Name: 适用于培养人类胚胎和诱导多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习制备小鼠胚胎成纤维细胞用于培养人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的标准化方法。该方案涵盖胚胎分离、组织消化、细胞培养及条件培养基制备等关键步骤，确保获得高质量饲养层细胞以维持干细胞多能性。

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特别感谢 Boris Greber 博士建立了 Activin A ELISA 方案，该方案发表于 Greber et al. 2007。我们特别感谢 Monica Shevack 女士绘制了图示概览。我们非常感谢 Heiko Fuchs 博士在拍摄前及拍摄过程中提供的所有帮助和宝贵建议。我们谨向 Adjaye 实验室的全体成员致以谢意，尤其感谢 Elisabeth Socha 持续提供 MEFs 和 CM。我们还感谢马克斯·普朗克分子遗传学研究所动物实验中心的同事们给予的长期支持。本工作部分由马克斯·普朗克学会以及德国联邦教育与研究部（BMBF；资助号 0315717A）资助，后者为欧盟第七框架计划 ERA-NET Plus 项下的 ERASysBio+ 倡议合作伙伴。

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离
以下两个步骤在非无菌条件下进行。
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死一只怀孕小鼠（CF1，Harlan，USA），孕龄为13或14 d.p.c.（交配后天数）。</li>
	<li>取出子宫角，用70% (v/v) 乙醇短暂漂洗，然后放入含有不含Ca2+和Mg2+的PBS（Gibco，Invitrogen）的Falcon管中。</li>
</ol>
以下步骤均在组织培养罩内以无菌条件并使用无菌器械进行。
<ol start="3">
	<li>将子宫角放入培养皿中，分离每个胚胎与其胎盘及胚囊。</li>
	<li>解剖头部和红色器官，用 PBS 洗涤，并将所有胚胎置于干净的培养皿中。使用无菌剃刀片将组织切碎至可移液的程度。</li>
	<li>每枚胚胎加入 1 ml 含 100 Kunitz 单位 DNase I（USB）的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（Gibco, Invitrogen）。</li>
	<li>将组织转移至 50 ml Falcon 管中，在 37 °C 下孵育 15 分钟。每孵育 5 分钟后，通过反复吹打充分解离细胞。</li>
	<li>加入约等体积的新鲜配制的 MEF 培养基以终止胰蛋白酶消化作用。 
	MEF 培养基（配制 500 ml 培养基的组分，混合所有组分后过滤）： 
	450 ml DMEM，50 ml FBS（10% (v/v)），5 ml 200 mM L-谷氨酰胺（1/100 (v/v)），5 ml 青霉素-链霉素（1/100 (v/v)）。</li>
	<li>以低速（300 x g）离心 5 分钟，小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于温热的 MEF 培养基中。</li>
	<li>将相当于 3–4 枚胚胎数量的细胞接种至经 0.2% 明胶（牛皮来源，B 型，Sigma）包被 2 小时的 T150（TPP）培养瓶中。成纤维细胞（P0，第 0 代）是唯一能够贴附于明胶包被培养瓶的细胞。</li>
	<li>理想情况下，细胞在 24 小时后达到 80–90% 汇合度，此时大部分 P0 细胞应冻存以备将来使用。</li>
	<li>将剩余的 P0 细胞培养瓶扩增至 P3 或 P4 代，随后灭活并用作饲养层以重铺 hESC，或用于制备条件培养基（CM）。</li>
</ol>
2. MEF细胞（饲养层细胞）的灭活与铺板
所有步骤均在组织培养罩内以无菌条件进行。
<ol>
	<li>用0.2%明胶包被T150培养瓶，在室温下孵育至少2小时。</li>
	<li>将丝裂霉素C用PBS稀释（1 mg/ml），并过滤。</li>
	<li>吸除MEF培养基，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤。</li>
	<li>向MEF中加入20 ml含有10 μg/ml丝裂霉素C的培养基。</li>
	<li>在37 °C下用含丝裂霉素C的培养基孵育2小时，然后用PBS洗涤两次，消化（胰蛋白酶处理），离心（300 × g，5分钟），并将细胞重悬于预温的培养基中。</li>
	<li>计数细胞，并以56,000个细胞/cm2的密度接种于T150培养瓶中，用于后续6天的条件培养基（CM）制备。</li>
</ol>
3. 条件培养基（CM）的制备
所有步骤均在组织培养罩内以无菌条件进行。
<ol>
	<li>在以 56,000 个细胞/cm2 的密度接种灭活 MEF 后的第二天，将 MEF 培养基更换为添加了新鲜 4 ng/ml FGF2 的 hESC 培养基（UM，未条件化培养基）（0.5 ml/cm2）。</li>
	<li>在 24 小时培养后，收集饲养层培养瓶中的条件培养基（CM），并向饲养层中加入含有 4 ng/ml FGF2 的新鲜 hESC 培养基。</li>
	<li>在接下来的 6 天内重复此操作。每天将收集的 CM 储存于 -20 °C。</li>
	<li>6 天后，混合所有培养基等分试样并过滤（Corning，0.22 μm，PAS）。分装成 50 ml 每份，储存于 -80 °C。</li>
	<li>在将 CM 用于 Matrigel 上培养的 hESC 前，额外补充 4 ng/ml FGF2。</li>
</ol>
4. 条件培养基中激活素A的测定（ELISA）15
<ol>
	<li>将所有样品和试剂恢复至室温。</li>
	<li>用含1% BSA的PBS稀释捕获抗体（Human\Mouse\Rat Activin A MAb, R&amp;D Systems），每孔加入100 μl，于室温孵育过夜。</li>
	<li>24小时后，用PBST（含0.05% Tween 20的PBS）洗涤孔板3次（每孔300 μl），然后加入封闭液（1% BSA/PBS，每孔300 μl），室温封闭1小时。</li>
	<li>在此期间，配制Activin A（R&amp;D Systems）标准曲线，包括7个稀释浓度（浓度低于30 ng/ml）及空白对照样品。Activin A的线性工作范围为0.25至32 ng/ml。</li>
	<li>将标准品和样品各设复孔，每孔加入100 μl，室温孵育2小时。</li>
	<li>用PBST洗涤孔板3次（每次每孔300 μl）。</li>
	<li>加入二抗（生物素标记的抗体，Human/Mouse/Rat Biotinylated Activin A MAb, R&amp;D Systems），用1% BSA/PBS稀释至0.25 μg/ml，每孔加入后室温孵育2小时。</li>
	<li>用PBST洗涤孔板3次（每次每孔300 μl），加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP，用1% BSA/PBS稀释，R&amp;D Systems），室温孵育20分钟。</li>
	<li>用PBST洗涤孔板3次（每次每孔300 μl），每孔加入100 μl底物溶液（Quantikine, R&amp;D Systems），避光室温孵育30分钟。</li>
	<li>每孔加入100 μl终止液（Quantikine, R&amp;D Systems），轻轻混匀。</li>
	<li>将酶标仪（Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota）设定为450 nm检测波长，并以540 nm或570 nm作为校正波长，测定各孔的光密度值。</li>
</ol>
5. 代表性结果
分离流程的整体方案见图1。在不同培养条件下培养的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）的典型形态见图2。用于制备条件培养基（CM）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）及灭活饲养层细胞的形态见图3。通常情况下，细胞在分离后24小时应达到汇合状态，并可进行冻存或扩增。然而，有时可能需要2至3天才能获得汇合的细胞培养物。CM应使用第4代细胞制备，不应晚于该代次。这一点至关重要，因为原代细胞在出现衰老之前仅能传代4至5次。
细胞因子Activin A被认为是饲养层细胞分泌的、支持多能性细胞未分化生长的最关键因子14。检测CM中Activin A的水平（图4）是一种非常便捷的定量检测方法，可用于监测MEF细胞的质量。
<img alt="孕鼠解剖示意图；胚胎细胞制备，包括胰蛋白酶使用、PBS洗涤。" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）分离流程的示意图。
<img alt="显微镜下hESCs和iPSCs的生长比较；失活的MEFs、条件培养基、确定成分培养基。" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 未分化hESCs在(A)饲养细胞、(B)条件培养基和(C)确定成分培养基中培养时的典型形态。hiPSCs在(D, E)饲养细胞存在下培养时的典型形态。 
<img alt="小鼠胚胎成纤维细胞培养对比，活性与失活状态，显微镜图像，细胞形态学分析。" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的典型形态。(A) 接种/分离后第2天的第0代（P0）细胞，(B) 失活饲养层细胞，密度为56,000个细胞/cm2
<img alt='显示UM、CM"1"(CF1)和CM"2"(CF1)中Activin A水平的柱状图；蛋白质分析结果。' src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测由CF1小鼠品系来源的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）制备的条件培养基（CM）中Activin A的浓度。CM收集6天后混合。CM"1"和CM"2"代表不同批次的培养基，UM代表未条件培养基。由于条件培养过程的功能是由MEFs向培养基中分泌Activin A，因此Activin A在UM中几乎无法检测到。

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+derived+human+embryonic+stem+cell+lines+maintain+pluripotency+and+proliferative+potential+for+prolonged+periods+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.</a> Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
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<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+modulates+transforming+growth+factor+beta+signaling+in+mouse+embryonic+fibroblasts+and+human+ESCs+%28hESCs%29+to+support+hESC+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal.</a> Stem Cells. 25, 455-464 (2007).</li>
<li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2FNodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述的MEF分离方法可建立标准化的hESC和hiPSC培养条件。此外，用于评估饲养细胞细胞因子分泌的基于ELISA的检测系统，是判断MEF来源条件培养基质量的有效指标。为避免培养基批次间的差异，需常规维持提供支持性成纤维细胞的小鼠品系（CF1）。同时建议从多只小鼠中同步分离胚胎，以获得质量稳定的细胞。新鲜分离的MEFs可在P0和P1代冻存保存。经灭活处理的MEFs也可根据细胞培养需求，分装为适当数量后冻存。通常，培养hESC和iPS细胞时，每孔6孔板接种约250,000个细胞即可。该方法经过建立与优化，可常规应用于减少不同实验间的变异性。

<table><tbody><tr><td>DMEM（高糖）</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤系统</td><td>康宁</td><td>431097</td><td>500 ml，0.22 &amp;mu;m，过碘酸雪夫染色</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>敲除DMEM</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素C</td><td>罗氏</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗人/小鼠/大鼠激活素A抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BAM3381</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>人/小鼠/大鼠 Activin A 单克隆抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB3381</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco，Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>超薄虹膜剪</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>超细格雷夫镊</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>皮尔斯固定镊</td><td>FST</td><td>18155-13</td><td></td></tr></tbody></table>

适用于培养人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞的制备

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

通常情况下，人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs）1可在多种条件下培养。然而，建立一种有效的细胞培养体系并不容易。由于培养条件会影响赋予hESCs和hiPSCs多能性的基因表达，因此培养方法的优化与标准化至关重要。
最初建立人类胚胎干细胞（hESC）系时，使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层细胞，并采用含胎牛血清（FBS）的培养基2。随后，FBS被无血清替代物（knockout serum replacement, KSR）和FGF2取代，后者可促进hESC的增殖3。之后，无饲养层培养系统被开发出来，可在Matrigel包被的培养板上，使用含KSR的条件培养基（由MEFs条件化处理的培养基）进行细胞培养4。此后，hESC的培养条件逐步发展为在化学成分明确的条件下进行无饲养层培养5-7。此外，为避免病原体和动物源性蛋白可能带来的污染，已建立了使用无异源成分（xeno-free）的培养方法8。
为了获得更优的培养条件，小鼠饲养层细胞已被人类细胞系所取代（例如胎儿肌肉和皮肤细胞9、成人皮肤细胞10、包皮成纤维细胞11-12、羊膜间充质细胞13）。然而，使用人包皮成纤维细胞来源的饲养层维持未分化人胚胎干细胞（hESC）的效率仍低于小鼠饲养层细胞，这主要是由于其分泌的激活素A（Activin A）水平较低14。显然，小鼠与人类饲养层细胞在生长因子的产生方面存在显著差异。
对小鼠和人类饲养层细胞转录组的分析揭示了支持性细胞与非支持性细胞之间存在显著差异。外源性 FGF2 对维持 hESC 和 hiPSC 的自我更新至关重要，并已被确定为调控饲养层细胞中 Tgfβ1、Activin A 和 Gremlin（一种 BMP 拮抗剂）表达的关键因子。研究表明，Activin A 可诱导 hESC 中 OCT4、SOX2 和 NANOG 的表达15-16。
长期培养时，人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）可在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，或在基质胶包被的培养板上使用MEF条件培养基（MEF-CM）无饲养层条件下培养，以维持其未分化状态。这两种培养条件的成功完全依赖于饲养细胞的质量，因为饲养细胞直接影响hESCs的生长。
本文介绍了一种优化的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）分离与培养、条件培养基（CM）制备以及酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法，用于检测培养基中激活素A（Activin A）的水平。

小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的质量取决于合适的小鼠品系，例如 CF-1。来源于这些细胞的具有多能性支持能力的 MEFs 及其条件培养基（CM）应含有适量浓度的 Activin A、Gremlin 和 Tgfβ1，以协同维持 Activin/Nodal 和 FGF 信号通路，从而支持细胞的自我更新和多能性。

一般来说，人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）1 可在不同条件下进行培养。然而……

本实验的总体目标是制备适用于培养人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞。首先分离各个胚胎，并去除头部及红色器官；随后将组织充分剪碎并进行消化处理。然后将细胞接种，每瓶培养瓶接种三到四个胚胎，并进行扩增。最后，利用灭活的饲养层细胞制备条件培养基。最终，通过eLSA检测确定在支持多能干细胞未分化生长的条件培养基中，活性因子的最适浓度。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该操作步骤需要经过标准化，才能获得高质量的小鼠胚胎成纤维细胞，从而支持人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的未分化生长。该方法的可视化演示至关重要，因为胚胎的分离与解剖步骤较难掌握，操作小鼠胚胎需要具备一定的手动操作技能。本次操作演示将由我实验室的博士后研究员 Justina Suk 博士以及研究生 Caterina Dres 共同完成。在孕鼠妊娠13至14天将其处死，取出子宫角后，在组织培养罩内的无菌条件下，用70%乙醇短暂冲洗，并置于含有PBS的Falcon管中。将子宫角放入培养皿中，将每个胚胎与其胎盘和胚囊分离。用无菌刀片切除头部和红色器官，用PBS清洗剩余的胚胎组织，然后将其放入洁净的培养皿中。最后将组织切碎至可进行移液操作的程度。接着，加入1毫升含0.05%胰蛋白酶（trypsin）和EDTA的溶液，以及每胚胎100 K单位的DNase I。然后将组织转移至50毫升Falcon管中，在37摄氏度下孵育15分钟。每次孵育五分钟后，通过反复吹打充分解离细胞。加入约等体积新配制的甲基纤维素培养基以灭活胰蛋白酶。将细胞在低速下离心五分钟。小心弃去上清，将沉淀重悬于预热的甲基纤维素培养基中，准备0.2%明胶包被的培养瓶，并在室温下孵育至少两小时。将来自约三至四个胚胎的细胞接种到每个0.2%明胶包被的培养瓶中。只有成纤维细胞能够附着在明胶包被的培养瓶上。约24小时后，当细胞达到80%至90%融合度时，将部分细胞在-80摄氏度条件下冻存，以备后续使用，并将剩余细胞扩增至P3或P4代。为制备饲养层细胞，使用P3或P4代细胞，首先用0.2%明胶包被T150培养瓶，并在室温下孵育至少2小时。用PBS稀释丝裂霉素C，并通过注射器滤器过滤。吸出培养皿中的培养基，用不含钙和镁的PBS洗涤细胞。在培养皿中加入20毫升含有10微克/毫升丝裂霉素C的培养基，在37摄氏度下孵育2小时。接下来，用 PBS 洗涤细胞两次，并进行胰酶消化。孵育结束后，将细胞重悬于甲基培养基中，然后离心细胞并将其重悬于预热的甲基培养基中。以每平方厘米 56,000 个细胞的密度将细胞接种于 T150 培养瓶中，并在接种甲基细胞后的第二天过夜培养。将培养基更换为未条件化的 HESC 培养基，添加新鲜的每毫升 4 纳克 FGF2，并在 37 摄氏度培养箱中孵育。24 小时后，收集培养瓶中的条件化培养基，并更换为新鲜的 HESC 培养基。将收集的培养基储存在 -20 摄氏度。在第六次收集后，继续重复收集，共持续六天。合并所有培养基并进行过滤，然后以50毫升分装保存于-80摄氏度。为检测条件培养基中活性形式的a，将所有样品和试剂恢复至室温。用含1% BSA的PBS稀释活性a抗体，并向微孔板的各孔中加入100 µL。室温孵育过夜，持续24小时。用 PBST 洗涤反应孔三次。然后在室温下封闭反应孔一小时。在此期间，使用 0.25 至 32 纳克/毫升的工作浓度范围，制备包含七个稀释度和一个空白样品的活性标准曲线。将标准品和样品重复加入孔中，在室温下孵育两小时。用PBST洗涤孔三次。随后，加入生物素标记的二抗，在室温下孵育两小时。然后用 PBST 洗涤各孔三次，加入链霉亲和素-HRP。混匀并加入底物后，用铝箔包裹反应板以避光，室温孵育 20 分钟。每孔加入 100 微升终止液，轻轻混匀。最后，将酶标仪的波长设置为50纳米，校正波长为540或570纳米，并测定各孔的光密度。以下是未分化的hESCs在饲养细胞存在条件下，使用条件培养基和定义培养基培养时的典型形态。在这些示例中，hiPSCs在饲养细胞存在条件下进行培养。这些图像显示了用于制备条件培养基的滋养层细胞及其灭活后细胞的形态。通常情况下，细胞在分离后24小时应达到汇合状态，可进行冻存或扩增。然而，有时可能需要两到三天才能获得汇合的细胞培养物。条件培养基应使用第四代细胞制备，不应晚于第四代。这一点至关重要，因为原代细胞在传代4到5代后即会开始出现衰老。a中具有活性的细胞因子被认为是饲养层细胞分泌的、支持多能细胞未分化生长的最关键因子之一。如本实验所示，通过检测条件培养基中活性水平，是一种方便的定量检测方法，可用于监测 mets 的质量。一旦掌握该技术，若操作得当，小鼠胚胎成纤维细胞的分离可在一至两小时内完成。在进行该操作时，需注意提前进行动物配种，并预先准备并高压灭菌所有器械。

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适用于培养人类胚胎和诱导多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞的制备

本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）。共3部分，第1部分。...

从MEFs到Matrigel I：在MEFs存在条件下传代hESCs

本研究详细阐述了用于培养和诱导多能干细胞分化的三维纤维蛋白支架的制备方法。此类支架可用于筛选各种生物化合物对干细胞行为的影响，也可进行改造以包含药物递送系统。...

用于干细胞培养应用的3D纤维蛋白支架的制备

本文描述了一种通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和MYC异位表达来生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。同时还讨论了一种基于GFP表达识别人iPSC克隆的实用方法。...

利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

尽管目前仍在持续努力将细胞培养体系转向无饲养层条件，人类胚胎干细胞（hESC）的分离与培养在很大程度上仍依赖于与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的共培养。本文中，我们展示了一种在实验前快速去除hESC培养物中饲养层细胞的新型方法。...

高密度人胚胎干细胞培养中快速去除成纤维细胞

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本视频介绍了一种从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞的方法。该方案包括在含有特定小分子抑制剂的培养基中培养干细胞，以促进干细胞的增殖并聚集形成拟胚体（EB）。随后，使用酶消化法将拟胚体解离，并接种至包被有黏附蛋白的培养板孔中，以促进其向皮层中间神经元前体细胞分化。...

从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞

本文介绍了基于解离的单细胞非克隆型单层（NCM）生长的人多能干细胞（hPSC）培养方案。这一新方法利用Rho相关激酶抑制剂或层粘连蛋白异构体521（LN-521），适用于大量生产均一的hPSCs，以及进行基因操作和药物筛选。...

人类多能干细胞培养、维持与遗传分析的替代培养体系

本文介绍了一种通过在十天内过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和...

小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

本方案提供了一种在无血清（胎牛血清，FBS）和无饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）条件下，收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM）的方法，可用于无细胞治疗策略。该方法可能适用于衰老及与衰老相关疾病的治疗。...

无血清无饲养层小鼠胚胎干细胞条件培养基的收集：一种无细胞方法

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。...

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

学习制备小鼠胚胎成纤维细胞用于培养人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的标准化方法。该方案涵盖胚胎分离、组织消化、细胞培养及条件培养基制备等关键步骤，确保获得高质量饲养层细胞以维持干细胞多能性。

适用于培养人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞的制备

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