人脐带血来源的内皮集落形成细胞的表型与功能特征分析

本实验的总体目标是阐述如何从人脐带血中分离内皮集落形成细胞（endothelial colony forming cells，eCFCs）。该过程首先将脐带血中的单个核细胞进行接种培养，随后对eCFCs的集落样生长物进行克隆与扩增。第二步是利用一种新型的单细胞检测技术，在体外对细胞的克隆性增殖潜能进行表征分析。

最后，通过在裸鼠体内生成并植入含有内皮集落形成细胞（ECFCs）的凝胶，利用体内血管形成实验对细胞进行表征。最终，可通过苏木精和伊红（H&E）染色检测含ECFC的细胞移植物，评估体内新生宿主血液填充血管的形成情况。这些技术相较于现有方法的主要优势在于，能够以单细胞水平检测内皮细胞的增殖潜能。

该技术的潜在应用可拓展至寻找诊断和治疗诸如外周动脉疾病（PAD）等疾病的方法，因为该技术使我们能够评估患者内皮细胞的增殖潜能和分化能力。在开始实验操作前，向六孔组织培养板的每个孔中加入一毫升I型大鼠尾胶原，然后在实验当天将培养板过夜孵育。将脐带血以15毫升为单位分装至50毫升锥形离心管中，随后向每根管中加入20毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并用移液器将混合物上下吹打数次。

接下来，用移液管吸取15毫升Ficoll-PA，将移液管管尖置于稀释血液试管的底部，小心地将Ficoll-PA铺在血液下方。将试管在室温下以740 × g离心30分钟，离心时关闭减速刹车设置。细胞分离后，使用转移移液管小心吸取位于Ficoll-PA与稀释血浆界面处的浑浊低密度单个核细胞层。将收集的细胞转移至含有10毫升EGM-2培养基的50毫升锥形管中，在室温下以515 × g离心10分钟（开启高速减速刹车），然后小心吸除并弃去上清液。

然后，用EGM-2培养基洗涤沉淀的细胞两次，再将单个核细胞重悬于EGM-2培养基中，浓度为每毫升1.25 × 10⁷个细胞。现在，将4毫升单个核细胞悬液移入经胶原蛋白包被的培养板的每个孔中，并在第一天开始孵育细胞直至形成集落。孵育后，用移液器缓慢吸出各孔中的废弃培养基，注意不要扰动贴壁较松散的细胞。

然后小心向孔中加入 4 毫升 E GM 2，并将培养板放回培养箱。菌落通常在操作前一天的第 5 到第 14 天出现。加入 50 微升大鼠尾胶原蛋白。

按前述方法向96孔板的每个孔中加入一种类型，并在操作当天将培养板过夜孵育。首先用PBS洗涤仅传代两到三次的细胞，洗涤两次。吸除最后一次PBS洗涤液后，用无菌镊子将无菌凝胶包被的克隆环围绕每个克隆放置，并将每个克隆环牢固地压在培养板上。

向每个克隆柱中加入两到三滴温热的三重 E 表达液，孵育三到五分钟，直至细胞开始脱落。当细胞开始脱落时，向柱子中心加入约 250 微升 EGM-2 培养基，反复吹打以形成单细胞悬液。随后，将每个克隆柱中的单细胞悬液分别转移至独立的微量离心管中。

用表达EGFP的慢病毒感染六孔板中的细胞，并通过荧光细胞术收集表达EGFP的细胞。随后将EGFP阳性细胞与EGM-2培养基接种于胶原蛋白包被的培养板中。当内皮集落形成细胞（E CFCs）准备就绪后，使用前述方法通过TrypLE消化收集细胞，并将细胞重悬于EGM-2培养基中，终浓度约为每毫升10的6次方个细胞。

然后使用流式分选仪，以每秒20个细胞的低流速，将单个EGP阳性的ECFC分选至预先准备好的胶原蛋白包被的96孔板中，并用EGM-2培养基调整每孔终体积至约200微升。随后使用倒置荧光显微镜确认每个孔中仅含有一个细胞。将培养板孵育两周，在培养第14天更换两次培养基。

用 100 微升 PBS 洗涤每个孔，然后加入 100 微升 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟。对于不表达 EGFP 的 eCFCs，在多聚甲醛固定后加入 cyt 染色试剂（一种绿色荧光核染料），并在 4 摄氏度下孵育过夜。使用荧光显微镜直观地定量扩增的内皮细胞数量，如图所示：内皮细胞数量为 2 至 50 个的孔被视为内皮细胞簇。

含有51至2000个细胞的孔为低增殖潜能eCFC，含有2001个或更多细胞的孔被视为高增殖潜能eCFC。用三重E消化液使细胞脱离后，按前述方法进行操作，通过血细胞计数仪和台盼蓝染色获得细胞培养物的活细胞计数。将240万个活细胞转移至50毫升锥形管中，然后在细胞离心过程中形成细胞沉淀。

将凝胶基质的各组分充分混匀，然后在冰上操作，用氢氧化钠调节pH至7.4。弃去上清液后，将沉淀物重悬于360 µL温热的eGM-2中。然后向细胞中加入840 µL凝胶基质溶液，小心混匀，直至细胞在凝胶中充分悬浮。将此1 mL细胞化凝胶悬液转移至12孔组织培养板中的一个孔内，并孵育培养板，直至凝胶完成聚合。

然后，在过夜孵育前，第二天用两毫升温热的EGM-2培养基轻轻覆盖凝胶，并在植入前立即进行此操作。使用虹膜剪将凝胶切成大小相等的两份，并将凝胶块放回含有EGM-2培养基的同一培养孔中。通过脚趾夹捏法确认麻醉效果后，剃除5至6周龄免疫缺陷小鼠的下腹部毛发，并使用酒精棉片和碘伏棉片交替旋转擦拭，彻底清洁手术部位。

接下来，使用无菌的锋利虹膜剪在腹部下象限处做一个约五毫米的切口，暴露皮肤与腹肌之间的皮下间隙。在腹部两个不同区域钝性分离真皮层与腹肌，形成15至20毫米宽的皮下袋，一个通向腹部上象限上方，另一个通向腹部其他区域。然后提起紧邻切口处的真皮层。

将半片凝胶插入一侧腹腔袋中，另一半片凝胶插入对侧腹腔袋中。凝胶植入后，使用带切割针的5-0聚丙烯缝线，对每处切口进行两到三针缝合关闭。标记笼卡，并根据机构和实验方案要求进行术后监测和镇痛处理。

在植入后的第14天处死动物后，用酒精棉片擦拭小鼠腹部，并沿原始切口线剪开皮肤。然后切除可能含有凝胶部位周围的皮瓣，围绕凝胶做环形切口以取出每个植入物，随后将切除的植入物放入锌固定液中。

采用这种ECFC分离技术，我们已观察到最早在第5天即出现原代集落的生长。请注意箭头所示第5天ECFC培养物的铺路石样形态。扩增的集落表达内皮抗原，但不表达造血抗原。

如本图所示，在对内皮细胞和造血细胞进行的代表性体外表型评估中，免疫表型分析显示，内皮集落形成细胞（E-CFCs）表达内皮细胞抗原，如 CD31、CD34、CD144、CD146、FLK-1、TIE-1、TIE-2 和 NRP-2，但不表达造血抗原 CD45、CD14、CD11b、c-Kit、CXCR4 或 CD133。重要的是，如本柱状图所示，在单细胞水平上扩增的集落呈现出完整的克隆增殖潜能层级，其细胞数量范围从2至50个细胞的细胞簇，到超过2001个细胞的大型集落。这些显微图像为脐带血来源的E-CFCs在单细胞水平培养14天后，经绿色荧光核染料Cyt（cyt）染色所获得的集落图像。

此外，将eCFCs植入免疫缺陷小鼠后，可形成人源化血管，并由宿主红细胞灌注。在此脐带血来源的ECFC包埋于CELLULARIZE凝胶的植入物的苏木精-伊红（H&E）染色图像中，可观察到植入14天后在胶原-纤连蛋白凝胶中形成、并充满宿主红细胞的微血管。此处，呈棕色的抗人CD31染色进一步证实了这些血管的人源性。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从人脐带血中分离内皮集落形成细胞（ECFCs），以及如何在细胞建立后对ECFC克隆进行扩增，并表征其功能特性。该技术为血管内皮领域的研究人员探索来源于多种来源的内皮细胞的内皮克隆增殖潜能和基因潜能奠定了基础。