Drosophila 幼虫中评估热伤害感受的局部与整体方法

以下实验的总体目标是检测果蝇幼虫的热伤害感受。该实验首先收集果蝇幼虫，随后将其暴露于有害的热刺激，作为可选的第二步。幼虫可接受紫外线照射，从而引起组织损伤并导致热伤害感受的敏化。随后可通过热探针对幼虫进行局部探测，或使用加热板进行整体刺激，以诱发可定量测量的伤害感受反应。

热探针实验表明，幼虫对热刺激的伤害性感受反应存在上限，并且输入温度与诱发反应的幅度之间存在出人意料的关系。热板实验显示，幼虫表现出一系列刻板的伤害性感受行为，这些行为依赖于周围水体的温度以及伤害性感受感觉神经元的活动。本文所述方法有助于回答热伤害感受领域的关键问题，例如动物对局部或全身施加的有害热刺激是否会产生不同的反应。

通常，初次接触热探针实验的人员会遇到困难，因为掌握该实验技术需要通过练习来尽量减少施加探针时的压力、位置和角度的变异。热板实验的可视化演示至关重要，因为随着温度升高所引发的行为变化需要通过直接观察才能得到充分理解。为了获得足够数量且具有特定基因型的子代幼虫，可直接培养所需品系，或在盛有果蝇食物的培养瓶中进行杂交，每瓶使用20至30只处女雌蝇和15至20只雄蝇。在产卵后第五天收集样本，用勺子挖出软化的培养基，再通过孔径为630微米的筛网在轻柔流动的水下冲洗，分离出早期三龄幼虫，随后将这些早期三龄幼虫转移至一小块湿润的食物垫上，以防止饥饿和干燥。

构建麻醉室后，使用镊子或画笔轻轻将10只早期三龄幼虫放置在盖子内侧，然后盖上盖子。在通风橱内操作，将麻醉室放入一个耦合罐中，罐内放置一个含有棉球的10毫升烧杯，棉球用1.5毫升乙醚浸湿。拧紧耦合罐的盖子，使幼虫暴露于乙醚蒸气中2至2.5分钟。

获得授权后，将授权室从Coplan罐中取出，在通风橱中静置数秒，使残留的乙醚蒸气挥发。使用喷水瓶将幼虫轻轻冲洗到一个小培养皿中。用纸巾吸干麻醉后的幼虫，然后将其背侧朝上轻轻固定在一条双面透明胶带上，该胶带已粘附于一个3英寸×1英寸的玻璃载玻片上。

将载玻片置于紫外照射室的底部表面，以20毫焦耳/平方厘米的强度对幼虫进行六秒的紫外光照射。照射后，将载玻片浸入水中，轻轻使幼虫从双面胶带上漂浮脱落。使用镊子或画笔小心地将照射后的幼虫转移至15 × 45 毫米的培养皿中。

一个一德拉姆的玻璃培养小瓶，内含一毫升果蝇食物，用于在25摄氏度或所需的培养温度下恢复8至24小时，然后再寄养果蝇。进行热伤害感受实验时，首先将热探针的温度预设至所需设定值。使用毛笔或镊子将单个幼虫轻轻转移至一个平坦的平台上，确保幼虫被一层薄水膜覆盖。

为了尽量减少压力变化，并确保热探针的位置和角度正确，需要通过练习来达到熟练。将探针尖端轻轻按压在幼虫的A4体节上，探针与幼虫表面之间呈约45度角，施加轻微压力。压力应在幼虫表面造成轻微凹陷，通常足以阻止其运动。

持续刺激幼虫，直至其表现出回避反应或达到第22次截止。表现出反应的幼虫通常首先出现抬头和翘尾的初步行为，随后发生至少旋转360度的卷曲回避行为。一旦回避行为开始，立即移开探针接触，并记录回避反应的潜伏期或所需时间。

如果在20秒内未观察到缩回行为，则该幼虫为无反应个体。调整光纤导光管的位置，以确保提供充足且高对比度的照明。观察幼虫时，将加热模块平放面朝上置于加热板中，然后将加热板放置在显微镜底座上。

将加热板调至高温档，等待约15分钟，使温度稳定在95摄氏度。量取80 µL蒸馏水，用微量移液器将水滴置于直径60 mm、高15 mm的聚苯乙烯培养皿中央。用镊子轻轻将一只清洁的三龄中期幼虫放入水滴中央，尽量避免带入额外的水分。

将培养皿轻轻放置在加热板的固体加热块上。迅速调整培养皿的位置，使整个幼虫和水滴均在视野范围内。启动计时器。

此时，将培养皿置于加热板的固体加热块上，并记录每种行为开始的时间。五、将浸在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到刻板的运动行为。在没有热刺激的情况下，正常行为表现为伞状运动，并伴随搜寻性的头部运动。

头部抽搐行为可能在幼虫快速向前或侧向移动头部时发生。这种运动与其在水中正常的运动方式相似，但表现出更剧烈且持续的翻滚动作。当幼虫侧向翻滚至少完整一圈（360度）时，即出现该行为。

该行为可发生次数不定，有时涉及不完整的翻滚。在评分时，仅统计完整的360度翻滚。此行为最类似于鞭状行为期间局部应用热探针时的场景。

幼虫沿前后轴表现出快速的收缩-舒张运动，使头部短暂地接近尾部。抽打行为常连续快速发生，有时与翻滚同时出现。最后，幼虫会表现出惊厥行为，常随后进入麻痹状态。在惊厥行为期间，幼虫沿前后轴伸展，并表现出高频的全身性颤动。

当幼虫停止运动时，会出现无弯曲麻痹的抖动行为。在部分幼虫中，这种状态是永久性的，而在另一些幼虫中，则会随后表现出低频脉冲式运动。在此按类别划分的应答率百分比图中，幼虫热伤害感受反应存在上限。在热探针实验中，当探针温度达到52°C时，100%的幼虫均为快速应答者。

然而，在 54 摄氏度及更高温度下，即使接触 20 秒，仍有 90% 或更多的幼虫无法产生反应。尽管这些幼虫在第 22 次截断后仍继续移动，但也可测量并绘制其翻滚次数或回避性回缩行为所花费的时间。令人惊讶的是，探针输入温度与反应强度之间似乎存在反向关系，因为较低的温度似乎会引发更多的翻滚次数。

将浸在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到五种典型运动行为。此处展示了在本实验所采用的最佳条件下，每种行为出现的平均潜伏期，以及对应各潜伏期测得的平均水滴温度；表现出每种特定行为的幼虫比例介于77%至100%之间。尽管偶尔会出现翻滚与抽打行为缺失、重叠或顺序颠倒的情况，此处仍展示了在加热板实验中出现麻痹行为后存活幼虫的比例。实验中将幼虫加热至出现麻痹，随后移至标准培养条件下恢复。

对照处理的幼虫接受了除热刺激外的相同处理，存活成虫中PPE的形成在第7至13天进行定量分析。此处，MD-G4驱动UAS调控的转基因在所有四类多树突外周感觉神经元中表达。UAS-OrkΔC表达一种经过修饰的果蝇开放整流钾离子通道，该通道是突触传递所必需的；而UAS-Ork1ΔNC则表达对该通道的进一步修饰版本，不会干扰突触传递。

请注意，只有同时携带 MD GAL4 驱动子和 UAS ORC1 ΔC 转基因的幼虫，在观察到的五种行为中的四种表现出延长的潜伏期。观看本视频后，您应能够充分理解如何测量果蝇幼虫对有害热刺激的局部和整体反应。这些方法可与其他技术（如遗传学分析）结合使用，以鉴定热伤害感受所必需的基因。在进行热探针实验时，务必注意尽量减少探针的压力、位置和接触角度的变异。