Name: 囊性纤维化跨膜传导调节蛋白表达和纯化酿酒酵母 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: 学习在酿酒酵母中表达和纯化囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的方法。该技术利用GFP标签监测表达水平，可产生毫克级CFTR蛋白，为囊性纤维化药物筛选和结构研究提供基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢囊性纤维化基金会（CFF）通过其CFTR三维结构联盟（资助编号FORD08XX0）对本工作的资助。我们感谢联盟内所有同事对本研究作出的巨大贡献，特别是在CFTR基因设计方面。我们还感谢希腊德谟克利特国家科学研究中心的James Birtley博士、英国卡迪夫大学的Mark Young博士以及英国伦敦帝国理工学院的David Drew博士在本研究早期阶段所作出的宝贵贡献。我们特别感谢美国德克萨斯理工大学拉伯克分校的Ina Urbatsch博士对稿件进行的审阅。

1. 培养基与缓冲液的制备
<ol>
	<li>YNB：每升溶液，将6.9 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基和0.77 g不含尿嘧啶的完全补充混合物溶于1 L水中。高压灭菌。4 °C保存。</li>
	<li>YNBA：配制400 ml，将2.76 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、0.38 g不含尿嘧啶的完全补充混合物和8 g细菌学琼脂溶于350 ml水中，高压灭菌。将8 g葡萄糖与50 ml水混合，轻轻加热至完全溶解。经0.2 μm滤膜过滤除菌后，在琼脂仍处于熔融状态时加入其中。室温保存。</li>
	<li>20%葡萄糖培养基：配制500 ml，将100 g葡萄糖与500 ml YNB混合，轻轻加热至完全溶解。经0.2 μm滤膜过滤至无菌Duran瓶中。室温保存。</li>
	<li>20%半乳糖培养基：配制2 L，将400 g半乳糖与2 L YNB混合，轻轻加热至完全溶解。经0.2 μm滤膜过滤至无菌Duran瓶中。室温保存。</li>
	<li>蛋白酶抑制剂储备液：CFTR极易发生蛋白水解4。作者发现以下抑制剂可有效抑制蛋白水解，但读者可根据自身实验需求调整该列表。为避免反复冻融，建议分装为100 μl每份，-20 °C保存。所有抑制剂均需从储备液稀释至如下工作浓度：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抑制剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>储存液配制方法</td>
			<td>工作浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>将48mg溶于1ml蒸馏水中</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>将36mg溶于1ml蒸馏水中</td>
			<td>0.3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>将2.5mg溶于1ml无水DMSO中</td>
			<td>4 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>7 mM</td>
			<td>将2.5mg溶于1ml蒸馏水中</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>将10mg溶于1ml蒸馏水中</td>
			<td>20 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>15 mM</td>
			<td>将10mg溶于1ml无水DMSO中</td>
			<td>15 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>1 M</td>
			<td>将174mg溶于1ml无水DMSO中</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="6">
	<li>DTT（1 M）：将 154 mg 二硫苏糖醇溶解于 1 ml 蒸馏水中。于 -20 °C 保存。使用时按 1:1000 比例加入指定缓冲液中。</li>
	<li>EDTA（0.5 M）：将 29.22 g 乙二胺四乙酸与 100 ml 水混合，逐滴加入 10 N NaOH，直至 EDTA 完全溶解且 pH 达到 8。加水定容至 200 ml，经 0.2 μm 滤膜过滤至无菌 Duran 瓶中。室温保存。</li>
	<li>CRB（300 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.56 M 山梨醇，1 mM EDTA）：将 18.17 g Tris 碱溶解于 350 ml 水中，加入 HCl 调节 pH 至 7.4。加入 51.35 g 山梨醇，加水定容至 500 ml。高压灭菌。加入 1 ml EDTA 储存液，于 4 °C 保存。</li>
	<li>CFTR 缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，10% v/v 甘油）：将 6.06 g Tris 碱溶解于 500 ml 水中，用 HCl 调节 pH 至 8，加入 100 ml 甘油，加水定容至 1 L。高压灭菌后于 4 °C 保存。</li>
	<li>2× 上样染料：50 mM Tris-HCl（pH 7.6），5% 甘油，5 mM EDTA（pH 8.0），0.02% 溴酚蓝，4% SDS，0.05 M DTT。配制 10 ml，分装后于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 筛选转化子
本实验方案假设CFTR-GFP-8His融合基因已插入酵母质粒中，位于GAL1半乳糖启动子的下游（图1），且该质粒已转化至FGY217细胞中，即S. cerevisiae10的Pep4缺失突变体。细胞可在YNBA平板上培养，并于4 °C保存数周。如需长期保存，应制备甘油菌种并于-80 °C冻存。克隆与转化的具体方法详见Drew et al. (2008)10的描述。
<ol>
	<li>从转化平板上挑选5-10个分布良好的单菌落，将每个菌落分别转移至含有9 ml YNB培养基和1 ml 20%葡萄糖溶液的无菌50 ml Falcon管中。此步骤需确保培养液中葡萄糖的终浓度为2%（w/v），以维持细胞生长。于250 rpm条件下培养过夜，共16小时。 30 °C 在轨道摇床培养箱中。</li>
	<li>为每个筛选出的菌落制备甘油菌种。无菌操作下，将0.8 ml过夜培养物加入含有0.2 ml无菌甘油的已标记螺旋盖小管中，短暂涡旋混匀后，于-80°C保存80 °C.</li>
	<li>将剩余的过夜培养物用YNB稀释至终体积50 ml，包括 250 μl 20%葡萄糖培养基。此步骤中，必须将培养基中的葡萄糖浓度稀释至约0.1%（w/w），因为高浓度葡萄糖可能抑制 GAL1 启动子10在标记的250 ml锥形 baffled 烧瓶中培养菌液至OD600 250 rpm 下的 0.7–0.8 30 °C 在轨道摇床培养箱中。</li>
	<li>通过向每个烧瓶中加入5 ml 20%半乳糖培养基诱导培养，并继续培养16小时。</li>
	<li>使用荧光显微镜检测CFTR的表达。进行 100 μl 培养物并添加 100 μl 甘油以限制细胞在溶液中的运动。使用Delta Vision RT复原显微镜（或类似设备）在FITC滤光片下通过蓝色激光进行细胞观察（激发波长为490 nm，发射波长为528–538 nm）。CFTR-GFP融合蛋白的阳性表达表现为酵母细胞质膜处的环状荧光信号。未转化的酵母细胞可作为对照使用。</li>
	<li>将培养物转移至50 ml Falcon离心管中。在3500 x g条件下离心收集细胞， 4 °C 在台式离心机中离心10分钟。离心机运行期间，准备含约 500 μl 经酸洗的玻璃珠，置于冰上。弃去上清液，将每份沉淀重悬于 500-800 μl 冰冻的CRB 与 蛋白酶抑制剂。将悬浮液转移至含有珠子的微量离心管中，并置于冰上保存。</li>
	<li>通过剧烈振荡或涡旋每个微量离心管，每次30秒，共10个周期，每周期之间将管置于冰上休息，以裂解细胞。也可使用珠磨器作为替代方法，例如使用BioSpec迷你珠磨器运行3分钟。</li>
	<li>将试管放入台式微量离心机中，在3,500 x g条件下离心 4 °C 5 分钟。将含有粗膜组分的上清液转移至洁净的微量离心管中，置于冰上。加入 500 μl 新鲜冰冷的CRB 加入蛋白酶抑制剂至各管，并重复该步骤以富集膜组分。</li>
	<li>通过高速离心收集粗制膜组分， 4 °C 在台式微量离心机中离心2小时。弃去上清液，将每份沉淀重悬于 50 μl 冰冻的CFTR缓冲液。</li>
	<li>在洁净的微量离心管中混合 15 μl 每种悬液的 15 μl 用移液器反复吹打使样品与2x上样染料混合。室温孵育10分钟。切勿煮沸样品，因为这会导致CFTR及其他膜蛋白形成SDS不溶性聚集体，并使GFP标签变性。</li>
	<li>将样品与 PageRuler Plus 预染蛋白标准品（Fermentas）一同上样至 4-20% Tris/甘氨酸梯度凝胶（NuSep），在 150 V 条件下电泳 40 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
	<li>通过凝胶内荧光鉴定表达量最高的细胞。将凝胶放入荧光成像系统（如Typhoon扫描仪）中，使用蓝色激光在488 nm激发波长和526 nm发射波长下扫描凝胶。CFTR-GFP融合蛋白应在约220 kDa处可见。此外，在约70 kDa处可见一条微弱的荧光条带，该条带可能为酵母内源性的含FAD膜蛋白（如琥珀酸脱氢酶亚基A）。 11,12.</li>
	<li>用考马斯亮蓝染色凝胶，脱色后使用合适的图像浏览软件扫描凝胶，以便与荧光扫描结果进行比较。经考马斯亮蓝染色的凝胶可在对每泳道所加载的总蛋白量进行归一化后，相对评估不同克隆株中CFTR-GFP的表达水平。</li>
	<li>从甘油菌种（2.2）中划线接种表达量最高的细胞株至新鲜的YNBA培养基上 接种平板并在指定条件下培养 30 °C 2-3天。此平板可在 4 °C.</li>
</ol>
3. 大规模发酵罐培养
<ol>
	<li>为发酵罐准备预培养物。用接种环刮取1cm²的菌苔2 来自YNBA的细胞区域 平板（2.13）用无菌接种环接种，加入45 ml YNB和5 ml 20%葡萄糖培养基，使OD600 约为 0.1。在 250 ml 三角摇瓶中，于 250 rpm 条件下培养， 30 °C 在轨道摇床培养箱中振荡培养直至OD600 达到1。</li>
	<li>将培养物分装至两个2 L带挡板的锥形瓶中，每个锥形瓶中含有450 ml YNB和25 ml 20%葡萄糖培养基。在250 rpm条件下培养。 30 °C 在轨道摇床培养箱中振荡培养直至 OD600 达到 1.2。</li>
	<li>在预培养物生长的同时，准备发酵罐。按照1.1中的描述配制11.2 L YNB培养基，但需额外溶解8.28 g YNB和0.95 g缺失营养补充剂，以补偿诱导时添加的甘油所导致的稀释效应。将11.2 L YNB培养基和75 mL 20%葡萄糖培养基无菌加入一个灭菌的20 L发酵罐中，并将运行温度调节至 30 °C.</li>
	<li>无菌条件下将预培养物加入发酵罐中，设定搅拌速度约为 800 rpm，并将温度维持在 30 °C. 压缩空气的流速应约为 15 dm3分钟-1当发酵罐培养物达到指定OD值后600 1.2，通过无菌添加1.5 l YNB 20%半乳糖溶液和1.2 l甘油进行诱导。将温度降至 25 °C 培养16小时。</li>
	<li>使用蠕动泵将发酵罐中的内容物转移至预冷的1 L离心管中，并置于冰上。在3,500 x g条件下离心收集细胞， 4 °C 在大容量转子（例如6升）中离心30分钟。将细胞重悬于150 ml含蛋白酶抑制剂的预冷CRB中。此后所有操作均应在低温条件下进行 4 °C.</li>
	<li>使用 Constant Systems 细胞破碎仪，在 25、30、32 和 35 kPa 条件下各进行 1 次，共 4 次，破碎细胞，并在每次操作后将裂解物收集于冰上。或者，使用珠磨仪（Biospec），加入等体积经酸洗的 0.5 mm 玻璃珠，以最大功率振荡 3 分钟。将裂解物转移至 50 ml Falcon 管中，于 3,500 × g 离心，沉淀细胞碎片。 4 °C 在台式离心机中离心15分钟。</li>
	<li>将上清液转移至预冷的离心管中。在14,000 x g离心， 4 °C 在离心机中离心30分钟以去除线粒体。</li>
	<li>将上清液转移至预冷的超速离心管中，在200,000 x g条件下离心 4 °C 在超速离心机中离心90分钟以收集微粒体。</li>
	<li>小心倾去上清液并弃去，向每管中加入2 ml冰冻的含蛋白酶抑制剂和1 mM DTT的CFTR缓冲液。用画笔轻轻重悬沉淀，用CFTR缓冲液补满每管，使用涡旋振荡器混匀。</li>
	<li>以 200,000 x g 离心该悬液， 4 °C 在超速离心机中离心60分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于2 ml冰预冷的含蛋白酶抑制剂的CFTR缓冲液中 （不使用DTT）用画笔涂抹。</li>
	<li>将重悬的微粒体合并，用CFTR缓冲液调节终体积至50 ml，并充分混匀。保留1 ml等分试样用于SDS-PAGE凝胶分析，具体步骤见2.9–2.11。微粒体现在可用液氮速冻，随后于-80℃保存80 °C 直到需要时</li>
	<li>CFTR 可使用以下其中一种去污剂从微粒体中提取：全氟辛酸锂盐（LiPFO）、十四酰基溶血磷脂酰甘油（LPG14）、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）。将微粒体与 CFTR 缓冲液、蛋白酶抑制剂及 5%（w/w）去污剂混合。若使用 DDM，还需在缓冲液中加入 300 mM NaCl。振荡混合 4 °C 在管式旋转仪上旋转15分钟。</li>
	<li>以 100,000 x g 离心样品， 4 °C 在超速离心机中离心1小时。保留上清液，并取少量用于SDS-PAGE凝胶分析。现在可通过固定化金属亲和层析结合尺寸排阻层析，从溶解的样品中纯化CFTR。</li>
</ol>
4. 代表性结果
用含有CFTR的质粒转化酵母并非100%高效。在转化实验中，对所选菌落进行CFTR表达的小规模筛选，通常每4个菌落中约有1个表达该蛋白。图3的A面板展示了一个典型的从平板上挑取5个菌落进行筛选的结果。其中一个菌落显示出CFTR-GFP融合蛋白的高水平表达，其分子量通常介于250 kDa与130 kDa标记之间，如图所示。CFTR-GFP的荧光强度在不同实验间差异较大，图3中的菌落4其荧光强度比约70 kDa处的内源性荧光条带至少高出10倍。如果CFTR-GFP的表达水平所产生的荧光弱于70 kDa条带，则建议重新进行转化，并挑选CFTR-GFP表达水平更高的菌落。如图3A所示，即使CFTR-GFP表达量较高，通过考马斯亮蓝染色也难以在细胞裂解物中分辨出CFTR-GFP条带。
在选定的菌落经过大规模培养并分离出微粒体后，需要检测微粒体内是否存在CFTR-GFP，如图3B所示。本实验结果不仅对于评估诱导表达效率至关重要，同时也可用于判断微粒体制备过程是否操作得当，以及蛋白水解是否已被最小化。图3B所示结果表明，与小规模实验（图A）相比，该实验中CFTR-GFP的表达量相对较低（以内在的70 kDa条带为参照）。然而，这一印象受到本次检测中荧光检测器过度曝光的影响，因为实验者当时正在检查是否存在CFTR构建体的蛋白水解片段。本实验中在130 kDa与100 kDa标记之间可观察到微弱的荧光蛋白水解片段信号，但与全长CFTR-GFP条带相比非常微弱。使用本文所述的蛋白酶抑制剂后，我们发现细胞破碎后CFTR的蛋白水解降解现象极少。若观察到明显的蛋白水解，建议重新配制新鲜的蛋白酶抑制剂储备液。我们还发现，商用蛋白酶抑制剂混合片剂在本体系中的效果较差。细胞在诱导后培养超过16小时将导致CFTR表达量下降，如图4所示。这可能是由于蛋白质发生周转，或与酵母细胞内蛋白质质量控制机制上调有关6-9,13。因此，建议在半乳糖诱导后尽可能监测CFTR的表达水平，因为最适收获时间可能因实验室条件不同而有所差异。
<img alt="质粒图谱，CFTR基因，eGFP标签，8His，表达系统p424GAL1，基因表达研究。" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 含CFTR构建体的酵母质粒。CFTR-GFP-8His融合片段插入到2μ p424GAL1表达载体中，受半乳糖（GAL1）启动子调控。该载体还含有尿嘧啶筛选标记（URA）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）。
<img alt="细菌转化工作流程图：筛选与发酵罐培养；包含SDS-PAGE结果。" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 概括可视化实验方案的流程图。
<img alt="转化子菌落及蛋白质凝胶电泳结果；微粒体和纯化CFTR的分析" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. CFTR表达与纯化的代表性SDS-PAGE凝胶。图A 显示随机挑选的五个转化子菌落（泳道1-5），用于筛选CFTR的表达。图B 显示从15升发酵罐培养物中分离得到的微粒体。图C 显示通过亲和层析 followed by 尺寸排阻层析的两步纯化后获得的纯化小鼠CFTR。所有凝胶均显示激发GFP结构域荧光的成像结果（左）及考马斯亮蓝染色后的结果（右）。分子量标准蛋白的位置列于左侧（kDa）。
<img alt="荧光测量；A：时间与荧光强度关系图；B：荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 酵母中CFTR表达的代表性数据。图A显示了用半乳糖诱导后CFTR表达的时间进程。通过SDS-PAGE分析细胞提取物，并对CFTR-GFP蛋白条带的GFP荧光信号进行积分定量。图B显示了诱导16小时后表达GFP的细胞进行荧光显微镜观察的典型结果。通常，仅有部分细胞以高水平表达CFTR。

<ol><li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR%29.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li>
<li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li>
<li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li>
<li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li>
<li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+complexes+%28ERACs%29+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+are+degraded+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+CFTR+folding+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li>
<li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li>
<li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li>
<li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on%5BTitle%5D)+AND+%22the+lectins+Htm1p%2FEDEM+and+the+Cdc48+protein+complex+in%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

本文提供了一种在酵母细胞中表达小鼠CFTR蛋白的方法，该方法将有助于囊性纤维化相关研究。本研究旨在与小鼠CFTR DNA质粒构建体的发布同步进行，该构建体将通过囊性纤维化基金会（<a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a>）提供。其他同源物也将在后续陆续提供。将含CFTR的载体转化至酵母细胞中的过程较为直接，但关键在于筛选出高表达CFTR的菌落。表达水平的差异可能由多种因素引起，但每个细胞中质粒拷贝数的不同可能是造成表达量变异的重要原因。本文所描述的关键步骤可实现表达CFTR的酵母细胞及含CFTR的微粒体膜的制备。一旦掌握酵母细胞的转化、培养、收获和裂解技术，即可进一步纯化目标蛋白；图3展示了在此条件下可达到的蛋白纯度示例，可作为有用的参考基准。本文并不旨在提供蛋白纯化的详细方法学。然而，针对酿酒酵母（S. cerevisiae）表达系统特有的某些关键下游纯化步骤，如细胞裂解和微粒体纯化，本文已进行了详细说明。需要指出的是，除本文所采用的两种方法外，也可使用其他酵母细胞破碎方法，例如使用法国压力细胞（French pressure cell）。该重组蛋白在其C末端带有一个TEV蛋白酶可切割的GFP结构域，可在诱导后用于追踪蛋白表达情况（图4）。酵母自身含有一种70 kDa的内源性蛋白（可能为琥珀酸脱氢酶12），在相同条件下会产生荧光11，该蛋白可作为全细胞提取物或微粒体中CFTR相对表达水平的有用内参对照（图3）。从图4所示数据可以明显看出，在以半乳糖诱导后，细胞收获的时间点至关重要。CFTR的产量在诱导约16小时后急剧下降，诱导24小时后酵母细胞中几乎检测不到CFTR蛋白。
每15升发酵罐培养物可获得约1-2 mg的纯化CFTR蛋白。从微粒体阶段之前的总CFTR-GFP蛋白计算，回收率约为70%，而纯化蛋白的回收率约为25%。对酿酒酵母（S. cerevisiae）表达的CFTR蛋白的表征工作正在进行中。如图4所示，可通过荧光显微镜监测该蛋白在细胞内的定位。尽管大部分荧光信号如预期分布在细胞周边10，但部分蛋白呈现点状分布，位于质膜内侧或紧邻质膜内侧，这可能是由于CFTR通过晚高尔基体/内体途径循环14，或可能与内质网出芽形成运输囊泡后的下游区室有关4。使用PNGaseF（一种去糖基化酶）处理后，CFTR蛋白在SDS-PAGE中的迁移率变化极小，表明该蛋白未糖基化或仅有极低程度的糖基化15。关于该蛋白磷酸化状态的研究正在进行中。在目前已测试的部分去垢剂中，纯化后的蛋白表现出ATP酶活性，且该活性可被CFTR特异性抑制剂所抑制16，其活性速率与先前报道的结果相似2,15。要测定CFTR通道活性，需将纯化蛋白进行重建，这意味着最终纯化步骤应使用临界胶束浓度（cmc）相对较高的去垢剂17。含有CFTR的酵母微粒体可用多种常用去垢剂溶解18，包括十二烷基麦芽糖苷（dodecyl maltoside）等通常被认为“温和”的去垢剂2。然而，迄今为止大多数高cmc去垢剂在溶解过程中效率较低，提示在纯化流程中应考虑在后期阶段再置换至此类去垢剂。

<table><tbody><tr><td>FGY217 &lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; 菌株，带有 &lt;em&gt;pep4&lt;/em&gt; 基因缺失 &lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不含氨基酸的酵母氮源基础培养基</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>不含尿嘧啶的完全补充混合物</td><td>Formedium</td><td>DCS0169</td><td></td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>D-半乳糖</td><td>Fisher</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂A（Pepstatin A）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>亮肽素（Leupeptin）</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶（Chymostatin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>环氧琥珀酰-亮氨酰胺基丁烷（Epoxysuccinyl-leucylamido-butane, E-64）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>氨基乙基苯磺酰氟（Amin&amp;#8211;thylbenzenesulfonyl fluoride, AEBSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>盐酸苯甲脒（Benzamidine hydrochloride）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide, DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）</td><td>Fisher</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱（Tris-base）</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>P631</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇（D-sorbitol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>甘油（Glycerol）</td><td>Fisher</td><td>065017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-十二烷基-&amp;#946;-D-麦芽糖苷</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝（Bromophenol blue）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus 预染蛋白标准品</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>NuSep tris-甘氨酸 4-20% 线性梯度胶</td><td>NuSep</td><td>NB10-420</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue 考马斯亮蓝染色液</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>酸洗玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 无菌 Falcon 管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 无菌螺口小瓶</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 无菌带挡板锥形瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>355119</td><td></td></tr><tr><td>2 L 无菌带挡板锥形瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>355131</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>0.2&amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>1 L 离心瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>带温控的轨道摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT 显微成像系统</td><td>Applied Vision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Fisher</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Star Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio 扫描仪</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-87</td><td></td></tr><tr><td>LAS3000 成像系统</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 L 发酵罐及控制系统</td><td>Applikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Constant Systems 细胞破碎仪</td><td>Constant systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpec 珠磨式细胞破碎仪</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>JA-17 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>50.2Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）中的表达与纯化

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种氯离子通道，其发生突变可导致人类囊性纤维化。因此，该蛋白受到广泛关注，但对其结构与活性的研究一直受到蛋白表达与纯化量不足的限制1-3。与许多“难表达”的真核膜蛋白类似，在快速生长的生物体中进行表达是理想选择，但具有挑战性；在酵母S. cerevisiae中，迄今为止获得的蛋白量较低，且观察到重组蛋白迅速降解4-9。已有研究描述了参与酵母中重组CFTR加工的蛋白质6-9。本报告中，我们介绍了一种在酵母中表达并大量纯化CFTR的方法。该方案阐述了如何克服早期的蛋白水解问题，以及如何通过优化细胞生长条件和控制诱导条件（特别是收获细胞前的时间段）显著提高CFTR的表达水平。本方案相关的试剂（表达小鼠CFTR的酵母细胞或酵母质粒）将通过资助本研究的美国囊性纤维化基金会进行分发。描述本报告所用CFTR构建体设计与合成的文章将另行发表（Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al.，未发表）。本文将从CFTR构建体转化酵母细胞开始介绍我们的方法——该构建体包含携带CFTR的酵母质粒（图1）。该构建体在其C末端融合了绿色荧光蛋白（GFP）序列，遵循Drew et al.（2008）10建立的系统。GFP的存在使得CFTR的表达与纯化过程能够被相对容易地追踪。JoVE可视化视频方案在从酵母细胞制备微粒体后结束，但我们也会提供一些从微粒体中进一步纯化蛋白的建议。读者可根据后续实验需求及本地可用设备，对微粒体纯化步骤进行适当修改。酵母表达的CFTR蛋白可通过金属离子亲和层析进行部分纯化，利用其内在的多聚组氨酸纯化标签。随后通过分子筛层析可获得纯度超过&gt;90%的蛋白，该结果基于SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色分析判定。

迄今为止，尝试在Saccharomyces cerevisiae中表达囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）所获得的蛋白产量均相对较低。本实验方案及囊性纤维化基金会分发的相关试剂应可实现此类“难表达”真核膜蛋白的毫克级制备。

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的表达与纯化

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种氯离子通道，其发生突变时可导致囊性纤维化。

本实验的总体目标是在Charmy Visier中表达毫克量级的CFTR蛋白。首先通过筛选转化子菌落，进行50毫升细胞培养的生长和表达试验。随后，裂解细胞并鉴定表达CFTR蛋白的菌落。然后将CFTR表达量最高的菌落接种于15升发酵罐中进行培养。最后，收集细胞并制备含有CFTR的微粒体。最终结果通过Ingel荧光和荧光显微镜显示了GFP融合CFTR的表达与提取。与现有的CFTR表达方法相比，该技术的主要优势在于采用了一种简单、廉价、生长快速且易于培养的真核宿主。该系统带有绿色荧光蛋白标签，可快速监测表达水平。最后，该实验流程最大限度地减少了分子生物学操作步骤。该方法有助于解答囊性纤维化领域中的一些关键问题，例如CFTR蛋白的生物物理特性。该技术的应用前景涉及囊性纤维化的治疗，因为它可基于纯化的蛋白开发新的药物筛选方法。由此可能产生一类新的直接与该蛋白相互作用的药物。囊性纤维化的原发性缺陷应更具特异性，并可能具有更少的多效性影响。此外，大量纯化CFTR蛋白对于获得其高分辨率结构至关重要。基于蛋白质结构的药物设计应能改进现有药物，并可能推动新药的发现。本文及随附视频的发表与囊性纤维化基金会（Cystic Fibrosis Foundation）的DNA或转化细胞释放相关。如需获取这些材料，请联系囊性纤维化基金会的Elizabeth Joof。您需要完成一份材料转移协议。该方法可帮助理解 David Drew 及其在伦敦帝国理工学院的同事所提出的利用 GFP 标签表达膜蛋白的技术。初学者在进行转化时可能会遇到困难，因为转化效率可能较低，且细胞收获时间对于获得良好的表达水平至关重要。我们最初产生这一方法的想法，是在 David Drew 和 cost us bias 访问我们实验室期间。他们当时正在对利用该系统从酵母中表达并纯化的膜蛋白进行结构研究。该方法的可视化演示至关重要，因为细胞转化、诱导后的细胞生长以及微体分离等步骤均具有较高难度，而该出版物与一种试剂的发布相关联。该视频还将有助于统一实验方案，以便不同实验室能够相互比较实验结果。本实验操作将由本实验室的两位研究生 Tracy Remington 和 Natasha Kant 进行演示。论文的另一位共同作者 Liam o Ryan 目前在新西兰，无法参与本次演示。在将编码 C-F-T-R-G-F-P eight hiss 基因的酵母质粒转化至 s visi 菌株 FGY 2 1 7 后，从转化平板上挑选 5 到 10 个分离良好的单菌落。将每个菌落分别转移至含有9毫升酵母氮源基础（YNB）培养基和1毫升葡萄糖的无菌50毫升Falcon管中。在30°C、250 RPM条件下，于摇床培养箱中过夜培养16小时，为所有筛选出的菌落制备甘油菌种。在无菌条件下，将过夜培养物0.8毫升加入已标记的螺旋盖小管中，与0.2毫升无菌甘醇混合。涡旋混匀数秒，将剩余的过夜培养物在YMB培养基中稀释至终体积50毫升，并加入250微升葡萄糖培养基。将培养物转移至标有标签的250毫升带挡板锥形瓶中，在30摄氏度、250转/分钟的摇床培养箱中培养，至OD600达到0.7至0.8。每瓶中加入5毫升半乳糖培养基以诱导表达。将培养箱温度降至25摄氏度，继续培养过夜16小时。将培养物转移至50毫升Falcon离心管中。在台式离心机中以3,500 × g、4 °C离心10分钟收集细胞，离心机需预先启动。准备含约300 µL酸洗玻璃珠的2毫升螺旋盖微量离心管，并置于冰上。弃去上清液，将每份沉淀物重新悬浮于 800 µL 冰冷的细胞重悬缓冲液（Cell Resus Suspension Buffer）或含有蛋白酶抑制剂的 CRB 中。将悬浮液转移至微型离心管中，并置于冰上保存。将细胞加入小型珠磨匀浆器中，运行 3 分钟。将离心管放入台式微量离心机中，在 4 °C 条件下以 3,500 × g 离心 5 分钟。将含有膜成分的上清液转移至干净的微量离心管中，并置于冰上。在 4 °C 条件下，使用台式微量离心机以最大速度离心 2 小时，收集粗制膜组分。弃去上清液，将每份沉淀重悬于50 µL冰预冷的CFTR缓冲液中，置于洁净的微量离心管内。用移液器将每份悬液15 µL与15 µL的2倍上样染料混合。切勿煮沸样品，否则会导致CFTR及其他膜蛋白形成SDS不溶性聚集体，并使GFP标签变性。将样品及预染蛋白标准品加入4%至20%十二烷基甘氨酸梯度凝胶中，在150伏电压下电泳40分钟。通过凝胶荧光分析鉴定表达量最高的细胞，并通过考马斯亮蓝染色验证表达后，从甘油保存液中挑取表达量最高的细胞系，划线接种至新鲜的YNBA平板，于30摄氏度培养2至3天。将平板在4°C下保存最多两周，以准备发酵罐的预培养物。使用无菌接种环从A-Y-N-B-A平板上刮取约1平方厘米的菌体区域，加入45毫升YMB培养基和5毫升葡萄糖培养基中，使OD600约为0.1。将培养物置于摇床培养箱中，在30°C、250 RPM条件下培养，直至OD600达到1。将菌液分装至两个装有450毫升YMB培养基和25毫升葡萄糖的2升带挡板锥形瓶中。在30°C、250 RPM条件下，于摇床中过夜培养，直至OD600达到1.2。准备发酵罐时，配制11.2升YNB培养基，并额外加入8.28克YNB和0.95克 dropout 补充物，以补偿诱导时添加的甘油所造成的成分稀释。接下来，无菌条件下将 11.2 升 YNB 和 75 毫升葡萄糖培养基加入无菌的 20 升发酵罐中，并将运行温度调节至 30 摄氏度。然后，在无菌条件下将预培养物加入发酵罐中。将搅拌速度设为约 800 转/分钟，并将压缩空气流量调节至约 15 立方分米/分钟。当培养物的 OD 600 达到 1.2 时，无菌加入 1.5 升半乳糖培养基和 1.2 升甘油进行诱导。将温度降至 25 摄氏度，使用蠕动泵继续培养 16 小时。将培养物转移至预冷的 1 升离心管中，置于冰上。在4°C条件下，以3,500 × g离心30分钟收集细胞。将细胞重悬于150毫升冰预冷的含蛋白酶抑制剂和1毫摩尔DTT的微区重悬缓冲液（MRB）中。自此步骤起，所有操作均需在4°C条件下进行。使用细胞破碎仪裂解细胞。然后将裂解液转移至50毫升离心管中，在3,500 × g、4°C条件下离心15分钟，以沉淀细胞碎片。为去除线粒体，将上清液转移至预冷的离心管中，在14,000 × g、4°C条件下离心30分钟。接下来收集微粒体，将上清液转移至预冷的超速离心管中，在200,000 × g、4°C条件下离心90分钟。小心倾去并弃去上清液，向每支试管中加入 2 毫升含蛋白酶抑制剂和 1 毫摩尔 DTT 的冰冻 CFTR 缓冲液。用毛笔轻轻重悬沉淀。然后用 CFTL 缓冲液补足每支试管体积，涡旋混匀后于 4°C、100,000 × g 离心 60 分钟。弃去上清液，用毛笔将沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂和1毫摩尔DTT的2毫升冰冻CFTR缓冲液中，重复此重悬过程。将重悬后的微粒体溶液转移，然后用CFTR缓冲液将终体积调至50毫升，并充分混匀。保留1毫升等分试样用于SDS-PAGE分析，其余微粒体储存于-80摄氏度，待后续从中提取CFTR蛋白时使用。请参考书面实验方案。含有CFTR质粒的酵母转化效率并非100%。在转化实验中，对所选菌落进行CFTR表达的小规模代表性筛选，大约每四个菌落中会有一个表达该蛋白，如图所示。以下是从未培养平板上挑选的五个菌落进行检测的结果。其中一个菌落显示出 C-F-T-R-G-F-P 融合蛋白的高水平表达。C-F-T-R-G-F-P 的荧光水平在不同实验之间差异显著，其中菌落四的荧光强度比约 70 千道尔顿处的内源性荧光条带至少高出 10 倍。即使如左侧所示 C-F-T-R-G-F-P 表达水平较高，通过右侧所示的考马斯亮蓝染色也很难在细胞提取物中分辨出 C-F-T-R-G-F-P 条带。该图显示了 C-F-T-R-G-F-P 在微粒体中的存在。本实验结果不仅对于评估诱导表达效率具有重要意义，同时也可用于验证微粒体是否被小心制备以及蛋白降解是否已被最小化。如图所示，细胞培养超过16小时将导致CFTR表达量下降。这可能是由于蛋白质的降解所致，或许是因为酵母蛋白质量控制机制的上调所致。因此，建议在诱导后通过凝胶内荧光和荧光成像来监测CFTR的表达水平。在进行该操作时，需使用OD 600测量值监测细胞生长。应首先在小规模条件下尝试所有步骤，再逐步放大，并检测蛋白质表达随时间的变化情况，因为在诱导后，收获细胞的最佳时间可能因实验室而异。观看本视频后，您应能充分理解如何在酵母 Scro Visier 中表达毫克量级的 CFTR 蛋白。通过该实验步骤，可从酵母微粒体中纯化 CFTR 蛋白，以便进一步进行生物化学与生物物理表征。该技术由 David Drew 及其同事开发后，为真核生物膜蛋白的高效表达奠定了基础。我们希望这项工作能够通过让全球各地的实验室使用一种廉价且简便的表达系统来生产CFTR，从而对囊性纤维化研究产生影响。这项工作离不开囊性纤维化基金会的支持，以及CFTR三维结构联盟同事们的帮助。请务必注意，任何涉及重组生物的操作都受到严格监管，在开展实验之前，相关操作和废弃物处理程序必须获得相应监管机构的批准。

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

囊性纤维化跨膜传导调节蛋白表达和纯化酿酒酵母

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种上皮氯离子通道，已被报道可与多种蛋白质相互作用并调控重要的细胞过程；其中，CFTR通过其PDZ基序介导的相互作用已有充分研究。本实验方案描述了我们建立的用于组装PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的方法 体外.

体外 PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的分析

制备高质量的酵母细胞提取物是分析单个蛋白质或整个蛋白质组的必要第一步。本文介绍一种快速、高效且可靠的酿酒酵母细胞匀浆方案，该方案经过优化，可有效保持蛋白质功能、相互作用以及翻译后修饰。...

用于研究功能、相互作用及翻译后修饰的芽殖酵母蛋白质提取与纯化

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的异源表达与纯化是囊性纤维化药物研发中的重大挑战和限制因素。本方案描述了两种可用于功能与结构研究的、适用于毫克级产量的CFTR分离方法。...

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在Saccharomyces cerevisiae中表达后的纯化

本文介绍了一种快速且有效的功能重建方法，可用于重建纯化的野生型和突变型CFTR蛋白，该方法能够保持这种氯离子通道的活性，而CFTR在囊性纤维化中存在功能缺陷。通过CFTR介导的重建蛋白脂质体中的碘离子外流，可研究通道活性以及小分子化合物的作用。...

纯化野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重构及通道活性测定

蛋白质相互作用是细胞功能的核心。通常使用量热法和光谱技术来表征这些相互作用。本文中，我们描述了荧光各向异性作为一种研究Shwachman-Diamond综合征相关突变蛋白（SBDS）与延伸因子样1...

荧光各向异性作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的工具

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

本文介绍了一种利用酵母表达、增溶并纯化多种与SLC4转运蛋白家族具有同源性的真核生物硼酸盐转运蛋白的实验方案。我们还描述了一种化学交联实验，用于检测纯化的同源多聚体蛋白的多聚化组装情况。这些方案可适用于其他难处理的膜蛋白。...

真核生物硼酸盐转运蛋白的表达、增溶与纯化

本文介绍了一种基于FRET的流式细胞术方案，用于定量分析酿酒酵母（S.

通过流式细胞术在体内检测和表征蛋白质自组装

共翻译插入预形成的纳米盘中，可实现无变性剂接触条件下，在明确的脂质环境中研究无细胞合成的膜蛋白。本方案描述了关键系统组分的制备方法，以及提高表达效率和样品质量的关键参数。...

膜蛋白共翻译插入预制纳米盘

本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida...

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。...

用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

学习在酿酒酵母中表达和纯化囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的方法。该技术利用GFP标签监测表达水平，可产生毫克级CFTR蛋白，为囊性纤维化药物筛选和结构研究提供基础。

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的表达与纯化

探索更多视频