来自人类脐带血内皮细胞集落形成细胞的表型和功能特性
2012年4月13日
具有强大的克隆增殖潜能内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）循环内皮细胞，显示内在在体内血管形成能力。会CB衍生内皮细胞生长的表型和功能特性，是重要的识别和分离善意 ECFCs修复受损的组织，为潜在的临床应用。
该程序的总体目标是解释如何从人脐带血中获得内皮集落形成细胞或 e CFC。这是通过首先从脐带血中接种单核细胞，然后克隆和扩增 E CFC 的集落生长物来实现的。第二步是使用一种新的单细胞检测技术在体外表征细胞的克隆增殖潜力。
最后，通过在 nod 滑移小鼠中生产和植入含有 E CFC 的凝胶，在体内血管形成测定中表征细胞。最终，可以通过对含有细胞植入物的 ECFC 进行 h 和 e 染色来评估从头宿主充满血液的血管的体内形成。与现有方法相比，这些技术的主要优点是这些方法允许在单细胞水平上检查内皮细胞的增殖潜力。
这项技术的影响可以扩展到寻找野动脉疾病或 PAD 等疾病的诊断和治疗工具，因为这项技术使我们能够检查患者内皮细胞的增殖潜力和生成能力。在开始手术之前，加入 1 毫升大鼠尾胶原，在 6 孔组织培养板的每个孔中键入 1 毫升，然后在手术当天将板孵育过夜，将 15 毫升单位的脐带血分装到 50 毫升锥形离心管中。然后向每管中加入 20 毫升 PBS，并上下移液数次。
接下来，将 15 毫升 fial PA 吸入移液器中，将移液器尖端放在稀释血液管的底部，小心地铺在 alpac 下面，在室温下以 740 倍 G 离心管 30 分钟，无需减速制动设置。细胞分离后，使用移液管去除位于 fial 峰和稀释血浆之间界面处的低密度单核细胞浑浊层。将收集的细胞分配到含有 10 ml E GM 两种培养基的 50 毫升锥形管中，并在室温下以 515 倍 G 的离心力将单核细胞沉淀 10 分钟，并设置高减速制动设置，小心吸出并丢弃上清液。
然后，在用 EGM 2 洗涤沉淀的细胞两次后，将它们以 1.25 倍 10 至每毫升第 7 个细胞悬浮在 EGM 2 中。现在将 4 毫升单核细胞悬液移液到胶原蛋白包被板的每个孔中，并孵育细胞，直到第一天形成菌落。孵育后，用移液管从孔中缓慢去除用过的培养基，不要干扰松散贴壁的细胞。
然后小心地向孔中加入 4 毫升 E GM 2，并将板放回培养箱中。菌落通常出现在手术前一天的第 5 天到第 14 天之间。大鼠尾部胶原蛋白为 50 微升。
像以前一样在 96 孔板的每个孔中键入一个，并在手术当天将板孵育过夜。首先用 PBS 洗涤仅传代 2 到 3 次的细胞 2 次。吸出 PBS 的最终洗涤后，在每个菌落周围放置一个无菌凝胶涂层克隆圆筒，使用无菌镊子将每个圆筒牢牢地压在板上。
向每个克隆圆筒中加入 2 到 3 滴温热的 3 E 表达物，并在圆筒中孵育 3 到 5 分钟，直到细胞开始分离。细胞在大约 250 μL EGM 中开始分离后，将两种培养基放入圆筒中心，并上下移液以产生单细胞悬液。现在将单细胞悬液从每个克隆圆筒分别转移到单独的微量离心管中。
用表达 EGFP 的慢病毒感染六孔板中的细胞，并通过荧光细胞术收集表达 EGFP 的细胞。然后在胶原蛋白包被板中孵育 EEG FP 阳性细胞和 EGM 2。当 E CFC 准备好后，收集它们 如刚才所示，使用 trip E express 并复苏悬浮细胞和 e GM 两种培养基，最终浓度约为 10 至 6 个细胞/毫升。
然后使用每秒 20 个细胞的低流速流选器，将每孔一个 EGP 阳性 ECFC 分选到先前制备的胶原蛋白包被的 96 孔板中，用 EGM 调整每个孔的最终体积，每孔 2 至约 200 微升。然后使用倒置荧光显微镜确保每个孔仅包含一个细胞。将板孵育两周，在培养的第 14 天更换两次培养基。
用 100 μL PBS 洗涤每个孔，然后用 100 μL 4% 多聚醛固定细胞 30 分钟。对于不表达 EGFP 的 e CFC，添加 cyt 试剂，一种绿色荧光核染料，在对位甲醛固定后在 4 摄氏度下孵育过夜。使用荧光显微镜直观地量化扩增的内皮细胞的数量，如此处所示，内皮细胞数量为 2 到 50 的孔被认为是内皮细胞簇。
具有 51 至 2000 个细胞的孔是低增殖潜能 e CFC，具有 2001 个或更多细胞的孔被认为是高增殖潜能 e CFC。像以前一样分离表达三重 E 的细胞后，通过血液、细胞仪和 trian blue 获得细胞培养物的活细胞计数。将 240 万个活细胞转移到 50 mL 锥形管中，然后在细胞离心的同时通过离心
沉淀细胞。充分混合凝胶基质的组分，然后用氢氧化钠将 pH 值调节至 7.4，同时将溶液保持在冰上。弃去上清液后，将沉淀重悬于 360 微升温热的 e GM 二中。然后向细胞中加入 840 微升凝胶基质溶液，小心混合溶液，直到细胞完全悬浮在凝胶中 将这 1 毫升细胞化凝胶悬浮液转移到 12 孔组织培养板的一个孔中，并孵育板直至凝胶聚合。
然后在孵育过夜之前，第二天和植入前用 2 毫升温热的 EGM 2 轻轻覆盖凝胶。用虹膜剪刀将凝胶切成两等份，并将凝胶块放回含有 e GM 两种培养基的同一培养孔中。通过脚趾捏确认镇静后，剃掉 5 到 6 周大的麻醉点头、滑鼠的小腹，并通过旋转酒精和优碘垫彻底清洁手术部位。
接下来，使用无菌锋利的虹膜剪刀在腹部下象限切开大约 5 毫米的切口，露出皮肤和腹部肌肉之间的皮下空间。钝。从腹部两个不同区域的腹肌中解剖真皮层，形成 15 至 20 毫米宽的口袋，一个通向上腹，一个通向上腹，另一个通向腹部的另一个区域。然后提起真皮层，轻轻靠近切口。
将半块凝胶插入一个腹袋中，将另一半凝胶插入另一个腹袋中。插入凝胶后，在切割针上使用 5 根 oh 聚丙烯缝合线，用 2 到 3 针缝合每个切口。标记笼卡并根据机构和方案要求进行术后监测和镇痛。
在植入第 14 天处死动物后，用酒精垫擦拭小鼠的腹部，并切割娇生惯养的皮肤到原始切口线。然后，将皮肤的切除皮瓣宠爱到凝胶的可能位置。在凝胶周围圆周切割以去除每个植入物，然后将切除的植入物放入锌固定剂中。
使用这种 ECFC 衍生技术，我们早在第 5 天就观察到原生集落形成的生长。请注意箭头所示的这五种 ECFC 培养物的鹅卵石形态。扩增的集落表达内皮抗原，但不表达造血抗原。
如内皮细胞和造血细胞的代表性体外表型评估所示，免疫表型分析显示 e CFC 表达内皮抗原，如 CD 31、CD 34、CD 1 44、CD 1 46、FL 1、flick 1、flip 4 和 NRP 2，但不表达造血抗原、CD 45、CD 14、CD 11 BC Kit CXCR 4 或 CD 1 33。重要的是，如该条形图所示，扩增的菌落在单细胞水平上显示了克隆增殖潜力的完整层次结构，范围从 2 到 50 个细胞的簇到大于 2001 个细胞的菌落。这些用 cyt（一种绿色荧光核染料）染色的菌落显微照片是在脐带血来源的 E CFC 在单细胞水平培养 14 天后获得的。
此外，e CFCs 形成人源化血管，当植入免疫缺陷小鼠体内时，这些血管会灌注宿主红细胞。在含有 CELLULARIZE 凝胶植入物的脐带血衍生 ECFC 的这种 h 和 e 染色中，可以观察到植入 14 天后在胶原纤连蛋白凝胶中形成的充满宿主红细胞的微血管。在这里，棕色的抗人 CD 31 染色进一步证实了这些血管的人类来源。
看完这个视频，你应该对如何从人脐带血中提取 e CFCs，以及如何克隆、扩增和表征 ECFC 集落发育后的功能有一个很好的了解。这项技术为血管内皮研究人员探索从多个来源获得的内皮细胞的内皮克隆增殖潜力和生成能力铺平了道路。
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概述
本文详细介绍了从人脐带血中提取内皮祖细胞集落形成细胞（ECFCs）的过程，重点强调了这些细胞在组织修复方面的潜力。研究强调了对这些细胞进行特性分析的重要性，以确保其临床适用性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 再生医学
- 血管生物学
背景
- 内皮祖细胞集落形成细胞（ECFCs）对血管修复至关重要。
- 它们具有强大的克隆增殖潜力。
- ECFCs的特性分析对临床应用至关重要。
- 脐带血是ECFCs的一个很有前景的来源。
研究目的
- 从人脐带血中提取ECFCs。
- 对这些细胞的增殖潜力进行特性分析。
- 评估它们在体内形成血管的能力。
使用的方法
- 从脐带血中分离单核细胞。
- 克隆并扩展ECFCs的集落外生物。
- 使用一种新的单细胞测定法来评估克隆增殖潜力。
- 通过在小鼠中移植ECFCs进行体内血管形成测定。
主要结果
- 成功从脐带血中提取ECFCs。
- ECFCs的特性分析表明它们具有强大的增殖潜力。
- 体内测定显示形成了充满宿主血液的血管。
- H&E染色确认了在移植物中存在ECFCs。
结论
- 从脐带血中提取的ECFCs具有重要的临床潜力。
- 特性分析技术允许对单个细胞进行详细分析。
- 这些方法改善了对内皮细胞生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Endothelial colony forming cells (ECFCs) derived from umbilical cord blood offer a high-potency source for vascular regeneration research, enabling mechanistic de-risking in preclinical models of ischemic disease. Their robust clonal proliferative capacity and demonstrated in vivo vessel formation support target validation and lead identification strategies in angiogenic therapeutic development. This single-cell resolution assay enhances predictive confidence by quantifying functional heterogeneity within progenitor populations prior to scale-up.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial progenitor hierarchy and functional validation of angiogenic potential at single-cell resolution.
- Operational Value: Provides a standardized clonogenic assay to de-risk mechanistic ambiguity in progenitor cell therapies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative proliferative potential readouts (2–50, 51–2000, >2000 cells) to stratify ECFC potency for downstream screening.
- Operational Value: Establishes a reproducible single-cell cloning workflow compatible with fluorescence-activated sorting and microtiter plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates formation of perfused, human-derived microvessels in immunodeficient mice, supporting preclinical validation of vascular engraftment.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of vessel maturation and host perfusion via H&E and CD31 immunostaining of explanted gels.
Pipeline & Workflow Integration
ECFC derivation and characterization fit within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target confirmation and functional validation before lead optimization in vascular repair programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic potency and paracrine mechanism de-risking through phenotypic and functional profiling.
- Screening: Delivers standardized, quantitative clonal output metrics to enable comparative assessment of donor or genetic variability.
- Analytics: Provides single-cell resolution proliferative potential data that informs go/no-go decisions in progenitor cell selection.
- Translational Research: Connects in vitro clonogenicity to in vivo vasculogenesis, strengthening predictive models for clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-ready method for ECFC expansion and characterization applicable across cord blood, peripheral blood, and tissue-derived sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in angiogenic potential, reduction of mechanistic uncertainty in progenitor cell heterogeneity.
- Operational Value: Standardized isolation, cloning, and expansion workflow with defined proliferative thresholds.
- Strategic Value: Informed prioritization of high-potency ECFC lots, reducing failure risk in preclinical vascular engraftment studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of endothelial progenitor candidates based on validated clonal and functional criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, flow cytometry, and in vivo implantation techniques.
- Dependent on collagen-coated surfaces, EGM-2 medium, and fluorescent sorting infrastructure for single-cell resolution.
- Necessitates standardized protocols for mononuclear cell isolation and gel-based vasculogenesis assays across laboratories.
- Adaptation to alternative endothelial sources requires validation of clonogenic potential and in vivo vessel-forming capacity.
- Practical limitations include variability in cord blood donor potency and the need for immunodeficient models to assess human vessel formation.
