Name: 视网膜神经细胞发育和成熟的单细胞的剖析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学习单细胞转录组分析方法，通过显微操作分离视网膜细胞并进行cDNA扩增与芯片杂交。该技术可揭示稀有细胞群体的基因表达特征，助力神经发育与细胞治疗研究。

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1. 细胞解离
<ol>
	<li>本方案的流程图见图1。本方案所用试剂的具体目录号请参见表1。在PBS溶液中解剖视网膜。解剖过程中，最好去除玻璃体和晶状体，因为保留这些组织可能会影响组织的解离。并非在所有情况下都必须完全去除视网膜色素上皮（RPE），有时甚至无法将其完全去除。然而，在进行光感受器细胞的单细胞测序实验时，应尽量去除RPE。若未去除RPE，可能导致杆状细胞的表达谱中混入RPE特异性表达的基因，这可能是由于光感受器与RPE之间存在连接所致。 
	对于组织解离，将整个成年小鼠视网膜置于含有20 μl 激活的木瓜蛋白酶、20 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及360 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的1.5 ml 微量离心管中，于37 °C孵育10分钟。整个方案中所有步骤均使用带滤芯的移液器吸头，以最大限度减少潜在污染。木瓜蛋白酶的浓度和孵育时间需根据组织的年龄和性质进行调整。例如，对于出生后第0天（P0）获取的发育中视网膜，将其置于含10 μl 激活的木瓜蛋白酶、10 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及380 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，于37 °C孵育10分钟即可。不同物种的视网膜所需条件也略有差异。在大多数发育阶段，鸡的视网膜比小鼠视网膜更薄，使用10 μl 激活的木瓜蛋白酶、10 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及380 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS），于37 °C孵育5分钟即可完成解离。</li>
	<li>轻轻敲击离心管以使沉降的细胞松动，然后用p1000移液器轻柔吹打10–20次。若仍有较大的组织团块，于37 °C额外孵育10分钟，随后再次吹打10–20次。</li>
	<li>加入5 μl DNase I（10 U/μl），室温孵育5分钟。用p1000移液器轻柔吹打。具体吹打次数需根据实验经验确定，但通常在10–20次之间。</li>
	<li>在台式离心机中以3000 rpm离心3分钟，弃去上清液，保留管底100–200 μl液体，轻敲管壁使沉淀松动。加入1 ml HBSS，通过轻柔吹打重悬沉淀。此步骤中轻敲管壁至关重要，因为仅靠吹打重悬可能会裂解大量视网膜细胞，成年小鼠视网膜尤其如此。</li>
	<li>以3000 rpm离心3分钟，小心弃去上清液，用含0.1% BSA的450 μl PBS重悬细胞。应尽可能彻底去除上清液，以最大限度减少裂解细胞释放的mRNA以及解离过程中可能抑制后续反应的副产物。</li>
</ol>
2. 单细胞收获
<ol>
	<li>准备两个6 cm培养皿，每个皿中加入5 ml含0.1% BSA的PBS。将解离后的细胞接种至其中一个培养皿中，静置至少5分钟，使细胞沉降。所用细胞密度很大程度上取决于待分析单细胞的性质。例如，对于用荧光标记（如GFP）标记的稀有细胞，可将整个解离的视网膜组织接种于一个6 cm培养皿中。对于相对更丰富的细胞类型，则应初始接种较少细胞，以便更容易用第一根移液毛细管捕获一个（或接近一个）细胞。</li>
	<li>将含有解离细胞的培养皿置于倒置显微镜下。我们使用的是Olympus的IMT-2型号显微镜。使用拉制为细尖端的微移液毛细管（内径0.5 mm，外径1.04 mm）（图2），并配合吸管装置，捕获单个细胞。当微移液毛细管靠近培养皿中的细胞时，细胞会迅速进入毛细管内。吸管装置的长度必须适中，不能过长或过短，以适应倒置显微镜载物台的高度（我们使用的倒置显微镜配套吸管装置长度为38.1 cm）。若吸管过长，则细胞可能无法有效从微移液毛细管排出至收集管中。我们主要使用较早期的IMT-2型倒置显微镜，原因在于其载物台高度与我们的吸管组件配合最为理想。细胞（或多个细胞）进入微移液毛细管后，将其排出至第二个培养皿（洗涤皿）中，以确保仅收集一个且唯一一个细胞用于基因表达谱分析。在第二个培养皿中，通常需要使用新的微移液毛细管去除多余细胞，或将目标细胞转移至其他位置，以确保仅有一个细胞进入微移液毛细管。</li>
	<li>当单个细胞完全与邻近细胞分离后，使用新的微移液毛细管按照2.2节所述方法吸取目标细胞，随后直接将其排入含有4.5 μl细胞裂解缓冲液的0.2 ml PCR管中。细胞应排至管壁侧边，注意避免将微移液毛细管尖端折断在管内。样品可在台式微量离心机中短暂离心，使细胞浸入裂解缓冲液中。此类离心通常每收集5个细胞后进行一次，并在收集结束后再进行一次。含有裂解缓冲液的单细胞样品在单细胞分离全程中应始终保持在冰上。为获得最佳结果，建议在组织解离后两小时内完成单细胞收集。超过该时间后，应尽快进入逆转录步骤，因延迟已被观察到会增加RNA降解的风险。</li>
</ol>
3. 逆转录
<ol>
	<li>将样品在台式小型离心机中短暂离心，以确保所有单细胞均浸入细胞裂解缓冲液中。为促进细胞裂解，将样品在70 °C下于PCR仪中孵育90秒。随后立即将离心管放回冰上。</li>
	<li>将离心管置于冰上静置2分钟。所有试剂添加步骤均应使用带滤芯的移液器吸头，以防止污染。进行逆转录反应时，加入0.33 μl Superscript III (200 U/μl)、0.05 μl RNase抑制剂 (40 U/μl) 和0.07 μl T4基因32蛋白。将反应混合物在PCR仪中50 °C孵育50分钟。随后在70 °C孵育15分钟以灭活酶，并将样品置于冰上。</li>
	<li>为去除游离引物，加入0.1 μl外切酶缓冲液 (10X)、0.8 μl分子生物学级dH2O和0.1 μl外切酶I (20 U/μl)。在PCR仪中37 °C孵育30分钟。通过在80 °C孵育25分钟灭活酶，然后将离心管置于冰上。</li>
</ol>
4. 加尾与单细胞 PCR
<ol>
	<li>加入6 μl加尾反应混合物，使用PCR仪在37 °C孵育20分钟，70 °C孵育10分钟，然后保持在4 °C</li>
	<li>将10 μl加尾后的样品加入PCR反应混合物中，并按照以下条件进行第二链合成和PCR扩增：
	<ol>
		<li>95 °C预变性2分钟</li>
		<li>37 °C退火5分钟</li>
		<li>72 °C延伸16分钟</li>
		<li>93 °C变性40秒</li>
		<li>67 °C退火1分钟</li>
		<li>72 °C延伸6分钟，每个循环增加6秒</li>
		<li>重复步骤4共34次</li>
		<li>72 °C最终延伸10分钟</li>
		<li>保持在4 °C</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Affymetrix 芯片标记
<ol>
	<li>标记10-20 μg的cDNA（单个细胞扩增所得cDNA的浓度通常约为1 μg/μl），以在Affymetrix芯片上获得较强的杂交信号。首先，将10-20 μl单细胞cDNA加入8 μl 1X One-Phor-All缓冲液和1 μl稀释后的DNaseI（用1X One-Phor-All缓冲液按1:10稀释），总体积为80 μl。在PCR仪中37 °C孵育13分钟。然后100 °C加热15分钟以灭活DNase I，随后置于冰上。</li>
	<li>加入20 μl 5X TdT缓冲液、2.5 μl Biotin N6-ddATP（Enzo Biosciences）和1 μl TdT（用TdT缓冲液按1:8稀释）。</li>
	<li>37 °C孵育90分钟，随后65 °C孵育5分钟。产物可保存于-20 °C，或立即用于Affymetrix芯片杂交。杂交步骤依照Affymetrix标准操作流程进行。</li>
</ol>
6. 代表性结果
为评估 cDNA 的质量，取 10 μl cDNA 样品上样至 1% 琼脂糖凝胶。cDNA 主要通过 cDNA 弥散条带的大小范围（500–2000 bp）及其强度进行判断（图 1 和 图 3a）。在 图 1 所示的凝胶中，每隔一条泳道显示的是从 E16.5 小鼠视网膜细胞分离得到的 cDNA 弥散条带，中间的泳道则显示仅将培养基吸入并注入 PCR 管后产生的结果。这些对照泳道中有时仍可见微弱的弥散条带，但使用基因特异性 PCR 引物进行扩增时不会产生任何特异性产物。此外，cDNA 弥散条带的强度可能存在一定差异（可比较 图 1 与 图 3a）。在 图 3a 中，泳道 a、f、g 和 h 的 cDNA 弥散条带较强，而泳道 b、c、d 和 e 的条带则明显较弱。
基因特异性PCR被用作对单细胞cDNA质量进行二次筛选的方法。图3中的cDNA来自荧光标记的视网膜神经节细胞，并使用针对视网膜神经节细胞标志物Brn3b和Pax6的PCR引物进行检测。在该实验中，取1 μl cDNA进行30个循环的PCR扩增。实时定量PCR是更理想的检测方法，但其成本可能过高，且在仅需评估cDNA质量的情况下并非必需。所检测的8个单细胞中，全部对Brn3b呈阳性，其中6个对Pax6呈阳性（图3b）。即使cDNA条带强度较弱，也能扩增出Brn3b和Pax6的条带。尽管PCR结果显示如此，但根据我们的经验，如泳道b、c、d和e所示的cDNA条带通常在Affymetrix芯片上无法产生强烈的杂交信号，因此一般应避免使用。通过针对光感受器标志物Crx的基因特异性PCR，可评估单细胞cDNA中的污染程度（图3b）。选择光感受器标志物是因为这类细胞占视网膜细胞的大多数（约70%），因此任何发生的细胞裂解最可能涉及视杆细胞。即使经过30个PCR循环，这些cDNA样品中仅能检测到极微量的Crx。最后，这种基于PCR的筛选方法还可用于在对cDNA进行全基因组微阵列分析之前，初步判断其来源于特定细胞类型的哪些亚群，从而有助于优先选择需进行表达谱分析的细胞，因为这一步骤是整个流程中最昂贵的环节。例如，我们通过检测Tachykinin1基因的存在，已鉴定出视网膜神经节细胞中的特定亚群（图3b）。
通过小规模的基于PCR的筛选，选择特定的单个细胞，并将其cDNA与Affymetrix微阵列进行杂交。通过比较微阵列数据，并利用标准的聚类算法可发现表达模式。如图4所示，生成热图以图形化地展示数据。关于图4中的单细胞分析数据，可得出两个主要结论。首先，在完成单细胞实验流程后，特定细胞类型中表达的基因几乎仅存在于该特定细胞类型中。在少数情况下，某一细胞类型的标志基因也会在另一细胞类型中被检测到，例如双极细胞以较低水平表达某些“视杆细胞”基因；此类在第二种细胞类型中的表达通常可通过原位杂交或抗体染色实验轻易验证。其次，在更为多样化的无长突细胞和神经节细胞表达谱中，基因表达的异质性显而易见。Pou4f1仅在约1/4的发育期神经节细胞中表达，而Nr4a2和Scube2则是不同无长突细胞中异质性表达基因的两个实例。事实上，热图中展示的基因仅是极小的一部分样本，已有数百个基因被鉴定并确认为发育期神经节细胞的标志物，或不同亚群无长突细胞的标志物2,4。
<img alt="通过木瓜蛋白酶消化从分离的视网膜到单细胞分离的示意图，附质量检测结果。" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 单细胞分析方法的流程图。 首先，分离视网膜并通过木瓜蛋白酶消化将其解离为单个细胞。其次，使用拉制的玻璃针采集单个细胞，并将其转移至PCR管中。细胞经裂解后，通过逆转录结合PCR扩增cDNA。使用琼脂糖凝胶电泳评估所得cDNA的质量，如图所示。在第一泳道的DNA Marker之后，各泳道依次显示来自单细胞的cDNA弥散条带（以红色括号标示）与培养基阴性对照的扩增产物交替排列。此类质量的条带（红色括号内）可用于与Affymetrix微阵列进行杂交。
<img alt="带针头的导尿管；用于尿液引流的医疗设备装置。" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 针头与吸管装置的照片。 单个细胞通过拉制的玻璃微量移液管（内径 0.5 mm，外径 1.04 mm）的毛细作用分离，并通过向吸管中吹气产生的压力进行转移。吸管必须足够长以便于操作，同时又足够短以可靠地释放单个细胞，这一点非常重要。B 图显示了拉制成针头的毛细管的放大视图。
<img alt="PCR电泳结果；DNA条带，阴性对照，基因表达（Brn3b、Crx、Pax6、Tach）。" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 单细胞cDNA扩增产物的代表性电泳图及基因特异性PCR结果。 为评估单细胞cDNA扩增后的质量，取每个单细胞样本10 μl与阴性对照一同在1%琼脂糖凝胶上电泳（A）。应可见500–2000 bp范围内的弥散条带（smear）。进一步通过基于PCR的特定基因筛查，可帮助鉴定或确认所分离细胞的类型以及样本中可能存在的污染程度（B）。使用针对视网膜神经节细胞标志物Brn3b和Pax6的特异性引物，以验证这些细胞的身份（第1和第2行）。为评估制备样品中光感受器细胞污染的程度，采用针对光感受器标志物Crx的特异性引物（第3行）。部分亚群的神经节细胞还可通过检测如Tachykinin1等标志物进行鉴定（第4行）。
<img alt="视网膜细胞基因表达热图；杆状细胞、双极细胞、神经节细胞、无长突细胞中基因活性示意图" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 标记基因的单细胞表达。 以热图形式展示在 22 个不同单细胞中选择性表达基因的微阵列结果。微阵列信号强度已进行标准化，对应于红色的深浅程度。黑色表示微阵列上无信号。所示的视网膜神经节细胞（RGC）前体细胞来源于胚胎期时间点，而其他细胞则来源于成年视网膜。

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无利益冲突声明。

越来越多的研究揭示，在原本被认为基因表达较为均一的细胞群体中，细胞间的异质性十分显著6,8。至少已有研究表明，这种基因表达的“噪声”具有重要的生物学功能13。传统的整体组织检测方法会掩盖单个细胞之间的基因表达差异，这些实验所获得的是一个“平均”细胞的表达谱，可能并不具备代表性14。本文介绍一种从单个视网膜细胞中分离并鉴定其基因表达模式的方法。对单个细胞的研究使科研人员能够深入探究复杂组织背后存在的细胞异质性，这对于确定不同类型细胞特有的基因表达模式至关重要。此外，单细胞分离还可揭示在发育过程中不同时期驱动单个细胞活动的基因调控程序。尽管该方法在研究神经系统时尤为有用——因为复杂细胞网络的功能可能依赖于稀有细胞类型的独特基因表达——但本实验方案也可经调整后用于从多种组织中分离单个细胞。
在小鼠视网膜早期发育过程中，神经节细胞、水平细胞、视锥光感受器细胞以及无长突细胞均在重叠的时间窗口内生成15。此外，每个退出细胞周期的细胞均处于不同的成熟阶段，这一事实进一步增加了发育中视网膜的复杂性。最后，对于某...

发育中与成熟视网膜神经元的单细胞分析

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

高度特化的细胞群体虽然数量极为稀少，但在多种组织中发挥着重要作用。利用传统的整体组织研究方法，难以鉴定出这些极稀有细胞亚群的细胞类型特异性标志物和基因表达程序。对单个细胞进行基因表达谱分析，使得研究人员前所未有地能够获取仅占组织总体很小比例的细胞类型。1-7此外，该技术还可用于研究在动态发育转变过程中，少量细胞短暂表达的基因表达程序8.
中枢神经系统（CNS）中反复出现细胞多样性的这一问题，其中神经元连接可能发生在差异较大的细胞之间9。确切的不同细胞类型的数量尚不完全清楚，但据估计仅大脑皮层本身可能就存在多达1000种不同的细胞类型10。复杂神经回路的功能可能依赖于某些稀有的神经元类型及其所表达的基因。通过鉴定新的标记物并帮助在分子水平上对不同神经元进行分类，单细胞方法在神经系统细胞类型分析中尤为有用。该方法还可能通过识别神经前体细胞发育早期阶段差异表达的基因及基因通路，有助于阐明神经发育的机制。
由于结构简单且易于获取，并具有丰富的神经元多样性，脊椎动物视网膜是研究细胞发育、神经元分化及神经元多样化过程的优良模型系统。然而，与其他中枢神经系统区域类似，这种细胞多样性为确定驱动视网膜前体细胞选择特定细胞命运的遗传通路带来了挑战，尤其是考虑到视杆光感受器占视网膜细胞总数的大部分11。本文报道了一种用于鉴定单个视网膜细胞中表达转录本的方法（图1）。单细胞分析技术可用于评估视网膜不同细胞群体内存在的异质性程度2,4,5,12。此外，该方法已发现一系列新的候选基因，这些基因可能在视网膜前体细胞亚群的细胞命运决定过程中发挥重要作用8。通过对实验方案进行一些简单调整，该技术可应用于多种不同的组织和细胞类型。

本文描述了一种分离单个视网膜细胞并扩增其cDNA的方法。单细胞转录组学可揭示组织中细胞异质性的程度，并发现稀有细胞群体的新标记基因。 accompanying protocol 可根据多种不同细胞类型进行调整。

高度特化的细胞群体虽然数量极少，但在多种组织中发挥着重要作用。细胞类型特异性标志物的鉴定以及……

本实验的总体目标是分离单个细胞，用于基于微阵列的转录组分析。首先从周围组织中解剖出视网膜，然后将其解离为单个细胞，以实现这一目标。第二步是收集单个细胞，并将其移入含有裂解缓冲液的PCR管中。然后裂解细胞，并通过逆转录结合聚合酶链式反应扩增cDNA。最终，将单个细胞的cDNA杂交到AiMatrix微阵列上，以揭示该单个细胞中表达的mRNA。相较于使用整体组织方法，单细胞基因表达谱分析的主要优势在于，单细胞分离可使您获得那些在完整组织中仅占极小比例的细胞亚群。这些细胞可能是不同类型的神经元，也可能是数量较少的干细胞群体。单细胞技术使我们能够鉴定这些细胞的类型、这些小群体细胞的特异性标记物，并识别在这些极为稀有的细胞亚群中表达的基因网络。此外，单细胞分析技术使我们能够鉴定在少量细胞亚群经历高度动态的发育转变过程中短暂表达的基因网络。该方法有助于回答发育遗传学领域的一些关键问题，例如前体细胞何时开始表达与分化相关的基因网络，以及这些前体细胞彼此之间存在哪些差异。该技术的影响延伸至神经退行性疾病的细胞治疗，例如青光眼；因为通过阐明单个细胞发育过程中的关键网络，我们便向能够生成这些细胞用于细胞替代治疗的目标更近了一步。开始实验时，将小鼠视网膜置于盛有PBS的培养皿中。接下来，去除玻璃体和晶状体。然后去除全部的视网膜色素上皮。将视网膜置于1.5毫升微量离心管中，在37°C下孵育10分钟。随后，轻轻敲击离心管以使沉降的细胞松动。然后用 P1000 移液器轻柔吹打 10 至 20 次。如果仍有较大的组织团块存在，则在 37 摄氏度下额外孵育 10 分钟，并再次吹打 10 至 20 次。接下来，向视网膜中加入5 µL DNA，浓度为10单位/µL，室温孵育5分钟。随后用P-1000移液器轻轻吹打10至20次。以3000 ×g离心3分钟。然后移除上清液，底部保留 100 至 200 微升液体。轻敲离心管使沉淀松动。接着加入 1 毫升 HBSS，轻轻吹打重悬沉淀。以3000 RPM离心三分钟。离心结束后，小心移除上清液。然后在下一步中将其重悬于450微升含有0.1% BSA的PBS中，并准备两块六厘米培养皿，每皿中加入五毫升添加了0.1% BSA的PBS。将解离的细胞接种到下一个培养皿中。让细胞静置至少五分钟。之后，将含有解离细胞的培养皿置于倒置显微镜下观察。使用带有吸管的细尖移液器收集单个细胞。然后将微小移液器靠近细胞，细胞将通过毛细作用迅速进入微小移液器内。随后将细胞排出至第二个培养皿中，并确保仅收集一个细胞用于基因表达谱分析。可通过移除多余的细胞，或将目标细胞用新的微量移液器转移至其他位置来实现。当单个细胞完全与邻近细胞分离后，使用新的微量移液器吸取目标细胞，随后直接排入含有4.5 µL细胞裂解缓冲液的0.2 mL PCR管中。在微量离心机中短暂离心样品，使细胞浸入裂解缓冲液中。每收集五个细胞后进行一次该离心操作，并在收集结束时再进行一次。请在整个单细胞分离过程中将离心管保持在冰上，并在组织解离后的两小时内完成单细胞的收集，以获得本实验的最佳结果；为确保单个细胞完全浸入细胞裂解缓冲液中，需再次在微量离心机中短暂离心样品。为促进细胞裂解，将样品在热循环仪中于 70 摄氏度孵育 90 秒。随后立即将离心管放回冰上冷却两分钟。进行逆转录反应时，加入 0.33 µL。将3号上标物质以每微升200单位的浓度加入0.05微升，抑制剂以每微升40单位的浓度加入0.07微升，T4基因32号蛋白加入离心管中。将反应混合物置于PCR仪中，50摄氏度孵育50分钟；孵育结束后，70摄氏度继续孵育15分钟以灭活酶。操作完成后，将离心管放回冰上。为去除游离引物，向离心管中加入 0.1 微升 10× 外切酶缓冲液、0.8 微升 D H₂O 和 0.1 微升外切酶（浓度为每微升 20 单位），混匀后在 PCR 仪中 37 摄氏度孵育 30 分钟。30分钟后，将反应混合物在80摄氏度孵育25分钟以灭活酶。结束后，将离心管放回冰上。接着，向样品中加入6微升加尾反应混合物。在37°C条件下于PCR仪中孵育20分钟，70°C条件下孵育10分钟，然后置于4°C保存。随后，将10 µL带标签的样品加入PCR反应体系中。进行第二条链的合成及PCR扩增，以标记cDNA。为了在iMatrix微阵列上获得稳定的杂交信号，首先通过将10至20微升单细胞cDNA加入8微升1× OneForAll缓冲液中来片段化cDNA。然后取1微升稀释后的DNA加入80微升反应溶液中。接着，向其中加入20微升5×TdT缓冲液、2.5微升生物素-dUTP以及1微升稀释的TdT酶。接下来，向其中加入 20 µL 5×XTDT 缓冲液、2.5 µL 生物素标记的 dATP（biotin-16-dATP）和 1 µL TDT 酶。在 37 °C 下孵育 90 分钟，随后在 65 °C 下孵育 5 分钟。随后将其储存在负20摄氏度，或立即用于a iMatrix微阵列杂交。以下是一个单细胞cDNA涂布及基因特异性PCR的代表性示例：泳道A、F、G、N、H含有清晰的cDNA涂布条带，而泳道B、C、D和E的条带则明显较弱。cDNA来自荧光标记的视网膜神经节细胞，并使用针对视网膜神经节细胞标志物BRN3B和PAC6的特异性PCR引物进行检测，以及针对光感受器细胞标志物的基因特异性PCR。使用CRX来确定单细胞中的污染程度。通过检测缓激肽基因1（tachykinin one）的存在，筛选并鉴定了cDNAs以及视网膜神经节细胞的亚群。22个不同单细胞中部分选定基因的微阵列结果以热图形式展示。芯片信号的强度已按红色深浅进行标度，黑色则表示芯片上无信号。通过此方法，可进一步采用QPCR等其他技术来验证芯片中观察到的基因表达模式。C杂交的结果也可用于解答您关于特定基因表达细胞位置的其他问题。观看本视频后，您应该能够较好地掌握如何解离视网膜、分离单个细胞，并从这些单细胞中生成cDNA，用于微阵列杂交。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

视网膜神经细胞发育和成熟的单细胞的剖析

来源： Gómez-Villafuertes, R., et. al., 通过活体成像结合单细胞追踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学特性及谱系进展. J. Vis. Exp. (2017)...

活体成像与单细胞追踪监测成年神经干细胞中的神经谱系

来源： Laboissonniere, et. al．视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序．J. Vis. Exp. (2017)。...

通过荧光示踪鉴定小鼠视网膜神经节细胞亚型

我们报告了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞。该方法应用于荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）转基因小鼠时，可实现通过活细胞成像来研究细胞周期进程。...

成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

本文介绍了一种在分离神经元细胞前对其进行分类，并对单细胞转录组进行后续表征的组合方法。该方案优化了样本制备流程，以确保RNA测序（RNA-Seq）的成功，并描述了一种专门用于深入理解细胞多样性的方法学。...

视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序

本文介绍了一种通过延时视频显微镜监测神经细胞群体，并结合基于软件的后期处理的稳健方案。该方法是一种强大的工具，可用于在活体成像实验中识别特定细胞群体内的生物学事件。...

活体成像联合单细胞示踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学与谱系进展

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用基因编码的过氧化氢（H2O2）生物传感器，以评估H2O2在神经系统发育过程中生理信号传导的作用。该方法可应用于不同类型的细胞，并可通过实验处理进行改良，以研究活性氧（ROS）在一般发育过程中的作用。...

神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。...

利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

本方案为视网膜类器官样本的透射电子显微镜制备提供了优化且详细的实验流程，适用于对成熟视网膜类器官中突触结构进行分析的相关研究。...

为透射电子显微镜制备视网膜类器官样本

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

学习单细胞转录组分析方法，通过显微操作分离视网膜细胞并进行cDNA扩增与芯片杂交。该技术可揭示稀有细胞群体的基因表达特征，助力神经发育与细胞治疗研究。

发育中与成熟视网膜神经元的单细胞分析

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