Name: 局部和全局的方法评估热痛觉果蝇幼虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学习使用热探针和热板对黑腹果蝇幼虫进行局部与全局热痛觉刺激的方法，定量测量其退缩反应与行为序列。该技术有助于研究热痛觉神经处理机制。

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感谢 Christian Landry 提供热探针设计，Daniel Babcock 开发了幼虫热探针实验，Sean Sweeney 建议使用热板实验，布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Drosophila Stock Center）提供果蝇品系，以及 Galko 实验室成员对稿件的审阅。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01 NS069828 基金（授予 MJG）以及 NIH MARC U-STAR 培训项目（T34GM079088，授予休斯顿大学市中心学者学院，用于支持少数族裔进入科研职业，AVG）资助。

用于制备正常或UV致敏幼虫以进行两种热伤害感受实验的典型实验步骤流程如图1所示。
1. 幼虫的制备
<ol>
	<li>可直接测试特定基因型的雄性和雌性子代幼虫。或者，可通过设置遗传杂交来获得目标基因型的子代幼虫。使用含果蝇培养基的培养瓶进行杂交，每瓶放入20-30只未交配雌蝇和15-20只雄蝇。</li>
	<li>产卵后第5天，通过舀出软化的培养基，并用流动水经630 μm（孔径）滤网轻轻冲洗，收集并清洗早期三龄幼虫。将早期三龄幼虫（沿前后轴长约3-4 mm）转移至一小块湿润的培养基垫上，以防饥饿和脱水。若需检测伤害性感觉致敏，则执行后续步骤2.1–2.11；若无需组织损伤处理而直接测试幼虫，则直接进入步骤3.1。</li>
</ol>
2. 醚麻醉与紫外照射
<ol>
	<li>构建一个乙醚麻醉室。
	<ol>
		<li>将一个1.5 ml微量离心管的底部切掉。</li>
		<li>使用加热的金属刮刀将微量离心管的切口边缘熔化。</li>
		<li>将细网固定在熔化的管口表面，待其冷却。该乙醚麻醉室允许乙醚蒸气进入，同时防止幼虫逃逸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子或画笔轻轻将10只早期三龄幼虫放入自制的乙醚麻醉室中。</li>
	<li>将幼虫放置在盖子内壁上，然后盖上盖子。</li>
</ol>
注意：接下来的两个步骤应在通风橱中进行，因为乙醚是一种可能爆炸的化学物质，其蒸气不仅能使幼虫麻醉，也能使人类麻醉。
<ol start="4">
	<li>将装有幼虫的麻醉室放入一个 Coplin 瓶中，Coplin 瓶内放置一个含有浸有约 1.5 ml 乙醚的棉球的 10 ml 烧杯。</li>
	<li>拧紧 Coplin 瓶的盖子，使幼虫暴露于乙醚蒸气中 2 至 2.5 分钟。注意，过长的麻醉时间可能对幼虫行为或存活产生不利影响。</li>
	<li>麻醉完成后，将麻醉室从 Coplin 瓶/烧杯中取出，在通风橱中静置数秒，使乙醚蒸气散去。此时可从通风橱返回实验台继续操作。</li>
	<li>使用喷水瓶轻轻冲洗麻醉室，将幼虫冲入一个小培养皿中。</li>
	<li>使用镊子和 Kimwipe 纸轻轻吸干麻醉后的幼虫，并将其背面向上固定在一条粘附于 3" × 1" 玻璃载玻片上的双面胶带上。</li>
	<li>将载玻片置于紫外照射室的底部表面，以 20 mJ/cm2 的强度对幼虫进行 6 秒的紫外照射。</li>
	<li>将载玻片浸入水中，使幼虫轻轻脱离双面胶带漂浮出来。</li>
	<li>使用镊子或画笔将照射后的幼虫轻轻转移至一个 15 × 45 mm 的一盎司玻璃培养管中，管内含有约 1.0 ml 果蝇食物，使其在 25 °C 或其他所需培养温度下恢复一段时间（8–24 小时），之后可重新收集用于热伤害感受实验。</li>
</ol>
3. 局部热探针实验
我们使用 Pro-Dev Engineering 公司（见材料表）定制制造的热探针，向单个幼虫体节施加有害的热刺激。尽管该探针具有优化的设计特征（约 0.07 mm 的小型金属尖端）2 区域以及精确维持设定温度的能力 23 °C 到 65 °C原则上，任何具有小型尖端且可在最高20秒时间内加热至设定温度的工具均可使用。该探针尖端用于刺激早期3rd instar幼虫精确置于腹部第A4节背中线处（参见 图2）。作为对这种热刺激的反应，幼虫通常会表现出逃避性的回撤行为，即侧向滚动360度或更大角度。该行为不同于幼虫对无害室温金属探针轻触刺激的反应，后者通常仅表现为运动活动的短暂暂停。13.
热探针实验方案：
<ol>
	<li>将热探针的预设温度调节至所需设定值。</li>
	<li>使用画笔或镊子轻轻将单个幼虫转移至一个平坦的平台（我们通常使用从文件夹上剪下的小块乙烯基材料）上，以便后续进行刺激。在与热探针接触前，幼虫应被一层极薄的水膜覆盖。覆盖幼虫的水膜应尽可能少，但需完全覆盖幼虫，同时确保幼虫接触乙烯基时不会干燥。</li>
	<li>以探针尖端轻轻按压幼虫A4体节，探针与幼虫表面之间约呈45°角，并施加轻微压力（参见图2）。压力应使幼虫表面产生轻微凹陷，通常足以阻止其运动。若幼虫继续移动，可略微增加压力，通常即可使其停止。对于超出视野范围移动或无法在整个刺激过程中保持探针稳定接触直至出现反应或达到20秒截止时间的幼虫，不应记录其数据。</li>
	<li>持续刺激幼虫，直至其表现出逃避反应或达到20秒截止时间，以先发生者为准。有反应的幼虫通常首先表现出抬头和翘尾的初步行为，随后通常会进行至少360度的滚动以完成逃避行为。仅将完整的360度滚动记为伤害性防御行为（初步的抬头或翘尾行为不计入）。</li>
	<li>一旦逃避行为开始，立即撤去探针接触，并记录逃避反应的潜伏期或所需时间。若在20秒内未观察到逃避行为，则该幼虫记为无反应者。有反应的幼虫可进一步分为两类：若逃避行为在5秒内出现，则该幼虫为快速反应者；若逃避行为在5至20秒之间出现，则该幼虫为慢速反应者（参见Babcock, et al. 2009)1中的图1）。</li>
</ol>
4. 全身性热板实验
热板实验旨在测量整个动物暴露于有害热刺激时黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的热伤害感受。将单个中期3龄幼虫置于直径60 × 15 mm培养皿中80 μl的水滴内——实验装置的示意图和照片见图3。随后将培养皿放置于一个固体加热块（称为“热板”）上。随着水滴温度升高，幼虫会表现出一系列五种刻板行为，我们将其命名为头部抽动、翻滚、鞭打、惊厥和麻痹。由于这些行为在一定程度上取决于热板的设定温度以及幼虫所处水滴的体积，本文提供了我们发现的最适条件（95 °C热板，80 μl水滴），在此条件下可观察到全部五种行为，且彼此之间的重叠最小。
热板实验方案：
<ol>
	<li>将光纤导光管放置到位，以确保幼虫观察区域具有充足且高对比度的照明。必要时可使用测试幼虫进行调整。光源功率应调至低档，以避免对受试幼虫产生环境热量影响。</li>
	<li>将加热模块平放于加热板上，并将加热板放置在显微镜底座上。将加热板调至“高”档，等待约15分钟使温度稳定，然后相应调节以达到所需的表面温度 95 °C.</li>
	<li>测量 80 μl 加入蒸馏水，并用微量移液器将水滴置于60 x 15 mm的聚苯乙烯培养皿中央。</li>
	<li>使用镊子轻轻放置一个洁净的中期3rd 将龄期幼虫置于水滴中央。转移幼虫时应尽量减少携带的水量，使待加热的水滴尽可能接近原始状态 80 μl.</li>
	<li>将含有水滴和幼虫的培养皿轻轻放置在加热板的固体加热块上。迅速调整培养皿的位置，使整个幼虫和水滴均处于视野范围内。参见 图3及视频1-6.</li>
	<li>当培养皿放置到加热板的固体加热块上时立即启动计时器，并记录每种行为开始的时间。如有需要，也可对行为进行视频记录——参见 视频 1-5 以每种行为的代表性示例为准。使用 Leica 软件版本 3.7 进行视频录制，录制模式为“Continuous”，相机分辨率为 3 兆像素（我们使用 0.63 倍缩放，此时计算得到的图像分辨率为 10 μm/pixe升/秒和帧/秒为44.5。</li>
</ol>
5. 典型结果
局部热探针检测：
当幼虫接触到热探针时，通常会表现出抬起头部和尾部的初步行为。通常先观察到头部抬起，随后是尾部抬起。在这一初步行为出现数秒后，幼虫通常开始进行横向翻滚，我们称之为“厌恶性撤退行为”。出现初步行为或撤退行为的时间可能因温度或遗传背景而异。在我们的初步研究中，我们测量了在不同探针设定温度下表现出厌恶性撤退行为的幼虫百分比，发现48 °C是所有幼虫均快速响应（< 5 s）的最低温度。在此，我们报告幼虫的热伤害感受反应存在上限（图4A）。当探针温度达到52 °C时，仍可观察到100%的幼虫快速响应。然而，在54 °C及更高温度下，90%或更多的幼虫即使在接触20 s后仍无反应。这些幼虫在20 s截止时间后仍继续移动。
如前所述1，可在每个温度下对回避行为的类别进行绘图并进行统计学比较。由于这是一种行为检测实验，不同幼虫之间以及不同操作者之间存在一定的变异性。为减少这种变异的影响，我们通常在每种测试条件下检测3组，每组30条幼虫。除了我们此前报道过的对回避潜伏期的简单分类外，本文还报告了可同时测量反应幅度（翻滚次数或处于厌恶性回避行为的时间）（见图4）。令人意外的是，输入温度与反应强度之间似乎存在反向关系，因为较低的温度似乎会引发更多的翻滚次数（图4B）以及更长的厌恶性回避行为持续时间（数据未显示）。这可能表明，对有害温度的暴露持续时间可能是决定反应强度的主要因素。
热板实验：
将浸没在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到五种刻板的运动行为。这些行为在视频中均有展示，并附有未加热幼虫在水中典型的运动行为作为对照。各行为出现的平均潜伏期如图5A所示，每个潜伏期对应的水滴温度平均值也在该图中呈现。在本文所述的最佳检测条件下，表现出每种特定行为的幼虫比例介于77%至100%之间（图5B），尽管偶尔会出现翻滚和抽打行为缺失、重叠或顺序颠倒的情况。按时间顺序观察到的行为描述如下，可在视频中标注的相应时间点观看：
<ol>
	<li>无热刺激时的正常运动： 伴随头部搜索动作的蠕动式运动。参见 6:27 开始的视频。</li>
	<li>头部抽动： 幼虫头部快速向前或侧向摆动。该动作类似于其在水中正常的运动行为（见视频 1），但更为急促且持续时间更长。参见 6:40 开始的视频。</li>
	<li>翻滚： 幼虫至少完成一次完整的 360° 侧向翻滚。参见 6:50 开始的视频。该行为可发生多次，有时包含不完整的翻滚。在行为评分时，仅计入完整的 360° 翻滚。此行为与局部热探针刺激所引起的行为最为相似。</li>
	<li>鞭打： 幼虫沿前后轴快速进行收缩-释放运动，使头部极短暂地接近尾部。参见 7:11 开始的视频。鞭打行为常与翻滚行为连续发生或同时出现。</li>
	<li>惊厥： 幼虫沿前后轴伸展，表现出高频的全身震颤行为，且不伴随弯曲。参见 7:25 开始的视频。</li>
	<li>麻痹： 幼虫停止运动。部分幼虫表现为永久性麻痹，而另一些随后则出现低频脉冲式运动。参见 7:36 开始的视频。</li>
</ol>
这些数据表明，水滴的温度与幼虫/水滴整体加热后出现五种特征性行为的潜伏期之间存在高度相关性。
<img alt="果蝇生命周期示意图；幼虫紫外线照射、乙醚处理、热实验；实验室方案。" src="/files/ftp_upload/3837/3837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1."> 
图1. 幼虫制备与检测实验步骤概览。在使用热探针或热板检测伤害感受之前，需从特定品系或遗传杂交中收集并清洗幼虫，去除食物残留。若需检测伤害感受致敏（而非基础伤害感受），则在收集幼虫后，依次进行乙醚麻醉（乙醚暴露）、固定、紫外线照射，并在果蝇食物上恢复一段时间。收集或恢复后的幼虫随后通过热探针（局部刺激）或热板（全身刺激）实验接受有害温度测试。图中数字对应方法部分中描述相应步骤的章节编号。
<img alt="早期幼虫的热反应；热探针装置，IV类神经元刺激，示意图。" src="/files/ftp_upload/3837/3837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2. 局部热探针实验装置示意图。热探针由温控单元控制，用于设定并维持探针的温度。探针垂直于身体前后轴放置，并以与水平方向成45°的角度刺激幼虫。探针接触点位于腹部第A4节段，如图所示。操作者需以轻微压力保持接触，直至达到20秒的时间上限，或直至幼虫开始翻滚行为。若温度被感知为有害，幼虫将表现出回避性撤退反应，特征为至少完成一次360°翻滚。翻滚次数可为单次或多次（见图 4B）。
<img alt="幼虫热实验装置：用于观察的载热板上培养皿的示意图和显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3837/3837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3。"> 
图 3. 热板实验的实验装置。（A）含有一个中龄3rd幼虫的60 × 15 mm培养皿的水平视图示意图，幼虫位于80 μl水滴中。（B）通过显微镜观察，幼虫位于水滴中央的俯视示意图。（C）本实验所用工作站的水平视图照片。（D）通过显微镜观察到的幼虫照片。
<img alt="温度响应曲线图；响应率的柱状图，温度对反应速度的影响。" src="/files/ftp_upload/3837/3837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4."> 
图4. 利用热探针实验定量分析行为反应。 （A）不同类别（快速反应者、慢速反应者和无反应者）的反应者百分比随温度变化的曲线图。（B）在逐渐增强的有害温度（42 °C、44 °C、46 °C、48 °C、50 °C 和 52 °C）下，幼虫表现出厌恶性撤退行为的潜伏期与其滚动次数的关系图。
<img alt="不同温度下的潜伏期与抑制行为；柱状图；蛹与成虫的存活率。" src="/files/ftp_upload/3837/3837fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5。"> 
图 5. 热板实验：潜伏期、温度与行为的关系。 （A）在最佳条件下（热板表面温度为 95 °C，水滴体积为 80 μl）每种行为反应的潜伏期及对应水滴平均温度（n = 150）。注意每种行为均出现在特定时间区间内。通过将热电偶插入水滴顶部或底部测量水滴温度（每个位置测量 10 滴），并取平均值。（B）在最佳实验条件下表现出每种行为反应的幼虫百分比。抽搐、强直和麻痹行为几乎在 100% 的情况下被观察到，而翻滚和抽打行为分别在 77% 和 80% 的情况下出现。在较低的表面温度设定点下，200 秒内未观察到强直和麻痹；而在较高的设定点下，翻滚和抽打行为可能被跳过或同时发生。n = 150。（C）在麻痹行为开始后仍能存活的幼虫百分比。将幼虫加热至出现麻痹初期即移出，并置于标准培养条件下恢复。对照组幼虫接受相同处理，但不进行热暴露。在第 7 至 13 天期间定量分析蛹的形成及可育成虫的出现。n = 120。
<img alt="Behavioral analysis bar chart; average latency for thrash, roll, whip, seizure, paralysis." src="/files/ftp_upload/3837/3837fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6."> 
图6. 幼虫伤害感受性感觉神经元的失活延长行为反应潜伏期. 不同基因型小鼠各行为潜伏期的曲线图： w1118，Gal4109(2)80 = md-Gal4/+, UAS-Ork1.Δ-C/+, UAS-Ork1.Δ-NC/+, md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-C 和 md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC。md-Gal4 在四类多树突周围感觉神经元中驱动UAS调控的转基因表达； UAS-Ork1.Δ-C14 表达一种经过修饰的版本 果蝇 开放整流型 K+ 通道，为突触传递所必需，且 UAS-Ork1.Δ-NC14 表达同一通道的另一种进一步修饰的版本，该版本不会干扰突触传递。请注意，仅含有这两个遗传元件的幼虫 md-Gal4 驱动程序6 以及 UAS-Ork1.Δ-C 转基因动物在五种观察到的行为中的四种表现出更长的潜伏期（抽搐、翻滚、惊厥和麻痹）。还需注意，由于翻滚的潜伏期增加，这些动物在翻滚前会出现抽打样动作。星号表示 p &lt; 通过学生t检验，p值为0.05。每种基因型使用30条幼虫。
补充视频 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3837/MovieS1NormalMovement.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
补充视频 2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3837/MovieS2Thrash.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
补充视频 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3837/MovieS3Roll.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
补充视频 4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3837/MovieS4Whip.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
补充视频 5。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3837/MovieS5SeizureParalysis.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
补充视频 6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3837/MovieS6All5Behaviors.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
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<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

本文所述的实验可用于定性及定量评估不同基因型幼虫对有害热刺激的反应性。热探针实验的一个主要特点是，刺激仅作用于单一特定位置。这可能仅导致一小部分IV类神经元放电——即探针接触体节内的神经元，以及可能邻近体节中的神经元11。由于刺激具有局部性，热探针实验模拟了感知局限于身体某一特定区域的有害刺激这一常见感觉体验——例如手接触热炉灶。热探针实验的一个缺点是存在一定的操作者间变异，这可能归因于三个因素：i）操作者将探针施加于幼虫时的压力大小，ii）探针在幼虫体表的位置相对于下方伤害感受神经元的精确程度，以及iii）探针接触幼虫体表时的确切角度。
我们先前报道了一种定量策略，可根据幼虫对特定温度的回缩潜伏期，将其分类为无应答者、慢应答者和快应答者1。本文中，我们报道了幼虫对更高温度的应答性。有趣的是，我们发现幼虫的热伤害感受反应存在一个上限，该上限介于52至54 °C之间。这可能表明幼虫缺乏能够在高于52 °C的温度下激活的瞬时受体电位（TRP）通道。或者，这也可能提示，用于启动或执行运动反应的神经元或肌肉在产生厌恶性回缩反应之前即已受损。我们还报道了对回缩反应幅度的另一种分析方法——使用翻滚次数作为反应“强度”的指标。直观上，人们会预期这些参数随温度升高或刺激时间延长而增加。然而令人意外的是，我们发现事实并非如此。在有害温度范围的低端（42 °C）长时间受到刺激的幼虫，其翻滚次数和翻滚持续时间均多于在较高温度（48–52 °C）下受到刺激的幼虫。这表明，在有害温度范围内，决定反应幅度的主要因素是暴露持续时间。由于暴露于高度有害温度（48–52 °C）的幼虫平均反应非常迅速，因此它们表现出的翻滚次数少于在较低有害温度下长时间暴露的幼虫。本文所报道的反应幅度分析为不同基因型或环境干预之间的比较提供了另一个定量维度。
热板实验的一个主要特征是，它涉及对有害热刺激的全局暴露。因此，这种情形更类似于动物置身于一个加热的容器中，而不是触碰一个发热的炉灶。尽管尚不清楚幼虫在自然环境中何时会经历全局性的有害刺激，但在实验室中，这种全局暴露所引发的行为反应比局部刺激所观察到的更为复杂。热板实验的一个优势（其他研究者也已指出3）在于其操作者之间的变异性极小，因为该实验流程不包含对幼虫的触碰操作。唯一的显著变异似乎在于如何界定每种行为的起始时刻，而这一点可通过反复观察和熟悉来最小化。不同实验方法之间一个有趣的差异在于引发厌恶行为的温度阈值。在热板实验中，这些行为的起始温度明显低于热探针实验。使用热探针接触幼虫时所引发的初期行为（抬头和翘尾）可能与热板实验中约27 °C时观察到的头部摆动行为相对应。这种反应可能更多反映的是“不适感”而非“疼痛”。即使在较高温度（高达48 °C）下，我们在热探针实验中也未观察到与抽搐、惊厥和麻痹行为相对应的现象，这表明可能需要来自身体多个区域的感觉神经元同时达到一定的激活阈值，才能诱发这些行为。有趣的是，惊厥和麻痹行为在热板实验中出现的温度（约34–37 °C）低于热探针实验中观察到的伤害感受阈值的下限，这表明全局刺激可能整合了多个神经元的反应，而这些反应在局部热探针刺激下不足以引发行为。这些温度确实对幼虫具有伤害性，这一点得到了以下观察结果的支持：开始出现麻痹行为的幼虫若随后被转移至果蝇食物上恢复，大多数情况下无法存活（图5C）。进一步支持热板实验反映的是伤害感受反应的证据是：阻断已知伤害感受感觉神经元的突触传递会显著延长大多数观察到行为的潜伏期（图6）。值得注意的是，高温下的抽搐行为潜伏期并未延长，这表明该行为可能依赖于其他不表达md-Gal4的感觉神经元。
总之，两种实验均涉及将单个幼虫暴露于特定温度的有害热刺激下——局部实验中使用小型金属探针的加热尖端，整体实验中则将其浸入迅速升温的水滴中。对幼虫的行为反应进行观察 黑腹果蝇 具有不同遗传背景和/或暴露于不同环境条件（例如，有无组织损伤）的幼虫，均可通过这些检测方法进行研究和量化。最终，这些检测的结果将有助于我们更深入地理解控制伤害性感受的遗传网络 果蝇 及其他相关物种。

<table><tbody><tr><td>热探针 </td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>按需定制</td><td>可根据要求提供联系方式 </td></tr><tr><td>干浴孵育器 </td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>11-718</td><td>配备1个实心加热模块和1个带16 mm孔的加热模块 </td></tr><tr><td>Leica DFC290 12 V/400 mA 彩色相机 </td><td>徕卡显微系统（Leica Microsystems）</td><td>12730080</td><td>任何等效&lt;br/&gt; 相机均可使用。</td></tr><tr><td>Leica MZ6 体视显微镜 </td><td>徕卡显微系统（Leica Microsystems）</td><td>MZ6 变倍镜体（光学支架）的部件号为 10445614</td><td></td></tr><tr><td>Schott Ace Modulamp 灯具 </td><td>Schott AG</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott 双蛇形管 23 英寸光纤导光臂 </td><td>Schott AG</td><td>Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>温度控制单元 </td><td>TSCI 公司</td><td>定制设备</td><td>可根据要求提供详细信息 </td></tr><tr><td>蔡司 Stemi 2000 体视显微镜 </td><td>卡尔·蔡司公司（Carl Zeiss, Inc.）</td><td>NT55-605</td><td>任何等效&lt;br/&gt; 显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>镊子 </td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>FS-1670</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 网格筛网 </td><td>Genesee Scientific</td><td>57-101</td><td></td></tr><tr><td>画笔 </td><td>Blick 艺术材料公司</td><td>06762-1002</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪 </td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>1199289</td><td></td></tr><tr><td>柯普林瓶（Coplin 瓶） </td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 烧杯 </td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>02-540C</td><td></td></tr><tr><td>乙醚 </td><td>赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>35 × 10 mm 聚苯乙烯培养皿 </td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td>我们尚未测试&lt;br/&gt; 其他替代培养皿。</td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片 </td><td>康宁公司（Corning）</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>热电偶 </td><td>欧米茄工程公司（Omega Engineering, Inc.）</td><td>HH802U</td><td></td></tr><tr><td>一段乙烯基材料 </td><td>Office Depot</td><td>480009</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 </td><td>Denville Scientific</td><td>C-2170</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila 幼虫中评估热伤害感受的局部与整体方法

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

本文中，我们展示了用于研究热痛觉的研究方法 果蝇 幼虫。一种检测方法涉及对热伤害感受器进行空间限制性（局部）刺激1,2 而第二种情况涉及大多数或全部此类神经元的全面（全局）激活3这些技术共同实现了对行为功能的可视化与定量分析 果蝇 伤害性感觉神经元
Drosophila 幼虫是一个成熟的模型系统，用于研究热伤害感受（thermal nociception），即对潜在有害温度的感官反应，这种反应在进化上在不同物种间高度保守1,2。利用 Drosophila 进行此类研究的优势在于其神经系统的相对简单性，以及可用于解析潜在生物学分子基础的成熟遗传学技术4-6。在 Drosophila 中，如同在所有后生动物中一样，对有害热刺激的反应通常表现为一种“伤害回避性”的厌恶性撤退反应7。此类刺激通过游离神经末梢或伤害感受器（nociceptors）被感知，机体反应的强度取决于接收有害刺激的伤害感受器数量8。在 Drosophila 中，是IV类树突分支感觉神经元负责检测有害的热刺激和机械刺激9，此外，这些神经元还具有最近发现的感光功能10。这些神经元在发育层面已被广泛研究，其树突在屏障性的表皮层上广泛分支，并与几乎所有表皮细胞形成接触11,12。每个IV类神经元的单根轴突投射至中枢神经系统的腹神经索11，在那里可能与投射至脑部的二级神经元相连接。
在基础条件下，伤害性感觉神经元不会放电，直到达到相对较高的阈值。本文所述的检测方法可使研究者量化基础行为反应，或推测组织损伤后继发的敏感化过程。每种检测方法均可引发对有害热刺激产生不同但相关的运动行为反应，并允许研究者观察和量化黑腹果蝇（Drosophila）幼虫热伤害感受的各个方面。这些检测可用于具有特定基因型的幼虫，或在可能影响伤害感受的不同环境条件下培养的幼虫。由于热伤害感受在物种间具有保守性，通过黑腹果蝇（Drosophila）进行的遗传学解析所得发现，将有助于增进我们对其他物种（包括脊椎动物）热伤害感受的理解。

本文中，我们展示了用于研究热痛觉的研究方法 果蝇 幼虫。一种检测方法涉及对空间局限（局部）的热伤害感受器进行刺激1,2 而第二种情况则涉及对大部分或全部此类神经元的全面（全局）激活3这些技术共同实现了对行为功能的可视化与定量分析 黑腹果蝇 伤害性感觉神经元

Drosophila 幼虫中评估热伤害感受的局部与整体方法

本文中，我们展示了用于研究黑腹果蝇幼虫热伤害感受的检测方法。其中一种检测方法涉及对特定空间范围（局部）的刺激……

以下实验的总体目标是检测果蝇幼虫的热伤害感受。首先收集果蝇幼虫，随后将其暴露于有害的热刺激中，作为可选的第二步。幼虫可接受紫外线照射，从而引起组织损伤并导致热伤害感受的敏化。随后可通过热探针进行局部探测，或通过热板进行整体探测，以诱发可定量测量的伤害感受反应。热探针实验表明，幼虫对热刺激的伤害性感受反应存在上限，并且输入温度与诱发反应的幅度之间存在出人意料的关系。热板实验显示，幼虫表现出一系列刻板的伤害性感受行为，这些行为依赖于周围水体的温度以及伤害性感受感觉神经元的活动。本文所述方法有助于回答热伤害感受领域的关键科学问题，例如，动物对局部或全身施加的有害热刺激是否表现出不同的反应。初学者通常难以掌握热探针实验，因为熟练掌握该实验需要反复练习，以尽量减少施加探针时的压力、位置和角度的变异。热板实验的可视化演示至关重要，因为随着温度升高所引发的行为反应必须通过实际观察才能充分理解。为了获得足够数量的目标基因型后代幼虫，可直接培养所需品系，或在盛有果蝇培养基的瓶子中进行杂交：在产卵后五天，使用20至30只未交配雌蝇和15至20只雄蝇进行交配；收集早期三龄幼虫时，先挖出软化的培养基，再用流动的清水通过孔径为630微米的筛网过滤冲洗；随后将早期三龄幼虫转移至一小块湿润的培养基垫上，以防止饥饿和脱水。构建麻醉室后，使用镊子或画笔轻轻将10只早期三龄幼虫放置在盖子内侧并关闭。在通风橱内操作，将麻醉室放入一个耦合罐中，罐内放置一个含有棉球的10毫升烧杯，棉球用1.5毫升达氏乙醚浸润。旋紧耦合罐的盖子，使幼虫暴露于乙醚蒸气中2至2.5分钟。完成电击授权后，将电击授权室从 Coplan 罐中取出，在通风橱中静置数秒，使残留的乙醚蒸气充分挥发。使用喷水瓶将幼虫轻轻冲洗出授权室，收集至一个小的培养皿中。用纸巾吸干麻醉后的幼虫，然后将其背部朝上轻轻贴附于一条固定在 3 英寸 × 1 英寸玻璃载玻片上的双面 Scotch 胶带上。将载玻片置于紫外照射室的底面，以20毫焦耳/平方厘米的强度对幼虫照射紫外线6秒。照射后，将载玻片浸入水中，轻轻使幼虫从双面胶带上漂浮脱落。使用镊子或画笔将照射后的幼虫轻轻转移至15×45毫米的培养皿中。一个一德拉姆的玻璃培养瓶，内含一毫升果蝇食物，用于在25摄氏度或所需的培养温度下恢复8至24小时，然后再寄生。进行热伤害感受实验时，首先将热探针的温度预设至所需的设定值。使用画笔或镊子将单个幼虫轻轻转移至一个平坦的平台上，确保幼虫被一层薄水膜覆盖。为了尽量减少压力变化并确保热探针位置和角度的准确性，需要通过练习达到熟练。轻轻将探针尖端以大约 45 度角抵在幼虫的 A4 体节处，探针尖端施加轻微压力。该压力应在幼虫表面产生轻微凹陷，通常足以抑制其运动。持续刺激幼虫，直至其表现出回避反应或达到第22次截止。表现出反应的幼虫通常首先出现抬头和翘尾的初步行为，随后发生至少旋转360度的卷曲回避行为。一旦回避行为开始，立即移开探针接触，并记录回避反应的潜伏期或所需时间。如果在20秒内未观察到缩回行为，则该幼虫为无反应个体。调整光纤导光管的位置，以确保提供充足且高对比度的照明。观察幼虫时，将加热模块平放面朝上置于加热板中，然后将加热板放置在显微镜底座上。将加热板调至高温档，等待约15分钟，使温度稳定在95摄氏度。量取80微升蒸馏水，用微量移液器将水滴置于一个60乘15毫米的聚苯乙烯培养皿中央。用镊子轻轻将一只清洁的三龄幼虫中期样本放入水滴中央，尽量避免带入额外的水分。将培养皿轻轻放置在加热板的固体加热块上。迅速调整培养皿的位置，使整个幼虫和水滴均在视野范围内。启动计时器。此时，将培养皿放置在加热板的固体加热块上，并记录每种行为开始的时间。五、将浸在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到刻板的运动行为。在无热刺激的情况下，正常行为表现为伞状运动，并伴随有探索性的头部运动。头部抽搐行为可能在此时出现，即幼虫头部快速地进行前向或侧向运动。这种运动与其在水中正常的运动方式相似，但动作更为急促且持续地伴随翻滚。当幼虫侧向翻滚至少完整一圈（360度）时，即发生该行为。该行为可能以不同的次数发生，有时涉及不完整的翻滚。在评分时，仅统计完整的360度翻滚。此行为最类似于在鞭状行为期间局部应用热探针时的场景。幼虫沿前后轴表现出快速的收缩-舒张运动，使头部短暂地接近尾部。抽打动作常连续快速发生，或与翻滚同时出现。最后，幼虫会表现出惊厥行为，通常随后出现麻痹。在惊厥行为期间，幼虫沿前后轴伸展，并表现出高频的全身性颤动。当幼虫停止运动时，会出现无弯曲麻痹的抖动行为。在部分幼虫中，这种状态是永久性的，而另一些幼虫则随后表现出低频脉动运动。在此表示各分类中响应者百分比的图中，幼虫热伤害感受反应存在上限。在热探针实验中，当探针温度高达52°C时，100%的幼虫均为快速响应者。然而，在54摄氏度及更高温度下，即使接触20秒，仍有90%或更多的幼虫无反应。尽管这些幼虫在第22次截断后仍继续移动，但其翻滚次数或处于厌恶性退缩行为的时间仍可被测量并绘图。令人惊讶的是，探针输入温度与反应强度之间似乎存在一种反向关系，即较低的温度似乎会引发更多的翻滚次数。将浸在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到五种刻板的运动行为。此处展示了在本实验所述最佳条件下，每种行为出现的平均潜伏期，以及对应各潜伏期测得的平均水滴温度；表现出每种特定行为的幼虫比例介于77%至100%之间。尽管偶尔会出现翻滚与抽打行为缺失、重叠或顺序颠倒的情况，此处仍展示了在加热板实验中出现麻痹行为后幼虫的平均存活率。实验中将幼虫加热至出现麻痹，随后转移至标准培养条件下使其恢复。对照处理的幼虫接受了除热刺激外完全相同的操作，且在第7至13天时，存活成虫中PPE的形成呈定量状态。此处，MD G四号驱动UAS调控的转基因在全部四类多树突外周感觉神经元中表达。UAS或one delta C表达一种经修饰的果蝇开放整流钾离子通道，该通道为突触传递所必需；而UAS orrc one delta NC则表达同一通道的进一步修饰版本，该版本不干扰突触传递。请注意，只有同时携带 MD GAL4 驱动子和 UAS ORC1 ΔC 转基因的幼虫，在所观察的五种行为中的四种表现出显著延长的潜伏期。观看本视频后，您应能够充分掌握如何测量果蝇幼虫对有害热刺激产生的局部和整体反应。这些实验步骤可与其他方法（如遗传学分析）结合使用，以鉴定参与热伤害感受所需的基因。在进行热探针实验时，务必注意尽量减少探针的压力、作用位置和接触角度带来的变异。

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