Name: 唾液，唾液腺，淋巴收集肩突硬蜱蜱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习从肩突硬蜱采集血淋巴、唾液腺和唾液的方法，用于研究蜱传病原体与宿主相互作用机制。该方案结合截肢、解剖和毛果芸香碱刺激技术，为蜱传疾病防控提供可靠样本采集手段。

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作者谨此感谢虫媒疾病防治司动物资源科，特别是Andrea Peterson、Lisa Massoudi、Verna O'Brien和John Liddell，感谢他们对小鼠和兔子的饲养与维护。我们还要感谢Amy Ullmann、Theresa Russell和Barbara J. Johnson为本手稿作出的贡献。最后，我们谨向美国疾病控制与预防中心（CDC）传播沟通副主管办公室的Alissa Eckert致谢，感谢她制作了本手稿的图示插图；同时感谢Judy Lavelle，感谢她负责本手稿拍摄过程中所有相关法律事务的协调工作。

1. 用于制片的血淋巴采集
（视频 1）
<ol>
	<li>轻柔地从动物身上取下正在吸血的蜱虫，放入3%外用过氧化氢中5分钟，再转入70%乙醇中10分钟，以进行表面消毒。</li>
	<li>使用防脱笔在硅烷涂层载玻片上画一个圆圈，并将蜱虫置于该圆圈内。
	<ol>
		<li>硅烷涂层载玻片有助于血淋巴更好地附着于载玻片表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖显微镜下观察蜱虫（物镜1X，目镜10X，总放大倍数3.5X）。</li>
	<li>用镊子轻轻按压蜱虫背部，使其足部展开并固定蜱虫。</li>
</ol>
注意：固定蜱虫时不要用力过猛，以免破坏中肠或刺破蜱虫，导致血淋巴污染。
<ol start="5">
	<li>使用精细的一次性解剖刀在远端关节处截取蜱虫的一条或多条腿。若仅通过血淋巴检测感染性，截取一条腿即可。若需在载玻片上收集血淋巴，可截取多条腿。</li>
</ol>
注意：不要将腿部切得过于靠近身体，因为这可能导致血淋巴被中肠污染。
<ol start="6">
	<li>切断蜱虫的足部后，继续轻轻按压其背侧，使血淋巴从足部切口渗出至载玻片上。轻轻移动蜱虫，将血淋巴在载玻片上均匀涂开。</li>
</ol>
2. 唾液腺切除
（影片 2 和 3）
<ol>
	<li>在载玻片上滴加数滴 25 μl 的磷酸盐缓冲液（PBS），并将一只蜱虫放入其中一滴 PBS 中。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察蜱虫（物镜 1X，目镜 10X，总放大倍数 3.5X）。</li>
	<li>使用尖头镊子夹住蜱虫的基节（口器部分）或虫体后部，以固定蜱虫。</li>
	<li>将尖头镊子插入蜱虫后部，切开蜱虫的背侧以暴露其内部器官。如需要，可在此时取出中肠，并将其转移至载玻片上新的 PBS 液滴中，或转移至含有 PBS 的微量离心管中。</li>
	<li>在蜱虫腿部两侧寻找成对的唾液腺（呈葡萄串状的团块）。若在蜱虫组织碎片中无法看清唾液腺，可将仍含有唾液腺的主要虫体部分移至新的 PBS 液滴中，以减少干扰并防止唾液腺丢失。</li>
</ol>
注意： 在吸血初期，唾液腺较难定位，因为其发育程度不如吸血后期充分。
<ol start="6">
	<li>用精细尖头镊子将蜱虫的唾液腺取出，并置于新鲜的 PBS 液滴中。</li>
	<li>用精细尖头镊子将唾液腺转移至另一份干净的 25 μl PBS 液滴中，重复此洗涤步骤 3–4 次，以去除所有外部微生物及蜱虫碎片。</li>
</ol>
注意：轻柔地清洗唾液腺簇，以减少单个唾液腺的丢失和损伤。
<ol start="8">
	<li>将腺体放入干净的 PBS 液滴中，置于经硅烷处理的载玻片上，或放入含有 PBS 的微量离心管中。</li>
</ol>
3. 唾液采集
（视频 4）
<ol>
	<li>在雌性成年蜱即将完全吸饱并自然脱落前，大约在附着后5-7天，使用尖头镊子轻轻将其从兔或其他宿主身上取下。</li>
	<li>用透明胶带将接近吸饱的蜱固定在载玻片的一端。胶带应贴在蜱背侧约四分之三处，朝向头部方向，使蜱的基节囊（口器部分）保持暴露。</li>
	<li>在胶带与蜱背面前缘相接处，用移液器加入5 μl的5%匹鲁卡品溶液（溶于甲醇）。让胶带将匹鲁卡品溶液沿蜱背侧向上吸渗，注意避免溶液接触蜱的基节囊。</li>
	<li>在距离蜱口器约一英寸处的载玻片上，放置一块无毒的塑型黏土。</li>
	<li>使用尖头镊子将拉制毛细管28的尖端折断至所需直径。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察蜱的基节囊。</li>
	<li>轻轻将蜱的须下板插入拉制毛细管中，使大颚须位于毛细管外侧。</li>
	<li>将毛细管的另一端压入塑型黏土中，以固定毛细管位置。</li>
	<li>将固定好的正在唾液分泌的蜱置于一个黑暗且高湿度的密闭容器内（例如，内壁衬有湿润纸巾的带盖泡沫塑料盒）。将载玻片倾斜放置，使须下板朝向容器底部，利用重力促进唾液收集。</li>
	<li>将容器置于室温环境中。</li>
	<li>在开始的1小时内密切监测唾液分泌情况，并使用巴斯德移液器胶头将生成的唾液从毛细管中吹出收集。1小时后，每隔1小时检查一次唾液积聚情况，持续至少4小时，并继续收集新分泌的唾液。</li>
</ol>
注意：一旦收集到足量唾液用于当前研究，即可停止唾液采集。
<ol start="12">
	<li>如果蜱虫未分泌唾液或需要更多唾液，可偶尔使用毛细管轻轻按摩其口下板以诱导唾液分泌。</li>
	<li>向唾液中加入0.1倍体积的蛋白酶抑制剂混合物，混匀后于-80°C保存，直至使用。</li>
</ol>
4. 代表性结果
视频1展示了如何持握一只部分吸血的I. scapularis若虫，并截除其腿部以将血淋巴收集到显微镜载玻片上。一旦截除腿部，便会分泌出透明液体（图1A和1B）。若中肠破裂，则血淋巴从被截除的腿部流出时呈现浑浊状（图1C和1D）。
在若虫吸血48或72小时后提取唾液腺的操作过程见视频2和视频3。蜱虫被刺破后通常会释放大量碎片（包括气管、马氏管、血液、结缔组织等），为防止唾液腺丢失或受损，应将蜱虫转移至新鲜的PBS液滴中。图2A和2B显示了若虫被剖开后唾液腺的位置，图2C显示了置于PBS液滴中的已分离唾液腺簇。
I. scapularis 成年雌性蜱唾液采集装置的设置如视频4和图3所示。视频5中可观察到蜱在毛细管中分泌唾液的过程。该唾液采集方法采用匹鲁卡品刺激唾液分泌，每只成年雌性蜱可获得超过20 μl的唾液。
<img alt="蜱虫解剖图；标注唾液腺、口下片、背侧、中肠；生物学教育。" src="/files/ftp_upload/3894/3894fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1。"> 
图 1。 I. scapularis 若虫的标注结构。
视频 1. Ixodes scapularis 血淋巴采集。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie1.avi">点击此处观看视频</a>。
<img alt="蜱虫解剖过程；显微图像；生物学研究；寄生虫学研究方法。" src="/files/ftp_upload/3894/3894fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2. 若虫腿部渗出的未污染（A 和 B）与污染（C 和 D）的血淋巴。
视频 2. 从吸血 48 小时的I. scapularis若虫中提取唾液腺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie2.avi">点击此处观看视频</a>。
视频 3. 从一只吸血 72 小时的I. scapularis若虫中提取唾液腺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie3.avi">点击此处观看视频</a>。
<img alt="蜱虫吸血过程；显微近距离图像；寄生虫附着及吸血各阶段。" src="/files/ftp_upload/3894/3894fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3。"> 
图3。 Ixodes scapularis 若虫唾液腺。（A &amp; B）吸血72小时后的若虫唾液腺示例，提取前状态。（C）已分离的唾液腺组织簇。
视频 4. 从一只成年雌性I. scapularis蜱虫收集唾液的实验装置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie4.avi">点击此处观看视频</a>。
<img alt="蜱虫附着过程、载玻片实验装置、蜱虫移除工具、标本分析。" src="/files/ftp_upload/3894/3894fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4。"> 
图 4。 从成年雌性I. scapularis蜱虫收集唾液。（A &amp; B）蜱虫固定在载玻片上，其口下片插入毛细管的拉细端，毛细管未拉细的一端由橡皮泥固定。（C &amp; D）含有正在分泌唾液的成年雌性I. scapularis蜱虫的湿润培养室。
视频 5. Ixodes scapularis 雌性蜱虫向毛细管内唾液分泌过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie5.avi">点击此处观看视频</a>。

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</ol>

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采集蜱虫的血淋巴、唾液腺及唾液，对于研究蜱传病原体在蜱虫及其宿主中的传播、流行、扩散、增殖和持续存在具有重要意义6,11-13,20,23,29。蜱虫解剖方法有多种30,31，但在采集唾液腺时，关键是要正确解剖蜱虫，以避免唾液腺破裂或遗留在蜱虫残体中。一旦将唾液腺从蜱虫体内取出，需多次清洗以去除中肠污染，随后可将其固定于载玻片上进行染色，或在磷酸盐缓冲液（PBS）中研磨以获得唾液腺提取物（SGE）。与唾液相比，SGE更易于收集，且具有与唾液相似的特性，因此可作为唾液的替代物。然而，SGE中含有来源于唾液腺细胞的额外蛋白质，而这些蛋白质并不存在于蜱虫唾液中。SGE中额外蛋白质的存在可能对某些研究有利，也可能不利，具体取决于实验目的，但研究人员在使用SGE时必须意识到这一点。SGE的一个优势在于，采集唾液腺过程中无需使用匹罗卡品。匹罗卡品是一种毒蕈碱型胆碱能激动剂，可促进唾液分泌，但在唾液采集过程中已被证明对B. burgdorferi具有细胞毒性作用32,33。多巴胺是另一种促唾液分泌激动剂，但与具有持续作用的匹罗卡品相比，多巴胺会迅速被血淋巴及其他蜱虫体...

<table><tbody><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312-500</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Acros Organics</td><td>61509-5000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-2205</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特精细镊子（3C型）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9906085</td><td></td></tr><tr><td>硅烷处理载玻片</td><td>Bioworld</td><td>42763007-1</td><td></td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>Bioworld</td><td>21750008-1</td><td></td></tr><tr><td>超冻 Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>匹鲁卡品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6503-5G</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>#11 一次性手术刀</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>无毒油泥</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17307</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>40A502</td><td></td></tr></tbody></table>

唾液、唾液腺和血淋巴的采集自 ixodes scapularis 蜱虫

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

蜱虫在全球范围内均有分布，可引发多种蜱传疾病，危害人类健康。蜱是多种病原体的传播媒介，这些病原体可导致莱姆病和蜱传回归热（Borrelia spp.）、落基山斑疹热（Rickettsia rickettsii）、埃立克体病（Ehrlichia chaffeensis 和 E. equi）、无形体病（Anaplasma phagocytophilum）、脑炎（蜱传脑炎病毒）、巴贝西虫病（Babesia spp.）、科罗拉多蜱热（Coltivirus）以及土拉菌病（Francisella tularensis）1-8。这些病原体要成功进入宿主，需通过差异性调控基因表达、与蜱体内的蛋白质相互作用，并在蜱体内迁移3,9-13。例如，引起莱姆病的病原体Borrelia burgdorferi会通过差异性基因表达，适应蜱虫自然循环中的“饱食”与“饥饿”两个阶段14,15。此外，当硬蜱属（Ixodes）蜱虫吸食血液时，Borrelia在中肠内复制，并从中肠迁移至血腔，随后到达唾液腺，最终随唾液排出而传播至宿主9,16-19。
蜱虫吸血时，宿主通常会产生强烈的止血反应和先天免疫反应11,13,20-22。尽管存在这些宿主防御反应，I. scapularis仍可持续吸血数天，因为蜱虫唾液中含有具有免疫调节作用的蛋白、溶菌因子、抗凝剂和纤溶酶，有助于蜱虫取食3,11,20,21,23。蜱虫唾液或唾液腺提取物（SGE）所具有的免疫调节活性，可促进多种蜱传病原体的传播、增殖和扩散3,20,24-27。为了进一步了解蜱传感染因子致病的机制，必须对正在吸血的蜱虫进行解剖，并收集其唾液。本视频方案展示了在将幼虫接种至小鼠后48小时和72小时，对正在吸血的I. scapularis若虫进行解剖以收集血淋巴及分离唾液腺的技术。我们还演示了从成年雌性I. scapularis蜱虫中收集唾液的方法。

采集感染蜱虫的血淋巴、唾液腺及唾液对于研究蜱传病原体如何致病具有重要意义。本实验方案中，我们演示了如何从吸血的肩突硬蜱（Ixodes scapularis）若虫中采集血淋巴和唾液腺，并演示了从雌性肩突硬蜱（I. scapularis）成虫中采集唾液的方法。

唾液、唾液腺和血淋巴的采集自 Ixodes scapularis 蜱虫

蜱虫在全球范围内均有分布，可导致人类感染多种蜱传疾病。蜱是多种病原体的传播媒介，这些病原体可引起莱姆病及其他蜱传疾病。

本实验的总体目标是从正在积极摄食的游离黑腿蜱（Ixodes scapularis）中收集蜱体、血淋巴、淋巴、唾液腺及唾液。首先通过在远端关节处截断蜱的腿部以排出血淋巴，从而完成血淋巴的采集；随后在磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖蜱体，找到唾液腺并将其转移至新的洁净PBS中，以完成唾液腺的收集。通过将匹鲁卡品施加到微移液管的尖端，然后将蜱的口器插入汇集的毛细管中，使蜱在管内分泌唾液，从而收集唾液。最终可通过免疫荧光或蛋白质分析获得结果，显示存在于血淋巴或唾液腺中的微生物，以及唾液蛋白与其他蛋白质之间的相互作用等结果。通常，初次进行血淋巴采集的研究人员会遇到困难，因为很难在不破坏中肠的情况下固定住蜱虫，一旦中肠破裂就会污染血淋巴。通常，研究人员在唾液采集方面也可能遇到困难，因为并非所有蜱虫都会分泌唾液。因此，应对已达到或接近饱血状态的蜱虫进行唾液采集尝试。通常，初次进行唾液腺采集的研究人员会遇到困难，因为唾液腺在蜱类残骸中难以定位。一旦找到，这些唾液腺在洗涤步骤中也极易破裂和丢失。从动物宿主上轻轻取下正在吸血的蜱后，将其置于3%外用过氧化氢溶液中五分钟。将蜱虫转移至70%乙醇中浸泡10分钟，以进行表面消毒。使用移液器将蜱虫从70%乙醇中倒出，置于称量纸上。在硅烷化处理的载玻片上画一个圆圈。在解剖显微镜下，将一只蜱虫滑入并放置于培养皿内的圆圈中。用镊子轻轻按压蜱虫的背侧，使其腿部展开并固定蜱虫。然后使用尖头一次性手术刀在远端关节处截取蜱虫的足或足部。在切断足或足部后，继续对蜱虫背侧施加压力，使血淋巴从足部渗出，滴至载玻片上。轻轻移动载玻片上的蜱虫，以分散蜱的血淋巴，从而去除蜱唾液腺。用移液器吸取数次25 µL磷酸盐缓冲液至显微镜载玻片上，将蜱放入解剖显微镜下其中一个PBS液滴中。使用尖头镊子夹住蜱虫的口器或尾部以固定蜱虫。将尖头镊子插入蜱虫尾部，切开蜱虫背部以暴露其内部器官。找到位于蜱虫腿部两侧的一对唾液腺。如果在蜱虫碎片中无法看到腺体，需将仍含有腺体的主要蜱虫部分移至一新鲜的 PBS 液滴中，以减少对唾液腺的干扰和损失，并用精细尖头镊子小心操作。用镊子将唾液腺从蜱虫中取出，并置于一新鲜的 PBS 液滴中。随后将腺体转移至另一干净的 25 微升 PBS 液滴中，并轻柔地重复此清洗步骤。重复第三步三到四次，以去除所有外部微生物和蜱虫碎片。将腺体放入洁净的 PBS 液滴中，置于经处理的载玻片上。从动物宿主取下一只几乎完全吸血的蜱虫后，用胶带将其固定在玻璃载玻片的一端。胶带应贴在约四分之三高度处，使蜱虫的背部朝向头部，留下蜱虫的口器暴露在胶带与蜱虫背面前缘相接的位置。用移液器滴加五微升（5 µL）匹鲁卡品溶液，让胶带将匹鲁卡品溶液沿蜱虫背部虹吸扩散，但避免匹鲁卡品接触到蜱虫的口器部分。将一块无毒的油泥放在显微镜上。使用尖头镊子从蜱虫的口器处向后滑动约一英寸。折断拉制毛细管的

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

唾液，唾液腺，淋巴收集肩突硬蜱蜱

健康实验室饲养蜱虫的繁殖对于蜱虫生物学及蜱-病原体相互作用的研究至关重要。本文展示了一种简单、经济且对小鼠应激较小的幼蜱饲喂方案。...

饲养黑腿蜱（Ixodes scapularis）：利用小鼠饲喂未成熟阶段蜱虫

本文介绍了一种利用改良的整体原位杂交方法，对蜱肠道内可存活微生物群在空间和时间上的分布进行评估的实验方案。...

通过整体染色法观察蜱肠道微生物群 原位 杂交

蜱虫血淋巴的分析是研究某些病原体致病机制以及蜱虫对感染产生免疫应答的重要信息来源。本研究展示了如何将真菌繁殖体接种至饱血雌性微小牛蜱（Rhipicephalus...

披露用于无脊椎动物病理学研究的Metarhizium分生孢子注入微小牛蜱Rhipicephalus microplus及血淋巴采集方法

本研究建立了一种利用连接在实验小鼠上的胶囊装置对硬蜱若虫和幼虫阶段进行饲喂的系统。该饲喂胶囊由柔性材料制成，可牢固地附着在小鼠身上至少一周，便于对蜱虫的吸血过程进行舒适且持续的观察。...

一种基于囊膜的实验室小鼠硬蜱未成熟阶段寄生模型

本方案描述了从蜱虫唾液腺及纯化的细胞外囊泡中分离microRNA的方法。该方法是一种通用流程，结合了常用的试剂和耗材。该方法还可使用少量蜱虫样本，获得高质量的microRNA，可直接用于测序。...

蜱虫中微小RNA的分离

关键词：微小RNA，蜱虫，RNA提取，分子生物学，非编码RNA 离体 唾液腺培养与细胞外囊泡

本文介绍了一种对蜱虫进行血液饲喂的方法 体外通过...

Ixodes scapularis 的蜱人工膜饲喂

我们介绍一种高效收集小型节肢动物可量化血淋巴的方法，用于后续分析。...

一种用于采集小型节肢动物血淋巴的精确且可量化的技术

本文介绍了在临床研究中使人暴露于肩突硬蜱（Ixodes...

一种用于人类接触幼虫期Ixodes scapularis蜱虫的实验暴露模型

本文介绍了一种实验方案，通过解剖已摄食的单个蜱虫，收集其唾液、血淋巴、唾液腺和中肠组织，以研究蜱传病原体在不同组织中的特异性定位，从而增进对媒介传播能力及病原体与微生物组相互作用的理解。...

从单个蜱虫（蜱螨目：硬蜱科）中提取唾液、血淋巴、唾腺及中肠

该方法概述了一种新型的开发流程 体外...

硬蜱研究中通过3D打印腔室上的人工膜进行蜱虫吸血

学习从肩突硬蜱采集血淋巴、唾液腺和唾液的方法，用于研究蜱传病原体与宿主相互作用机制。该方案结合截肢、解剖和毛果芸香碱刺激技术，为蜱传疾病防控提供可靠样本采集手段。

唾液、唾液腺和血淋巴的采集自 Ixodes scapularis 蜱虫

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