Name: 快速点护理依诺肝素的抗凝血剂功效的测定全血中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 了解如何使用肝素酶快速检测全血中依诺肝素的抗凝效果。该方法通过测定凝血时间评估低分子量肝素的药效，为临床抗凝治疗监测提供可靠依据。

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研究仅由部门和机构资源提供支持。凝血检测仪器（Hemochron 801）由制造商无偿提供使用，检测试剂盒以市售价格购得。视频中的引言图示改编自 Sanderink。 等12 视频中的第二幅图（肝素酶消化时间进程）经Inchiosa许可后复制 等1

1. 肝素酶的重悬
<ol>
 <li>冻干肝素酶I可从商业途径获得（Siemens，美国特拉华州纽瓦克，DadeHepzyme货号B4240-10），每瓶含有1 μg纯化蛋白。将该蛋白溶解于0.25 ml生理盐水（0.9% NaCl）中。</li>
</ol>
2. 血液样本的采集
<ol>
 <li>使用真空采血管采集两份血液样本，分别收集至含有枸橼酸钠（0.3 ml 0.109 M；3.2%）缓冲液的Vacutainer管（Becton-Dickinson；Franklin Lakes, NJ）中；两支采血管均预先加入已知浓度的依诺肝素；采集的血液体积为2.7 ml，总体积为3.0 ml。</li>
</ol>
3. 肝素酶消化
<ol>
 <li>将肝素酶小瓶中可吸入注射器的全部内容物（约 0.2 ml；小瓶总量的 80%；含 0.8 μg 蛋白质）转移至一个 Vacutainer 管中；在第二个管中加入 0.2 ml 生理盐水（0.9% NaCl），作为消除依诺肝素作用前的基线状态对照。</li>
 <li>将两个 Vacutainer 管均置于 Hemochron 仪器的恒温孔中，孵育 5 分钟。（我们先前已发表的研究证实，使用肝素酶消化 5 分钟的时间是充分的。1）</li>
</ol>
4. 凝血检测
<ol>
 <li>肝素酶孵育结束后，将2.0 ml血液转移至检测 cartridge 中。对于MAA管，其预先装有0.1 ml 250 mM CaCl2，以启动凝血过程。商用aPTT检测 cartridge（A104）设计用于启动已采集至含柠檬酸钠抗凝剂的真空采血管中的全血的凝固反应。</li>
 <li>Hemochron仪器会提示血液凝固完成，并以秒为单位记录凝固时间。肝素酶处理样本与基线样本之间的凝固时间差值，除以基线样本的凝固时间，即得到因依诺肝素消除所导致的凝固时间百分比下降值。如下文所述，凝固时间百分比下降值与添加了已知浓度依诺肝素的全血样本中依诺肝素浓度之间呈现出高度线性相关，且该值与通过显色法测定抗Xa活性所得到的依诺肝素浓度测量值之间也具有良好的相关性。依诺肝素浓度的抗Xa活性检测采用商用试剂盒进行两步显色法检测（BIOPHEN；Aniara，Mason，OH）。</li>
</ol>

<ol><li>Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+development+of+a+point-of-care+assay+of+enoxaparin+anticoagulant+activity+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).</li>
<li>Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aprotinin+prolongs+activated+and+nonactivated+whole+blood+clotting+time+and+potentiates+the+effect+of+heparin+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro.</a> Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).</li>
<li>Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+protamine+excess+on+blood+coagulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays.</a> Anesth Analg. 96, SCA39(2010).</li>
<li>Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+low+plasma+levels+of+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin.</a> Anesth Analg. 102, SCA10(2010).</li>
<li>Gogarten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+new+antithrombotic+drugs+on+regional+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Anaesthesiol%22%5BJournal%5D)">The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia.</a> Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).</li>
<li>Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+of+different+low-molecular+weight+heparins+used+at+therapeutic+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose.</a> Drug Saf. 28, 333-349 (2005).</li>
<li>Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+of+enoxaparin+among+obese+and+renal+impairment+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients.</a> Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).</li>
<li>El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+HEMOCHRON+JR.+HEMONOXTM+point+of+care+test+in+monitoring+the+anticoagulant+effect+of+enoxaparin+during+interventional+coronary+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).</li>
<li>Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+anticoagulant+activities+of+the+low+molecular+weight+heparin+fractions+and+fragments+with+flavobacterial+heparinase%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase.</a> Thromb Res. 44, 599-610 (1986).</li>
<li>Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+individuality+of+commercially+available+low-molecular-weight+heparins+and+their+generic+versions%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).</li>
<li>Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anticoagulant+heparinoids+by+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling.</a> Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).</li>
<li>Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+the+prophylactic+dose+of+enoxaparin+once+daily+over+4+days+in+patients+with+renal+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment.</a> Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该依诺肝素疗效检测方法可作为确定实施有出血或血肿风险的侵入性操作相对安全性的关键选择之一，尤其在考虑进行硬膜外注射时具有重要意义。大多数指南建议在注射依诺肝素后等待12小时再开始侵入性操作。5 肾功能损害、肥胖和妊娠可能影响依诺肝素的剂量需求。6,7 由于该检测可在10分钟内完成，因此也可在诊所或医生办公室中使用，为存在静脉血栓栓塞风险的患者提供抗凝是否充分的信息，并根据需要立即调整用药剂量。
可通过显色法测定依诺肝素对凝血因子Xa活性抑制程度，从而检测其在血浆中的浓度。然而，该方法仅能反映其浓度，而无法特异性地反映其抗凝疗效，后者在不同个体间存在显著差异。6-8
我们的研究仅使用依诺肝素进行。然而，可以预见该检测方法也可适用于任何可被肝素酶I降解的低分子量肝素（LMWH）。目前已知达肝素、那屈肝素和亭扎肝素即属于此类情况9-11。本检测方法的设计基于Hemochron凝血时间测定仪的特性。该仪器相对便宜；此外，完成一名患者检测所需的 disposable 血液采集管、肝素酶安瓿及检测试剂盒的成本约为15美元。因此，该方法预期适用于多种临床环境下抗凝状态的监测。

<table><tbody><tr><td>Hepzyme</td><td>Siemens AG</td><td>B4240</td><td>肝素酶 I</td></tr><tr><td>&quot;MAA&quot; 羧酸酯滤芯</td><td>Technidyne</td><td>FTK-ACT</td><td>经去除高岭土修饰</td></tr><tr><td>aPTT 滤芯</td><td>Technidyne</td><td>A104</td><td> </td></tr></tbody></table>

快速床旁检测全血中依诺肝素抗凝效果的分析方法

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

目前需要一种临床检测方法，用于确定患者血液中低分子量肝素（LMWH）依诺肝素抗凝作用的程度。在某些紧急临床情况下，若能快速获得这一信息将尤为重要。本检测方法旨在实现这一目标。我们仅对加入已知浓度依诺肝素的人血样本进行了检测。本方法的核心在于通过肝素酶将患者血液样本中的依诺肝素完全降解并使其失活，从而定量评估其抗凝效力。采集两份血液样本，分别置于加入依诺肝素的真空采血管（Becton-Dickenson；美国新泽西州富兰克林湖）中：其中一份样本在37 °C条件下经肝素酶消化5分钟，另一份则代表患者的基础抗凝状态。通过比较肝素酶处理样本相对于基础状态的凝血时间缩短百分比，即可得出依诺肝素的抗凝贡献。我们使用便携式、电池供电的Hemochron 801仪器（International Technidyne Corp.，美国新泽西州爱迪生）测量凝血时间。该仪器具有两个恒温控制（37 °C）的检测管孔。我们在仪器制造商提供的两种不同类型的检测 cartridge 中进行检测。其中一种 cartridge 经过改良以提高其灵敏度：通过大量蒸馏水冲洗去除FTK-ACT cartridge 中的高岭土，仅保留试管的玻璃表面及可能存在的检测磁珠作为激活物。我们将此称为最小激活检测（MAA）。我们及其他研究者已对最小激活检测的应用进行了研究2-4。另一种被研究的 cartridge 为活化部分凝血活酶时间（aPTT）检测 cartridge（A104），直接按制造商提供的方式使用。仪器的恒温孔同时用于肝素酶消化和凝血检测。该检测可在10分钟内完成。在典型的临床浓度范围内，MAA检测在依诺肝素经肝素酶消化后显示出明显的凝血时间变化。当每毫升血液样本中含有0.2抗Xa国际单位（I.U.）的依诺肝素时，肝素酶消化使凝血时间平均缩短9.8%（20.4秒）；当依诺肝素浓度为1.0 I.U./mL时，凝血时间缩短41.4%（148.8秒）。本报告仅介绍该检测方法的实验应用，其在临床环境中的实际价值仍有待进一步验证。

图1展示了在使用肝素酶消除依诺肝素后，一系列依诺肝素加标浓度（0.2、0.4 和 1.0 anti-Xa IU/mL）下凝固时间减少百分比的结果。图中同时呈现了MAA和aPTT检测盒的结果。各图横坐标还包含了通过显色法测定抗Xa活性所得的依诺肝素测量浓度。
图2展示了相同数据的曲线图，即凝血时间的百分比减少值相对于抗Xa活性的显色测定值。
在所有四个关系中均发现了具有高度统计学显著性的强线性相关性。
<img src="/files/ftp_upload/3852/3852fig1.jpg" alt="凝血时间与依诺肝素浓度的关系；MAA结果与aPTT检测图；数据分析" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 基于加入肝素酶后凝血时间百分比变化（缩短）对添加依诺肝素的全血样本进行床旁检测，评估依诺肝素对凝血时间的影响。横坐标显示添加至全血中的依诺肝素浓度及测得的抗Xa血浆浓度（均值 ± 标准误，括号内）。所有凝血时间的百分比变化均以均值和标准误表示，并附以凝血时间平均缩短的秒数。同一患者的数据显示通过虚线连接。图A（MAA结果）中标有星号的四位患者数据与图B（aPTT检测）中的四位患者数据相同。所有结果均为单次测定值。与MAA和aPTT检测的相关性分析所得Pearson相关系数分别为 r = 0.869（p = 1.9 × 10-5）和 r = 0.916（p = 2.8 × 10-5）。经Inchiosa et al.1许可转载
<img src="/files/ftp_upload/3852/3852fig2.jpg" alt="肝素酶消化与抗Xa活性、凝血时间减少、相关性图示、MAA、aPTT检测。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. 将床旁检测中凝血时间的百分比变化（见图1A和1B）与血浆抗Xa因子浓度进行对比作图。A，MAA检测结果；B，aPTT检测结果。所有数据均来自单次凝血时间检测和单次抗Xa因子浓度测定。MAA检测和aPTT检测的相关性皮尔逊相关系数分别为 r = 0.910（p = 2.5 × 10-6）和 r = 0.922（p = 2.0 × 10-5）。经Inchiosa et al.1许可转载。

演示一种快速定量检测低分子量肝素依诺肝素对血液凝固抑制作用的方法。通过肝素酶消化去除依诺肝素的影响，从而评估其作用贡献。该检测方法的更详细描述见于我们已发表的论文1。该检测仍需临床验证。

有必要开发一种临床检测方法，以确定患者血液在多大程度上被……有效抗凝

首先，我们介绍已发表的人体中低分子量肝素依诺肝素血浆浓度随时间变化的研究。今天，我们将展示使用一种快速即时检测法测定低分子量肝素的结果。本实验中的检测对象为依诺肝素（Enoxaparin）。本幻灯片所示结果描绘了持续每天一次、每次40毫克剂量给药后患者的血浆浓度。在末次给药后追踪其进一步消失过程，可见给药后约4小时达到峰值浓度，为0.4国际单位/毫升，该浓度处于药物的治疗范围内。另一个特别值得关注的点是给药12小时后仍残留多少药物，因为临床上普遍接受一项指南：在使用低分子量肝素（本例为依诺肝素）后，应至少等待12小时才能进行某些可能引起出血风险的侵入性操作。值得注意的是，此时仍可检测到明显数量的药物残留，我们在部分研究中已对此进行了重点关注，下文将予以展示。Sender 等人在本研究中还指出，肾功能损害个体在整个时间过程中药物浓度显著更高，由此可见，对于肾功能损害患者、孕妇或肥胖患者而言，12 小时的用药指南可能极为不充分。接下来，我将介绍参与纽约医学院此项研究工作的研究人员。我叫 Mario Osa。我是这里的药理学教授。我是苏里亚·帕图拉博士，纽约医学院临床麻醉学副教授。我叫凯沙尔·卡尔。我是一名三年级的医学生。这是我们进行这些检测所使用的仪器。该仪器由Omicron公司生产。它既可使用交流电源，也可使用电池供电，因此在这一意义上真正实现了床旁检测。该仪器具有两个温控恒温舱室，我们利用这两个舱室在正式检测前对样本进行预孵育，同时也用于凝固检测本身。该检测方法的一个重要特点是使用了高纯度的市售肝素酶制剂。我们从西门子公司购得此产品。该产品以非常稳定的形式提供，可 readily 溶于生理盐水或任何水溶液中。在我们的方法中，使用肝素 ACE 尤为重要，因为它使我们能够获得患者的基线凝血值。在无任何肝素影响的情况下，血管紧张素转换酶（ACE）能够完全降解低分子量肝素和未分级肝素，但此处我们特别关注的是低分子量肝素，旨在将其降解至失活状态，从而在无肝素干扰的条件下获得凝血时间的测定值。此处所展示的是低分子量肝素（本例中为依诺肝素）被肝素酶降解过程的时间进程。数据以基础切割时间的百分比形式绘制，因此我们在此看到的是，加入依诺肝素后，其抗Ⅹa活性为10。每毫升含有国际单位的肝素可使血液凝固时间延长约50%。随后，在37摄氏度下与肝素酶孵育不同时间后，我们观察到恢复至基础凝血时间所需的时间成本。换句话说，依诺肝素被完全降解并失去活性。就抗凝效果而言，我们在一分半钟时已观察到基本达到100%的基线凝血时间恢复。经过对该时间过程的分析，我们决定将孵育时间定为五分钟，作为测量凝血时间前血液预孵育的标准条件。这种即时检测所用的检测管在我们从制造商收到后已稍作修改。这些试管原本含有活化剂硅藻土，用于活化凝血时间的测定。我们发现，当使用不含活化剂的试管时，其灵敏度显著提高。我们将此称为最小激活检测法，因为我们认为此时可能的唯一激活来源仅为试管的玻璃表面，或许还有磁铁本身。磁铁是自动化检测中的关键组成部分。这些试管在管孔中旋转，当磁铁被具有一定密度的凝块捕获而导致其运动停止时，该变化即被检测到，并提示凝血过程已完成。我们还使用奥密克戎激活的部分凝血活酶时间试剂盒对检测方法进行了研究。该检测以完全相同的方式进行。此系统中存在略多的激活成分。我们的第一步是重悬肝素酶，因其以冻干粉形式保存于小瓶中。向小瓶中加入 0.25 ml 生理盐水，随后静置约 20 秒，使其充分溶解。接着，用结核菌素注射器吸取小瓶中的全部内容物，通常在此步骤中可回收约 0.2 ml 溶液。在含有依诺肝素的三毫升真空采血管中，向新鲜采集的血样添加预孵育所需试剂。第一个加入的是肝素酶，此时正在进行混匀。随后，向另一管含有依诺肝素但不含肝素酶的试管中加入0.2 ml生理盐水，以达到与对照组相同的总体积。我们使用仪器内置的计时器倒计时300秒，即5分钟的预孵育时间。预孵育结束后，移除真空采血管。最后一步是将2 ml预孵育的样本转移至我们最低限度活化的检测管中。这些检测管预先加入了100 µL的0.25摩尔氯化钙，以启动凝血过程。第一个管子是与肝素酶预孵育的样本管。第二个样本含有依诺肝素但不含肝素酶。计时器显示的是自加入氯化钙以来所经过的时间，现在我们可以看到第一个样本已经完成，即上方试管凝血完成所需时间为200秒。未添加肝素酶的样本凝固时间较长，目前已完成检测。这是我们在血液样本中添加每毫升0.4国际单位依诺肝素后的典型结果模拟。在此依诺肝素浓度下，凝血时间大约缩短了45秒，或凝血时间减少了18%。如图所示，凝血检测是自动化的，检测时间会保存在仪器中，直至检查完成。需要说明的是，我们实际上已将该检测方法用于低至每毫升0.1国际单位依诺肝素的浓度。正如我们在引言中指出的，这一浓度可能相当于依诺肝素常规治疗剂量给药12小时后的体内浓度。我们也能在此浓度下可靠地检测到。

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