束时凝块形成过程中达到的最大吸光度与最小吸光度之间的差值。使用 Softmax Pro 中的吸光度随时间变化曲线，确定正常人血浆系列稀释液的凝块形成时间、初始速率及凝块形成程度。为了构建因子V单阶段活性标准曲线，需利用40倍稀释的正常人血浆和待测血浆样本的凝块形成时间，通过因子V单阶段活性标准曲线插值法推算出待测样本中因子V的活性，单位为单位每毫升。

这代表因子V在单阶段活性检测中的活性，即未经凝血酶有意激活的状态下的活性。这是微孔板读数仪生成的因子V检测中随时间推移纤维蛋白凝块形成的代表性示例。该曲线图表示使用32倍稀释的正常人血浆在单个微孔板中进行的纤维蛋白凝块形成过程。

纵轴表示由于纤维蛋白凝块形成导致的405纳米处吸光度的变化。凝块形成的时间被计算为吸光度-时间曲线的中点，即36.4秒。凝块形成的初始速率为611.88毫单位每分钟。

云雾形成程度计算为0.35单位。五因子检测可准确测量云雾形成的初始速率、时间及程度。检测完成后对孔板进行观察，证实了凝块的形成。

所有反应均达到大致相同的凝块形成程度，在加入凝血活酶和氯化钙前后，405 纳米处的吸光度变化普遍在 0.35 至 0.45 单位之间。图中分别展示了因子 V 一期法活性的代表性示例、凝固时间（秒）相对于因子 V 活性（单位/毫升）的标准曲线，以及初始凝块形成速率（毫单位/分钟）相对于因子 V 活性（单位/毫升）的关系。正常人血浆的结果分别显示在 A 面板和 B 面板中。

由于因子V通常由凝血酶激活，因此在添加凝血酶并孵育后进行第二次检测，对于准确测量血浆样本中因子V两阶段活性至关重要——该活性通过外源添加凝血酶实现对因子V的有意激活，以用于因子V两阶段检测。将纯化的凝血酶配制为终浓度100 nmol/L的HBS缓冲液（pH 7.4），冰上孵育，总体积为200至300 µL。将上述正常人血浆及待测样本血浆用含2.8 mmol/L CaCl₂的HBS缓冲液（pH 7.4）稀释40至100倍，取120 µL进行后续操作。

氯化钙。向每个样品中加入10微升凝血酶，使其终浓度为10纳摩尔。涡旋混匀，于37摄氏度孵育1分钟。通过加入400微升pH 7.4的HBS缓冲液，将正常人血浆和样品血浆稀释500倍。

使用 Soft Max Pro 中的吸光度随时间变化曲线，确定每份待测样本血浆中正常人血浆的凝固时间。考虑到500倍的稀释倍数，利用各样本的凝固时间，根据因子V一期法标准曲线（凝固时间相对于活性），计算因子V二期法活性。该值代表因子V二期法活性，即经凝血酶有意激活后的活性。

总V因子活性可通过V因子两阶段活性减去V因子一阶段活性来计算。采用凝固时间对数与V因子活性对数的标准曲线，测定正常人血浆以及九例弥散性血管内凝血（DIC）患者血浆中的V因子活性。所有九例DIC患者的一阶段V因子活性及凝块形成的初始速率平均分别下降了54%和18%；与正常人血浆相比，DIC患者的两阶段V因子活性和总活性平均分别下降了44%和42%。

因子V缺乏和弥散性血管内凝血（DIC）患者的纤维蛋白凝块形成时间延长，形成速率降低。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何在实验室中实施该方法。该方法可轻松调整用于测定血浆中任何凝血因子的活性，适用于广泛的科研和临床应用。

最终，关于V因子的这些信息将通过更早地诊断和治疗DIC等血栓性或出血性疾病，对医疗环境产生积极影响。