Name: ECIS的/出租车细胞趋化测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 了解ECIS/Taxis系统自动化实时测量细胞趋化的方法，利用电阻抗传感技术追踪Jurkat T细胞向趋化因子SDF-1α的迁移过程。该技术可实时监测细胞到达靶电极时的电阻变化，为研究细胞行为提供高效工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（ES07408 和 EB00208）资助。

1. ECIS/趋化电极制备
<ol>
 <li>在无菌条件下，室温下用无菌的10 mM半胱氨酸水溶液（dH2O）处理ECIS/趋化电极阵列（每张载玻片含8个腔室）的金表面15分钟，以进行预处理并稳定表面。</li>
 <li>吸除各电极腔室中的半胱氨酸溶液，用无菌去离子水（dH2O）冲洗3次。</li><li><li><li><li></li></ol><ol><li></li><li><li><li></ol><ol><li></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li></li><li></ol><ol><li></li><li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li></ol><ol><li><li><li></li><li></ol><img alt="归一化电阻随时间变化图；显示RPMI 1640和SDF1a对细胞行为的影响" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> <img alt="微流控芯片示意图；用于芯片实验室分析、细胞分选或诊断的通道和入口" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图2"> <img alt="趋化性示意图，包含细胞迁移、2 mm宽度、趋化因子井和细胞井、靶电极" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> <img alt="靶电极放置的钻孔过程；示意图显示电极设置间距为4.08 mm" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图4"> <img alt="电极设计示意图，包含靶电极和用于电导分析的金点" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图5">

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li>
<li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li>
<li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li>
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<li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis%3A+an+evaluation+of+the+cortical+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li>
<li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li>
<li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li>
<li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li>
<li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells%3A+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li>
<li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li>
<li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li>
<li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li>
</ol>

David A Knecht 和 Michael A Lynes 拥有 ECIS/Taxis 技术的已授权专利，该专利已由康涅狄格大学授权给 Applied Biophysics, Inc. 公司。

ECIS/趋化性检测的新特性在于其能够在细胞对趋化因子作出反应时自动收集实时数据。尽管该技术最常见的应用是测量细胞对单一趋化梯度，或由趋化激动剂与拮抗剂混合组成的梯度的反应，但ECIS/趋化性方法也可灵活适用于这些配置的多种变体，从而在评估细胞反应性方面提供重要帮助。已有充分证据表明，重叠或连续的梯度能够以新颖的方式影响细胞行为。此外，这类更复杂的梯度在体内（in situ）很可能才是常态12, 13。
ECIS/趋化性检测能够以其他技术无法实现的方式模拟这些不同的浓度梯度构型。例如，通过增加额外的孔，可以调节梯度方向相对于细胞孔和目标电极的位置关系。此外，还可以设计该检测方法，将细胞置于其中一个孔中，作为趋化因子的来源。
在建立该检测体系时，必须保持覆盖在每个腔室中靶电极和对电极上方凝胶的完全水合状态，并且所打加样孔应与靶电极保持正确的空间位置关系。此外，细胞加样孔的底部必须与琼脂糖层下方形成的液态薄膜连续相通；细胞将在该液态薄膜中响应上方的浓度梯度而发生迁移。为此，必须彻底吸除所有琼...

<table><tbody><tr><td>ECIS Z&amp;#952;</td><td>Applied Biophysics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ECIS 电极阵列</td><td>Applied Biophysics</td><td>8W 趋化性</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biophysics.com/cultureware.php">www.biophysics.com/cultureware.php&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Seakem GTG 琼脂糖</td><td>BioWhittaker</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300703</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td>青霉素 5,000 IU/ml；链霉素 5 mg/ml</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>MP Biomedicals</td><td>1688449</td><td>1M 溶液，细胞培养级</td></tr><tr><td>14 号不锈钢套管（2 根）4 英寸</td><td>General Supply</td><td>5-8365-1</td><td>钝头</td></tr></tbody></table>

使用ecis/趋化系统测量细胞趋化性

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

细胞对外部刺激的运动是许多细胞过程的基础，包括伤口愈合、炎症以及对感染的反应。一种常见的趋化性检测方法是Boyden小室实验，该方法将细胞与趋化因子通过多孔膜隔开。当细胞向趋化因子方向穿过膜迁移时，会黏附在膜的下表面，或落入下方的培养基中，随后经染色并通过显微镜进行计数1。在此方法中，细胞暴露于一种陡峭且短暂的趋化因子浓度梯度，这种梯度被认为不能很好地模拟组织中实际存在的梯度2。
另一种检测系统是琼脂糖下趋化性检测3, 4，用于测量细胞在琼脂糖层下方形成的薄水膜中沿固体基质的移动。琼脂糖中形成的浓度梯度较为平缓，被认为能够恰当模拟自然界中存在的梯度。趋化性可通过显微成像测量细胞迁移距离来评估。Boyden小室检测和琼脂糖下检测通常均被设置为终点检测。
自动化的 ECIS/趋化系统将琼脂糖下迁移法与电阻细胞-基底阻抗传感技术（Electric Cell-substrate Impedance Sensing, ECIS）5, 6相结合。在该检测中，每个8个腔室中均设有目标电极，一个大型对电极贯穿全部8个腔室（图2）。每个腔室均填充琼脂糖，并在目标电极两侧的琼脂糖中各切出一个小孔。其中一个孔中加入待测细胞群体，另一个孔则加入可扩散的趋化因子源（图3）。当电流通过系统时，可用于测定细胞经过目标电极时所引起的电阻变化。当细胞位于目标电极上时，系统的电阻增加6。此外，电阻的快速波动反映了细胞与电极表面相互作用的变化，提示细胞正在进行形态改变。ECIS/趋化系统可长时间实时监测细胞群体的迁移运动，同时具备足够灵敏度，能够检测到单个细胞到达目标电极的事件。
Dictyostelium discoidium 在叶酸浓度梯度存在时具有迁移能力7, 8，其趋化反应可通过 ECIS/Taxis 系统准确测定9。白细胞对 SDF1α 及趋化拮抗剂的趋化反应也已通过 ECIS/Taxis 进行测量10, 11。白细胞对 SDF1α 的反应示例见图1。

ECIS/Taxis 系统是一种可自动、实时检测细胞趋化性的实验方法。在此实验中，细胞在琼脂糖层下方移动，最终到达目标电极。细胞运动通过交流电流阻抗的初始变化进行测定。

使用ECIS/趋化系统测量细胞趋化性

细胞对外部刺激的运动反应是许多细胞过程的基础，包括伤口愈合、炎症以及对……的反应

本实验的总体目标是利用电细胞基底阻抗感应（EIS）技术，在自动化实时检测中测量趋化性。首先，用含0.5%琼脂糖的完全RPMI培养基填充每个腔室，以制备axxis电极。下一步是使用14号套管夹具在每个腔室的琼脂糖中同时切割出两个孔，并吸出每个腔室中的两个琼脂糖塞。一个孔中加入单细胞悬液，另一个孔中加入趋化因子。接着，通过置于培养箱中的阵列支架将电极连接至ISIS theta系统，培养箱内环境参数设置为适合待测细胞类型的气体环境。最终，当细胞迁移至两孔之间的目标电极时，可通过实时测量电阻变化来观察细胞的趋化性。与现有的Boyden小室法或传统的基于显微镜的琼脂下测定法相比，axxis检测的主要优势在于，它能够在无需持续人为干预系统的情况下，实现对趋化性的实时自动化测量。开始电极制备时，在无菌条件下，将ISIS Texas电极阵列的金表面用去离子水中含有10毫摩尔浓度的无菌半胱氨酸在室温下预处理15分钟，以稳定其表面。预处理完成后，从每个电极腔室中吸除半胱氨酸溶液。用无菌去离子水冲洗三次，然后加入 250 微升完全培养基。接下来，将电极阵列连接到仪器阵列支架的接触针上，以进行电极检测。在计算机屏幕上，连接正确的腔室将以绿色高亮显示。如果腔室显示为红色，则表示未连接，应重新调整电极在阵列支架中的位置，以确保所有腔室均建立连接。当所有腔室均连接后，点击 ISYS Theta 软件控制器中的检查按钮，以测定每个腔室的初始电阻和电容值：对于八腔室阵列，电阻值应在 1600 至 2000 欧姆之间，电容值应在 5 至 6 纳法之间。若某个腔室的参数超出上述可接受范围，则不应使用该腔室进行数据采集。接下来，将电极从阵列支架上断开，以准备单独的 aros 小室。吸出小室中的培养基，并用无菌去离子水将每个小室清洗三次。开始设置 aros 小室时，按照书面方案中所述，配制含有 RPMI 培养基的 aros 溶液。将300微升融化的aros培养基用移液器加入每个腔室中，将剩余的agros培养基移入15毫升离心管的管盖内。为评估agros凝胶情况，盖上ISIS axxis array的盖子，并在室温下静置使其凝固，以制备可重复使用的套管。使用完好的切割工具将两根14号钝端套管 sharpen（ sharpen此处为操作动词，按实验步骤保留原文动作描述，实际应为“磨锐”或“修整”之意，但根据指令保留不可变术语）。使用 5/64 英寸钻头，以低速电钻在每个套管开口内旋转钻头尖端，确保钻头切削每个套管开口的整个内边缘。为形成锋利的切割刃，先用 5/64 英寸钻头在有机玻璃上钻两个孔。使用台钻，将每个已 sharpened 的 14 号套管插入其中一个孔中，使各套管从有机玻璃表面伸出的长度相等。在EIS室中打孔制备小室前，通过轻微灼烧14号套管工具的套管尖端对其进行灭菌。将套管尖端接触15毫升

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