Name: 对芯片等速电泳离子的分离和纯化核酸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习等速电泳技术用于微流控芯片上的离子分离与核酸纯化。本方法演示了样品预浓缩、细菌裂解物中DNA和RNA的选择性提取，以及氨基酸的无标记检测与定量分析。

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我们衷心感谢DARPA资助的微/纳流体基本原理聚焦中心（MF3）在合同号N66001-10-1-4003以及DARPA资助号N660001-09-C-2082下的资助。

1. 等速电泳的物理原理
等速电泳（ITP）在相同电荷的离子之间形成一个清晰的移动边界。该技术可用于阴离子或阳离子样品，但本文介绍侧重于阴离子 ITP，并指出相同原理同样适用于阳离子 ITP。我们选择具有较高有效电泳迁移率绝对值的领先电解质（LE）和尾随电解质（TE）缓冲液。有效电泳迁移率 μ = U/E 是施加电场 E 与离子漂移速度 U 之间的比例常数13。我们在高导电性的 LE 区域与低导电性的 TE 区域之间建立一个弥散界面，并施加一个从高导电性 LE 区指向低导电性 TE 区的电场。由于导电性分布不均，系统在 ITP 界面处迅速建立起强烈的电场梯度。正如其名称所示（源自希腊语，“isos”意为“相等”，“takhos”意为“速度”），在非均匀电场和电流守恒的作用下，TE 和 LE 离子以相同且恒定的速度移动（即所谓的“ITP 条件”，见图 1）。
ITP 界面具有自锐化特性：扩散进入 TE 区域的 LE 离子会受到强烈的恢复性通量作用，从而返回至前导区域（反之，进入 LE 区域的 TE 离子亦会返回至尾随区域）。当样品离子在 TE 区域中的有效迁移率大于 TE 共离子的迁移率，且其在 LE 区域中的有效迁移率小于 LE 共离子的迁移率时，样品离子将在该界面处聚焦（见图 1）。ITP 的自锐化和聚焦特性增强了该技术的稳健性，使其对界面扰动（例如由压力驱动流动或几何结构变化，如收缩、扩张和弯道等）相对不敏感。
在峰模式等速电泳中（见图2a及视频1-2），样品离子的浓度始终显著低于领先电解质（LE）和尾随电解质（TE）离子的浓度，因此对局部电导率的贡献可忽略不计。样品离子的分布由相邻区带（此处为TE与LE）之间的自锐化界面以及样品有效迁移率相对于这些区带的数值决定14。多种样品离子在相同的狭窄等速电泳界面区域内聚焦，形成高度重叠的峰。界面宽度和峰宽，以及相应的预浓缩因子，均与所施加的电流成反比（见图2b中的实验）14。
当初始样品浓度足够高且富集时间充分时，样品离子将达到一个阈值浓度。对于完全电离的物种，该阈值由科尔劳施调节函数（Kohlrausch regulating function, KRF）决定15；对于弱电解质，则由阿尔伯蒂和约文函数（Alberty and Jovin functions）确定16,17。在平台模式下（如图3和视频3所示），样品离子根据其有效迁移率依次分离，并形成局部浓度均匀且恒定的区带。极稀的离子仍可能在平台区带之间以峰模式聚焦。在等速电泳（ITP）中，样品离子可通过有限进样方式引入领先电解质（TE）与尾随电解质（LE）之间（见图3），也可选择性地与TE和/或LE混合后一同引入（见图2）。我们将样品与TE区带混合的方式称为“半无限”进样，该方法可用于连续富集分析物离子。连续样品富集可提高峰模式和平板模式检测的灵敏度。然而，在平台模式中，有限进样更为常见。这可能是因为半无限进样中较高的初始分析物浓度会显著增加TE的电导率，从而降低聚焦速率。此外，在半无限进样中无法实现完全纯化（因为TE中始终存在有限浓度的分析物）。
2. 设备清洁与准备
本方案中所采用的检测使用各向同性湿法刻蚀（横截面大致呈D形）的玻璃微流控芯片，其结构为交叉通道设计（见图1）。以下的清洗与准备步骤针对硼硅酸盐玻璃和熔融石英通道进行了优化，但也适用于玻璃/PDMS芯片。为确保实验间结果的可重复性以及成功施加用于抑制电渗流（EOF）的动态涂层，应在实验前执行此清洗程序。若省略该步骤，可能导致等速电泳（ITP）界面出现显著弥散14。
<ol>
	<li>为对通道进行去污染，向北侧、东侧和南侧储液池中加入 10–20 μL 的 10% 次氯酸钠溶液，并在西侧储液池施加真空持续 2 分钟。若使用标准 Caliper 芯片托架，可通过将 200 μL（无滤芯）移液枪头的宽端连接至芯片储液池，并将真空管路连接至内径为 2 mm 的管子，从而有效施加真空。</li>
	<li>排空储液池，并用 1 M 氢氧化钠溶液冲洗通道（同第 1 步）2 分钟。此步骤可轻微蚀刻通道壁，形成洁净的硼硅酸盐表面，有助于建立均匀的表面性质。</li>
	<li>排空储液池，用去离子水（DI）清洗，然后用 LE 溶液冲洗通道约 2 分钟。在此期间，通道内的表面性质和动态涂层将达到平衡状态。</li>
</ol>
3. 在峰值模式等速电泳中对荧光团进行聚焦
<ol>
	<li>配制1 mL LE溶液，其中包含100 mM HCl、200 mM tris和1% PVP。</li>
	<li>配制1 mL TE溶液，其中包含100 mM HEPES和200 mM tris。取90 μl TE与10 μl 1 μM Alexa Fluor 488 (AF488) 混合。</li>
	<li>按照第2部分所述用LE冲洗后，排空西侧储液池，并用去离子水清洗数次，以稀释其中残留的LE。随后向该储液池中加入20 μL含AF488的TE溶液。</li>
	<li>将正极电极置于东侧储液池，将接地（负极）电极置于西侧储液池，并施加2 μA恒定电流。样品峰将以恒定速度从西侧储液池向东侧储液池迁移（见图1），随着低电导率的TE溶液填充通道，两储液池之间的电压将逐渐升高。</li>
</ol>
4. 从培养的 E. coli 中提取和纯化核酸
选择性富集离子种类的能力使得等速电泳（ITP）成为生物样本制备的理想技术。我们通过选用一种有效电泳迁移率低于目标核酸但高于共离子PCR抑制物（例如阴离子去污剂、蛋白质和有机溶剂，即使其浓度较高）的尾随阴离子，直接从未经处理的细胞裂解液中纯化核酸。阳离子型PCR抑制物（如碱金属、阳离子蛋白和阳离子去污剂）则向相反方向迁移，因此也被留在原处。ITP从样品储液池中提取并富集目标核酸，同时将迁移较慢的PCR抑制物留在后面（见图4）。
<ol>
	<li>获取或培养大肠杆菌（E. coli）细胞样品，使其浓度超过 108 CFU/mL。</li>
	<li>将 1 mL 细胞培养物转移至防泄漏的微量离心管中，在 4000g 条件下离心 6 分钟，收集菌体沉淀。</li>
	<li>用 80 μL 无 RNase 的水重悬沉淀，并加入 10 μL 裂解液（含 10 mM tricine、10 mM bis-tris、2 mM EDTA、0.1 % Triton-X 和 5 mg/mL 溶菌酶）。轻轻混匀后室温孵育 5 分钟（裂解方案改编自 Bercovici 等11）。</li>
	<li>加入 10 μL 1 M 氢氧化钠，将裂解液 pH 升至约 12.5。轻柔地上下吹打移液器，直至溶液变澄清，表明裂解完成。</li>
	<li>将 10 μL 裂解液与 90 μL 50 mM tricine 和 100 mM bis-tris 混合。此溶液即可作为 TE 使用。</li>
	<li>配制 1 mL LE 溶液，成分为 500 mM bis-tris、250 mM HCl、1% PVP 和 1X SYBR Green II。按照第 3 部分所述方法将 LE 注入微流控芯片。</li>
	<li>为在等电聚焦（ITP）后从芯片外分析中提取纯化的核酸，需将东侧储液池中的溶液替换为适用于 PCR 的 LE 溶液（含 50 mM bis-tris、25 mM HCl 和 0.1% PVP）。在东侧和西侧储液池之间施加 1000 V 电压以启动实验。此时两储液池间的电流将逐渐下降。</li>
	<li>实验结束时，样品洗脱进入 LE 储液池。在此洗脱过程中，系统的电流-时间曲线通常达到一个平台值（因为此时通道内 TE 离子均匀分布，主导了电阻）。通过反复移液轻柔混匀储液池内容物，并取出 5 μL 进行定量 RT-PCR 分析。</li>
</ol>
5. 采用阳离子平台模式瞬时等电聚焦和非聚焦示踪剂（NFT）进行氨基酸分离及可视化
ITP 可用于在先导电解质（TE）和尾随电解质（LE）之间将小离子分离并富集到相邻且可检测的平台区。这使得能够基于物理化学性质（如局部电导率、紫外吸收、温度传感或折射率）对离子进行检测和鉴定。在此，我们演示了一种非富集示踪物（NFT）分析方法，其中将一种荧光性共离子物质添加至 LE 中。该荧光物质不会发生富集，但其浓度会随局部电场变化而调整，从而实现对纯化平台区的可视化（见图5）。
<ol>
	<li>配制1 mL裂解液（LE），包含100 mM乙醇胺、200 mM三羟甲基甘氨酸和1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP），以及100 μM阳离子荧光染料罗丹明6G。</li>
	<li>配制1 mL迁移缓冲液（TE），包含20 mM三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）和40 mM三羟甲基甘氨酸。通过将90 μL TE与各10 μL的50 mM精氨酸和50 mM赖氨酸混合，制备样品。</li>
	<li>在西侧和北侧储液池中各加入20 μL LE，在东侧储液池中加入样品。对南侧储液池施加1分钟真空。</li>
	<li>用去离子水清洗东侧孔，随后替换为TE缓冲液（不含样品的TE）。</li>
	<li>在东侧和西侧储液池之间施加500 V电压。</li>
</ol>
6. 代表性结果
我们在图2b中展示了峰型模式实验的等速电泳图谱，在图4中展示了核酸提取实验的结果。在使用荧光报告分子（如AF488、SYBR Green II）的峰型模式实验中，可通过积分总荧光强度，并与标准曲线进行比较，从而获得定量的浓度信息。12 此外，在核酸提取实验中，样品被允许洗脱至LE储液池中，随后用移液器吸取并用于定量RT-PCR分析。10,12 我们在图5中展示了氨基酸分离的平台模式等速电泳图谱。可通过荧光强度（相对于LE或TE区带的强度）进行区带鉴定，而区带宽度可用于定量分析。
<img alt="用于离子迁移分离分析的等速电泳示意图，包含方程和检测器。" src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1。"> 
图 1。 等速电泳（ITP）是一种在微流控应用中用于离子高灵敏度检测与分离的电动力学技术。ITP 具备分离、选择性聚焦和预富集能力。此外，由于其自锐化特性，该技术极为稳健，且对物理扰动不敏感。当样品离子的有效电泳迁移率介于前导电解质（LE）和尾随电解质（TE）离子的有效迁移率之间时，它们将在 LE 和 TE 之间选择性聚焦，并以 LE 区域中前导离子的速度恒定地通过微通道迁移。示意图展示了一个典型的 ITP 实验模型，其中样品在 LE 和 TE 区域之间持续聚焦。
<img alt="等速电泳峰模式、示意图、电泳装置、离子分离、荧光团聚焦分析。" src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2. 稀释样品离子在“峰模式”等速电泳（ITP）中聚焦。a) 两种不同的稀释样品（csample &lt;&lt; cLE）在领先电解质（LE）区带与尾随电解质（TE）区带之间形成的界面处以峰模式聚焦。此时，电场仅由 LE 与 TE 决定，样品离子对电流无显著贡献。样品离子与 TE 混合（半无限进样），在 ITP 界面处共同聚焦成近似高斯分布的峰。聚焦条件（以不等式表示）适用于强电离的物种。b) 实验结果显示 Alexa Fluor 488（AF488）在不同施加电流下以峰模式聚焦（另见视频 1）。样品峰宽度与电流成反比（在电渗流引起的对流扩散可忽略的情况下）14。该自锐化界面可抵抗由压力驱动流动引起的分散（见视频 2）。
<img alt="展示离子分离、电泳迁移率和聚焦的平台模式等速电泳示意图。" src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3。"> 
图3。 浓度足够高的样品离子在“平台模式”下聚焦，并主导局部电导率。我们通常在领先电解质（TE）和尾随电解质（LE）之间以有限进样方式引入样品离子。在此模式下，样品离子根据其有效电泳迁移率进行分离和排序（见视频3）。对于强电离物种，TE区和平台区的浓度由科尔劳施调节函数（KRF，由LE区初始设定的一组不变量）决定。低浓度离子则继续在有效迁移率两侧的平台区之间以峰模式聚焦。聚焦判据（以不等式形式表示）适用于强电离物种。
<img alt="DNA/RNA purification diagram; electrophoresis, qRT-PCR, amplification curves, purification process." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4."> 
图4. 裂解液制备及采用峰模式ITP进行核酸提取。从样品中提取核酸 E. coli 使用溶菌酶辅助碱裂解法进行细胞培养，并通过选择性电聚焦纯化 通过 ITP。与裂解液混合的TE（棕色）含有目标核酸（绿色）、蛋白质以及可能抑制PCR的化学物质。通过合理选择前导离子和尾随离子，可实现对目标核酸的选择性富集，同时将PCR抑制物留在后面。总的核酸ITP峰常呈现非理想形状，如插图所示。作为本检测方法的示例，我们从革兰氏阴性菌中提取了总核酸， 大肠杆菌 （仅用氢氧化钠溶液裂解），使用ITP从裂解液中纯化核酸，收集提取的遗传物质，并进行qRT-PCR分析，以验证从细菌培养物中成功纯化出16S rRNA（红色）和16S rDNA（绿色）。16S rRNA（蓝色）和16S rDNA（黄色）的阴性对照阈值循环数均超过30个循环。我们使用qRT-PCR进行检测 功率 SYBR Green RNA-to-CT 1-步法试剂盒 来自Applied Biosystems，使用150 nM的正向引物（5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG）和反向引物（5'-CACAAAGTGGTAAGCGCCCTC），按照推荐的热循环条件进行。
<img alt="非聚焦示踪剂检测，阳离子ITP分离；电泳装置示意图，荧光。" src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5。"> 
图5. 用于分离和检测未标记氨基酸的非聚焦示踪剂（NFT）检测。a) NFT检测的示意图。将有限量的样品离子注入东侧通道。我们将领先电解质（LE）与一种有效迁移率低于尾随电解质（TE）离子的阳离子荧光示踪剂混合（μtracer &lt; μTE）。该荧光染料被称为“低速示踪剂”。当荧光染料从LE电泳迁移至样品平台区和TE区域时，会经历更高的电场强度，因而其浓度升高。这种浓度变化在等速电泳图中形成阶梯状信号。b) 利用罗丹明6G作为低速荧光示踪剂，通过NFT检测分离两种氨基酸——精氨酸和赖氨酸。TE与精氨酸之间出现的小峰在ITP中较为常见，其成因尚不明确，但在此并不干扰对平台区的检测与定量。
补充视频 1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">点击此处查看补充视频</a>。
补充视频 2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">点击此处查看补充视频</a>。
补充视频 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">点击此处查看补充视频</a>。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文介绍的等速电泳（ITP）方法可实现对离子分子的快速、灵敏且稳健的检测与处理。使用ITP的主要挑战在于正确选择领先电解质（LE）和尾随电解质（TE）缓冲液。在阴离子ITP中，我们通常选择氯离子作为领先阴离子，因为盐酸是一种强酸，具有极高的绝对迁移率，因而性质非常可预测。因此，阴离子ITP中的缓冲液选择通常简化为选择合适的尾随阴离子及其对应的反离子。在选择性富集实验中，尾随离子的选择对于排除干扰离子至关重要。在无污染物的应用中，尾随离子的有效迁移率越低，富集速度越快。我们推荐使用以下几种性质相对稳定的阴离子尾随离子：MES、MOPS、HEPES、三羟甲基甘氨酸（tricine）。反离子的选择会影响系统的pH值和尾随离子的有效迁移率。常用的反离子包括三（羟甲基）氨基甲烷（tris，pKa 8.1）和双（羟甲基）氨基甲烷（bis-tris，pKa 6.4）。对于需要更低或更高pH值的检测，我们分别推荐吡啶（pKa 5.25）和乙醇胺（pKa 9.5）。在表1和表2中，我们分别总结了阴离子和阳离子ITP中若干有用的缓冲液示例。我们以HCl作为阴离子领先离子，钠离子作为阳离子领先离子，并假设领先缓冲液的离子强度为100 mM。
 读者将会注意到，本方案中的缓冲液离子强度（以及表1–2中）始终大于或等于 10 mM。尽管从理论上讲，等速电泳（ITP）的物理原理在低于 10 mM 的离子强度下仍然适用，但天然污染物（例如水与大气中二氧化碳反应生成的碳酸）在约 1 mM 水平时常会限制低离子强度缓冲液的实际应用。 
 需要注意的是，信号转导机制并不局限于本方案中所展示的检测方法。如第5部分简要讨论的那样，在平台模式下，可通过局部电导率、紫外吸收、温度或折射率的变化来检测纯化区带。在我们课题组的研究中，已开发出一种利用荧光载体两性电解质的方法，用于高灵敏度地检测和鉴定未知分析物5。在峰型模式实验中，可使用特异性探针标记聚焦的分析物。例如，我们采用分子信标——即在与靶序列杂交后产生荧光的寡核苷酸探针——以高特异性检测靶DNA或RNA分子11,18。
尽管等速电泳（ITP）对由压力驱动流和电渗流（EOF）引起的弥散具有相对较强的耐受性，但过强的EOF会导致ITP界面停滞，即平均EOF速度等于ITP速度。14 这种强烈的EOF尤其在高pH值和低离子强度条件下发生。因此，若条件允许，我们建议使用pH值不超过8、离子强度约为100 mM的缓冲液。根据我们的经验，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是抑制硼硅酸盐芯片中EOF最有效的涂层。然而，由于PVP具有筛分特性，在某些应用中可能不适用，例如基因组DNA的富集。实验中我们观察到，添加PVP会显著降低基因组DNA的绝对迁移率（甚至导致其无法富集）。在这些情况下，使用硅烷醇类涂层（如Sigmacote）结合表面活性剂（例如Triton-X 100）也能有效降低EOF。10
<table border="1">
<tbody>
<tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td colspan="4">TE 阴离子（pKa -1）</td>
</tr>
<tr>
 <td>缓冲对离子（pKa +1）</td>
 <td>MES (6.10)</td>
 <td>MOPS (7.20)</td>
 <td>HEPES (7.50)</td>
 <td>tricine (8.15)</td>
</tr>
<tr>
 <td>乙醇胺 (9.50)</td>
 <td>21.41</td>
 <td>20.40</td>
 <td>17.38</td>
 <td>22.85</td>
</tr>
<tr>
 <td>tris (8.08)</td>
 <td>21.00</td>
 <td>19.23</td>
 <td>15.84</td>
 <td>17.56</td>
</tr>
<tr>
 <td>双-Tris (6.40)</td>
 <td>18.22</td>
 <td>10.41</td>
 <td>7.30</td>
 <td>5.23</td>
</tr>
<tr>
 <td>吡啶 (5.18)</td>
 <td>1.01</td>
 <td>3.72</td>
 <td>2.42</td>
 <td>1.48</td>
</tr>
</tbody>
 </table> 
表1：在阴离子ITP中，当领先电解质（LE）为100 mM HCl和200 mM缓冲反离子时，经调整的纯分析物区带的有效迁移率大小（× 10-9 m2/V/s）。 
<table border="1"> 
<tbody>
<tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td colspan="4">TE 阳离子（pKa +1）</td>
</tr>
<tr>
 <td>缓冲反离子（pKa&nbsp;-1）</td>
 <td>乙醇胺（9.50）</td>
 <td>Tris（8.08）</td>
 <td>Bis-Tris（6.40）</td>
 <td>吡啶（5.18）</td>
 </tr>
<tr>
 <td>MES（6.10）</td>
 <td>35.57</td>
 <td>21.96</td>
 <td>16.39</td>
 <td>10.45</td>
</tr>
<tr>
 <td>MOPS（7.20）</td>
 <td>35.47</td>
 <td>20.92</td>
 <td>9.76</td>
 <td>3.93</td>
</tr>
<tr>
 <td>HEPES（7.50）</td>
 <td>35.35</td>
 <td>19.97</td>
 <td>7.77</td>
 <td>2.88</td>
</tr>
<tr>
 <td>Tricine（8.15）</td>
 <td>34.77</td>
 <td>16.72</td>
 <td>4.50</td>
 <td>1.44</td>
</tr>
 </tbody>
</table>
表2. 阳离子ITP中经调整的纯分析物区带的有效迁移率大小（× 10-9 m2/V/s），其中领先电解质（LE）为100 mM钠离子和200 mM缓冲对离子。

<table><tbody><tr><td>蒸馏水</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10977</td><td>RNase/DNase 无污染</td></tr><tr><td>Clorox Ultra</td><td>Clorox</td><td>02489CT</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Mallinckrodt Baker 公司</td><td>7708</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma碱（tris）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮（PVP）</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>06067</td><td>MW 1,000,000</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 羧酸</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9784</td><td></td></tr><tr><td>双(2-羟乙基)氨基三羟甲基丙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Invitrogen</td><td>S7564</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411000</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明 6G</td><td>Acros Organics</td><td>CAS 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>L-氨基酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;功率&lt;/em&gt; SYBR Green RNA-to-C&lt;sub&gt;T&lt;/sub&gt; &lt;em&gt;1-Step试剂盒&lt;/em&gt;</td><td>应用生物系统公司</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐微流控芯片</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>NS12A</td><td>可选配塑料提箱，也可不配</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Gast Manufacturing, Inc.</td><td>DOA-P104-AA</td><td></td></tr><tr><td>源表</td><td>基思利</td><td>2410</td><td>恒流与恒压操作模式</td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td>IX70</td><td>使用汞灯（Olympus）或LED（Thorlabs）进行照明</td></tr><tr><td>滤光片组</td><td>欧米茄工程公司</td><td>XF115-2</td><td>激发/发射：蓝色/绿色</td></tr><tr><td>安全锁微型离心管</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>1.5 mL 容量</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5417C</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表3.&lt;/strong&gt; 特定试剂与设备。</td></tr></tbody></table>

芯片上等速电泳用于离子分离与核酸纯化

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

由于电动力学技术能够在结构简单、紧凑且无活动部件的系统中执行多种流体和电泳过程，因此在微尺度应用中已成为一种常用方法。等速电泳（ITP）是一种简单且极为稳健的电动力学技术，可基于离子迁移率实现高达百万倍的预富集1,2，并高效地进行分离与提取3。例如，我们已证明ITP可用于无需或仅需极少样品前处理的未标记离子分子（如毒素、DNA、rRNA、miRNA）的分离与高灵敏度检测4-8，以及从细胞培养物、尿液和血液等复杂基质中提取和纯化核酸9-12。
等速电泳（ITP）利用外加电场以及微流控通道系统中的两种缓冲液实现样品的聚焦与分离。对于阴离子分析物，前导电解质（LE）缓冲液的选择需使其阴离子的有效电泳迁移率高于尾随电解质（TE）缓冲液中阴离子的有效迁移率（有效迁移率描述了离子的可观测漂移速度，并考虑了离子的电离状态，Persat et al.13对此有详细说明）。在TE与LE之间形成界面后，施加电场使LE离子远离TE离子所在区域。具有中等有效迁移率的样品离子向前迁移的速度快于TE离子，但无法超越LE离子，因此它们在LE-TE界面处聚焦（下文简称“ITP界面”）。此外，TE和LE分别形成低电导率和高电导率区域，从而在ITP界面处建立起陡峭的电场梯度。该电场梯度在样品组分聚焦的同时实现其预浓缩。通过合理选择TE和LE，可实现目标组分从其他未聚焦组分中的聚焦与纯化，并最终实现样品组分的分离与分段。
本文综述了等速电泳（ITP）背后的物理原理，并讨论了两种标准运行模式：“峰型”模式和“平台”模式。在峰型模式中，相对稀释的样品离子在ITP界面处的重叠窄峰内共同聚焦。在平台模式中，含量较高的样品离子达到稳态浓度，并根据其有效迁移率分离成相邻的平台状区域。峰型和平台型模式源于相同的物理机制，但因初始分析物浓度和/或样品富集所允许的时间长短不同，表现为不同的运行状态。
我们首先详细描述一个峰模式实验模型，然后演示一种用于从大肠杆菌（E. coli）细胞培养物中提取核酸的峰模式检测方法。最后，我们介绍一种平台模式检测，其中使用非聚焦示踪物（NFT）来可视化氨基酸的分离过程并进行定量分析。

等速电泳（ITP）是一种强大的电动力学分离和预富集技术，其应用范围从毒素检测到样品制备。本文综述了ITP的物理原理，并介绍了该技术在两个具体示例应用中的方法：小分子的分离与检测，以及从细胞培养裂解液中纯化核酸。

电动力学技术因其在微尺度应用中独特地执行多种流体和电泳操作的能力而成为常用方法……

本视频的总体目标是介绍一种名为等速电泳（Isotachophoresis，简称 ITP）的电动力学技术，并展示其在微流控中用于离子高灵敏度检测与分离的应用。首先，讨论 ITP 背后的物理原理，以及两种标准操作模式，即峰型模式和平台型模式。随后，通过三个实验演示芯片上的 ITP 技术：第一个实验是一个简单的样品预富集方案，通过将荧光染料聚焦成尖锐的峰来实现检测；第二个实验展示了一种用于芯片上样品制备的 ITP 分析方法，可从细菌裂解液中选择性提取 DNA 和 RNA。最后，采用一种无标记检测方法，利用平台模式的等速电泳（ITP）来纯化和定量氨基酸。最终，可通过ITP实现氨基酸纯化、分析物预富集以及核酸的选择性提取。今天我们将向您介绍一种多功能电动力学技术——等速分离（Isotachophoresis）——背后的物理原理和方法。本课题组率先开发了用于无标记检测、样品前处理和快速杂交分析的等电聚焦（ITP）方法。我们将向您介绍三种具有代表性的分析方法，以展示ITP在目标物预富集、提取、裂解酸类物质以及氨基酸纯化与检测方面的能力。这些分析方法突显了ITP技术的多功能性，并展示了确保实验可重复性所需的关键步骤。在实验室中，ITP 样品离子在前导电解质（LE）和尾随电解质（TE）之间的界面上选择性聚焦。样品离子以恒定速度通过微通道，该速度由前导离子的迁移速率决定。当样品离子的有效电泳迁移率介于领先电解质（LE）和尾随电解质（TE）离子的迁移率之间时，这些样品离子便会聚焦。迁移率定义为离子漂移速度与局部电场的比值。混合在TE中的样品离子比周围的TE离子迁移更快，因此会在LE-TE界面处富集。此外，等速电泳（ITP）界面具有自锐化特性：可能扩散进入TE区的LE离子会受到强烈的回复通量作用，从而返回领先区；同样，进入LE区的TE离子也会发生类似现象。I two P 的自锐化和自聚焦特性有助于提高该技术的稳定性，并使其对界面处的干扰（如压力驱动流）不敏感。在峰模式下，样品离子的浓度显著低于领先电解质（LE）和尾随电解质（TE）离子的浓度。因此，在这些条件下，样品离子对局部电导率的贡献可忽略不计。多种分析物在ITP界面区域的聚焦主要表现为重叠的峰。最终，样品离子可能达到足够高的浓度，从而分离并以平台模式聚焦。在平台模式下，样品离子根据其电泳迁移率的大小依次分离，并纯化为局部均匀且浓度恒定的区带。在平顶模式下，离子决定局部电导率。极稀的离子仍可能在平顶区之间以峰形模式聚焦。本方案所展示的实验采用一种通过各向同性湿法蚀刻制成的玻璃微流控芯片，其具有交叉通道设计。然而，ITP 也可以在简单的直通道或毛细管中进行，无需交叉或连接结构。在实验前应执行以下清洗步骤，以确保实验间重复性，并成功应用用于抑制电渗流的动态涂层。为去除通道污染，向北侧、东侧和南侧储液池中各加入 10 至 20 微升的 10% 次氯酸钠溶液。若使用标准卡尺芯片卡盒，将200微升移液器吸头的宽端连接至芯片的西储液池，并将真空管路连接至内径为2毫米的管子。施加真空持续两分钟，然后用去离子水充满储液池，并通过真空管路排空，彻底清洗储液池。重复进行多次去离子水清洗。使用一摩尔氢氧化钠重复此过程。通道表面将被轻微蚀刻，从而获得干净的硼硅酸盐表面，有助于建立均匀的表面特性。用去离子水清洗储液池，然后用 le 冲洗通道。在此期间，通道内的表面性质和动态涂层将达到平衡。实验开始前，准备一毫升前导电解质和一毫升尾随电解质。然后将90 µL TE与10 µL 1 µM溶液混合。Alexa Fluor 488。用去离子水冲洗后，倒空西部储液槽，并用去离子水多次冲洗储液槽，以充分稀释其中残留的任何LE。最后，向该储液槽中加入20 µL含有染料的TE缓冲液。将正极置于东侧储液池中，将接地电极或负极置于西侧储液池中，并施加 2 µA 的恒定电流。样品峰将以恒定速度迁移，随着低电导率的 TE 缓冲液逐渐充满，储液池之间的电压将上升。通过选择一种电泳迁移率绝对值低于目标核酸但高于离子型 PCR 抑制剂的尾随阴离子，可利用等速电泳（ITP）从未经处理的细胞裂解液中纯化核酸。强抑制PCR的物质会向相反方向迁移，因此也会被留在后面。开始重悬时，将含有10的8次方个菌落形成单位的大肠杆菌细胞沉淀用80微升无RNA酶的水重悬，并加入10微升裂解试剂，轻轻混匀，室温孵育5分钟。孵育结束后，加入10微升1摩尔的氢氧化钠，将裂解液的pH值调至约12.5。轻轻上下吹打移液器，直至溶液变澄清，此时裂解完成。接下来，将10微升裂解液加入90微升50毫摩尔的Racine和100毫摩尔的bis triss中。该溶液现在可用作te，同时按照书面方案所述制备1毫升含有SYBR Green染料的LE，并用LE填充微流控芯片，操作如前所述。清洗后，将东侧储液池中的内容物替换为PCR兼容的溶液。用去离子水冲洗西侧储液槽，并加入20微升的te。在东西两侧储液槽之间施加1000伏电压以开始实验。实验结束时，这两个储液槽之间的电流将减小。样品随此溶液一同流入LA储液池中。该系统的电流随时间变化通常会达到一个稳定值。通过将移液器上下移动数次，轻轻混匀储液池中的内容物。然后提取五微升体积用于定量分析。R-T-P-C-R-I-T-P 还可用于将小离子分离并富集到 TE 和 LE 之间的相邻且可检测的平台区，从而根据所展示的物理化学特性进行检测。此处为一种非富集示踪分析法，其中将一种荧光离子物种添加至 LE 中。荧光物质不会聚焦，但其浓度会适应局部电场，从而实现对纯化平台区的可视化。首先，准备一毫升含有阳离子型荧光染料Fluor four rod Domine six G的前导电解质和一毫升尾随电解质。然后，将90微升TE缓冲液与各10微升的50毫摩尔精氨酸和50毫摩尔赖氨酸混合，以进行有限进样加载样品。在西部和北部储液池中各加入 20 微升 Ellie，在东部储液池中加入氨基酸样品。接着，在南部储液池施加一分钟的真空。用去离子水冲洗东部储液池后，将其内容物替换为 te。最后一步，在使用荧光报告分子 Alexa Fluor 488 的峰值模式实验中，于东侧和西侧储液池之间施加 500 伏电压。可通过积分总荧光强度，并与校准曲线进行比较，从而获得定量浓度。此处显示的信息为在不同施加电流范围内进行的实验，揭示了样品的情况。峰宽与电流成反比。这是利用峰模式ITP从全细胞裂解液中提取核酸的一个示例。总核酸ITP峰通常呈现非理想形状。在核酸提取实验中，使样本洗脱至LE储液槽，然后用移液器吸取用于定量反转录PCR（qRT-PCR）分析。通过定量反转录PCR结果验证成功纯化了16S核糖体RNA和16S核游戏副本DNA；细菌培养阴性对照的16S核糖体RNA和16S核糖体DNA的扩增阈值循环数均如预期超过30个循环。采用NFT检测法，以RUMINE six G作为荧光示踪剂，对两种氨基酸——精氨酸和赖氨酸——进行了平板模式ITP实验。此处，相对于领先区（LE）或尾随区（TE）荧光强度可用于区域识别，而区域宽度则可用于定量分析。观看本视频后，您应对等速电泳（ITP）及其三种不同ITP检测方法的原理有清晰的物理理解。特别是，我们展示了如何利用ITP纯化氨基酸、对分析物进行预富集，以及选择性提取核酸。请勿忘记，操作高电压可能极其危险。您应始终采取预防措施，例如使用限制电流的设备，并与电极保持足够的距离。

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