发育中与成熟视网膜神经元的单细胞分析

本实验的总体目标是分离单个细胞，用于基于微阵列的转录组分析。首先从周围组织中解剖出视网膜，然后将其解离为单个细胞，以实现这一目标。第二步是收集单个细胞，并将其移入含有裂解缓冲液的PCR管中。

然后裂解细胞，并通过逆转录结合聚合酶链式反应扩增cDNA。最终，将单个细胞的cDNA杂交到AiMatrix微阵列上，以揭示该单个细胞中表达的mRNA。相较于使用整体组织方法，单细胞基因表达谱分析的主要优势在于，单细胞分离可使您获得那些在完整组织中仅占极小比例的细胞亚群。

这些细胞可能是不同类型的神经元，也可能是数量较少的干细胞群体。单细胞技术使我们能够鉴定这些细胞的类型、这些小群体细胞的特异性标记物，并识别在这些极为稀有的细胞亚群中表达的基因网络。此外，单细胞分析技术使我们能够鉴定在少量细胞亚群经历高度动态的发育转变过程中短暂表达的基因网络。

该方法有助于回答发育遗传学领域的一些关键问题，例如前体细胞何时开始表达与分化相关的基因网络，以及这些前体细胞彼此之间存在哪些差异。该技术的影响延伸至神经退行性疾病的细胞治疗，例如青光眼；因为通过阐明单个细胞发育过程中的关键网络，我们便向能够生成这些细胞用于细胞替代治疗的目标更近了一步。开始实验时，将小鼠视网膜置于盛有PBS的培养皿中。

接下来，去除玻璃体和晶状体。然后去除全部的视网膜色素上皮。将视网膜置于1.5毫升微量离心管中，在37°C下孵育10分钟。

随后，轻轻敲击离心管以使沉降的细胞松动。然后用 P1000 移液器轻柔吹打 10 至 20 次。如果仍有较大的组织团块存在，则在 37 摄氏度下额外孵育 10 分钟，并再次吹打 10 至 20 次。

接下来，向视网膜中加入5 µL DNA，浓度为10单位/µL，室温孵育5分钟。随后用P-1000移液器轻轻吹打10至20次。以3000 ×g离心3分钟。

然后移除上清液，底部保留 100 至 200 微升液体。轻敲离心管使沉淀松动。接着加入 1 毫升 HBSS，轻轻吹打重悬沉淀。

以3000 RPM离心三分钟。离心结束后，小心移除上清液。然后在下一步中将其重悬于450微升含有0.1% BSA的PBS中，并准备两块六厘米培养皿，每皿中加入五毫升添加了0.1% BSA的PBS。

将解离的细胞接种到下一个培养皿中。让细胞静置至少五分钟。之后，将含有解离细胞的培养皿置于倒置显微镜下观察。

使用带有吸管的细尖移液器收集单个细胞。然后将微小移液器靠近细胞，细胞将通过毛细作用迅速进入微小移液器内。随后将细胞排出至第二个培养皿中，并确保仅收集一个细胞用于基因表达谱分析。

可通过移除多余的细胞，或将目标细胞用新的微量移液器转移至其他位置来实现。当单个细胞完全与邻近细胞分离后，使用新的微量移液器吸取目标细胞，随后直接排入含有4.5 µL细胞裂解缓冲液的0.2 mL PCR管中。

在微量离心机中短暂离心样品，使细胞浸入裂解缓冲液中。每收集五个细胞后进行一次该离心操作，并在收集结束时再进行一次。请在整个单细胞分离过程中将离心管保持在冰上，并在组织解离后的两小时内完成单细胞的收集，以获得本实验的最佳结果；为确保单个细胞完全浸入细胞裂解缓冲液中，需再次在微量离心机中短暂离心样品。

为促进细胞裂解，将样品在热循环仪中于 70 摄氏度孵育 90 秒。随后立即将离心管放回冰上冷却两分钟。进行逆转录反应时，加入 0.33 µL。

将3号上标物质以每微升200单位的浓度加入0.05微升，抑制剂以每微升40单位的浓度加入0.07微升，T4基因32号蛋白加入离心管中。将反应混合物置于PCR仪中，50摄氏度孵育50分钟；孵育结束后，70摄氏度继续孵育15分钟以灭活酶。

操作完成后，将离心管放回冰上。为去除游离引物，向离心管中加入 0.1 微升 10× 外切酶缓冲液、0.8 微升 D H₂O 和 0.1 微升外切酶（浓度为每微升 20 单位），混匀后在 PCR 仪中 37 摄氏度孵育 30 分钟。

30分钟后，将反应混合物在80摄氏度孵育25分钟以灭活酶。结束后，将离心管放回冰上。接着，向样品中加入6微升加尾反应混合物。

在37°C条件下于PCR仪中孵育20分钟，70°C条件下孵育10分钟，然后置于4°C保存。随后，将10 µL带标签的样品加入PCR反应体系中。进行第二条链的合成及PCR扩增，以标记cDNA。

为了在iMatrix微阵列上获得稳定的杂交信号，首先通过将10至20微升单细胞cDNA加入8微升1× OneForAll缓冲液中来片段化cDNA。然后取1微升稀释后的DNA加入80微升反应溶液中。接着，向其中加入20微升5×TdT缓冲液、2.5微升生物素-dUTP以及1微升稀释的TdT酶。

接下来，向其中加入 20 µL 5×XTDT 缓冲液、2.5 µL 生物素标记的 dATP（biotin-16-dATP）和 1 µL TDT 酶。在 37 °C 下孵育 90 分钟，随后在 65 °C 下孵育 5 分钟。

随后将其储存在负20摄氏度，或立即用于a iMatrix微阵列杂交。以下是一个单细胞cDNA涂布及基因特异性PCR的代表性示例：泳道A、F、G、N、H含有清晰的cDNA涂布条带，而泳道B、C、D和E的条带则明显较弱。cDNA来自荧光标记的视网膜神经节细胞，并使用针对视网膜神经节细胞标志物BRN3B和PAC6的特异性PCR引物进行检测，以及针对光感受器细胞标志物的基因特异性PCR。

使用CRX来确定单细胞中的污染程度。通过检测缓激肽基因1（tachykinin one）的存在，筛选并鉴定了cDNAs以及视网膜神经节细胞的亚群。22个不同单细胞中部分选定基因的微阵列结果以热图形式展示。

芯片信号的强度已按红色深浅进行标度，黑色则表示芯片上无信号。通过此方法，可进一步采用QPCR等其他技术来验证芯片中观察到的基因表达模式。C杂交的结果也可用于解答您关于特定基因表达细胞位置的其他问题。

观看本视频后，您应该能够较好地掌握如何解离视网膜、分离单个细胞，并从这些单细胞中生成cDNA，用于微阵列杂交。