Name: 做自己动手恢复冻存样品的设备不慎掉落到低温储罐 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学习使用低成本耐低温设备从液氮杜瓦罐中安全快速回收冻存样品的方法。该装置可单人操作，有效保护样品完整性，适用于冷冻盒和冻存管。

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DIY低温样品回收装置已在以下项目中进行了测试：“利用生物信息学和分子方法在真核细胞中模拟细菌蛋白法呢基化”，该项目由弗吉尼亚科学院玛丽·路易斯·安德鲁斯癌症研究奖资助；“血浆树突状细胞中RNA编辑的生理意义”，由托马斯·F·杰弗里斯和凯特·米勒·杰弗里斯纪念信托基金资助；以及俄罗斯联邦科学与教育部国家合同16.740.11.0364。我们感谢Beth Eom在RNA完整性实验中提供的帮助。

1. 耐低温取盒装置的组装
<ol>
 <li>使用钳子将三边型加固件的一侧扳直（图1A）以制成如图所示的L形牢固连接件 图1B. 注意： 强连接件的尺寸可根据杜瓦瓶瓶颈的直径进行选择。</li>
 <li>使用一条强力绑带T型带将两条强力绑带固定图2) 使用皇冠螺栓、螺母、垫圈和螺丝组装 Cryoscoop 底座，如图所示 图3（A-B）. 注意： 使用两个牢固的绑带，以便取用5 ½ in. × 5 ½ in.的冻存盒。</li>
 <li>使用带槽培养板（图4），将强固T型带上的槽口与开槽板一端的槽口对齐，并借助Hillman螺母和螺栓将两者固定在一起（图5). 注意： 如果槽型钢板和强力拉条未配备预钻孔，则需使用碳化钨钻头进行钻孔。</li>
 <li>用钳子将开槽板的另一端按图示方式弯曲 图6（此步骤为可选步骤）。</li>
 <li>用泡沫包裹手柄，以便在液氮中更牢固地握持装置，如图所示 图6（可选） 注意： 在高压灭菌前去除泡沫。</li>
</ol>
2. 冷冻耐受装置的组装以用于冻存管的取回
这种耐低温的DIY取用装置也可用于取用冻存管。该改造方法是将平底替换为不锈钢滤网，以便从液氮中捞取冻存管（如图7所示）。
<ol>
 <li>拧下将加固T型带固定在带槽板上的螺母和螺栓。</li>
 <li>在将不锈钢滤网安装到带槽板之前，使用钳子轻轻弯曲滤网的颈部，使底部倾斜成类似勺子的形状（图8）。注意：如果滤网带有凸缘，请用钳子将凸缘向下弯曲；这将使设备操作更加方便。</li>
 <li>将滤网手柄上的孔与带槽板上的孔对齐，并使用Hillman螺母和螺栓将滤网固定，如图8所示。注意：如果滤网没有预钻孔，则需要使用碳化钨钻头钻孔。</li>
</ol>
3. 从杜瓦瓶中取出冻存盒和冻存管
<ol>
 <li>首先，戴上低温手套，从杜瓦瓶中取出1至2个冻存架，以留出操作空间。</li>
 <li>使用装有强力系带T型底座的直立式耐低温DIY取物装置（图5），轻轻沿杜瓦瓶底部刮取，收集掉落在杜瓦瓶底部的冻存盒。注意：液氮接触较温暖物体时会立即沸腾，并在物体周围形成隔热的氮气层（莱顿弗罗斯特效应）。为在取样前充分冷却该装置，需先将装置缓慢浸入杜瓦瓶中，待液氮充分冷却装置后，再进行上述步骤。</li>
 <li>沿杜瓦瓶内壁将装置竖直提起，将冻存盒从罐体中舀出。</li>
 <li>取走从杜瓦瓶底部取出的冻存盒。</li>
 <li>如需取回冻存管，可使用带有滤网的冻存管取样勺（图9），轻轻刮取杜瓦瓶底部。</li>
 <li>与取回冻存盒类似，将取样装置竖直提起，并取出滤网中收集的冻存管。</li>
</ol>
4. 代表性结果
基因表达研究中的一个主要挑战是，RNA的质量取决于冷冻组织样本和提取后RNA的储存条件4。图10展示了样本处理方式对总RNA完整性的影​​响。来自相同组织来源（人脂肪组织）的总RNA经过了不同的样本处理。实验前，完整的总RNA制备物显示出清晰的28S和18S rRNA条带，其中28S rRNA条带的强度约为18S rRNA条带的两倍（图10，第1泳道）。这种2:1的比例（28S:18S）表明RNA是完整的，而部分降解的RNA则表现为弥散条带，或其28S:18S强度比偏离2:15。第3–4泳道显示了发生显著降解的RNA样本。这些RNA样本因短期从杜瓦瓶中取出而导致反复部分解冻（方法A），模拟了长期储存过程中由于需要取出掉落的冻存管和盒子而频繁开闭容器的情况（图10，第3–4泳道）。然而，使用DIY装置维护的杜瓦瓶储存的样本（方法B），避免了部分解冻，其RNA保持完整（图10，第2泳道）。
<img alt="金属支架尺寸示意图；显示用于结构分析的构造尺寸。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. A） 底座由两个三边的加固扣件组成，尺寸如图所示。每个加固扣件包含一个较大的预钻孔（实心箭头）和每面上多个较小的孔（小箭头）。这提供了使用螺母和螺栓固定的选项。此外，小孔可在取样过程中实现液氮的快速排出。 B） 借助钳子将每个加固扣件的一侧扳直，形成L形加固扣件。
<img alt="T型梁示意图，静力平衡分析，力矩平衡，6英寸测量，结构设计。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用Strong-tie T型带将多个Strong-tie连接固定。与Strong-tie类似，T型带在每个角上有一个较大的预钻孔（实心箭头）和两个较小的孔（小箭头）。这使得可以通过螺母和螺栓沿T型带长度方向固定Strong-tie，同时也可将T型带紧固到带槽的平板上。
<img alt="用于静力平衡分析的T型带与强固扣件的结构连接装置示意图" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. A） 每个强固扣件沿T型带长度方向，使用冠状螺母、螺栓和垫圈固定在其各个角部。 B） 两个强固扣件彼此相邻固定，以协助取用5½ in. × 5½ in. 的冷冻盒。对于较小的冷冻盒（如2 in. × 2 in.），可将单个强固扣件直接固定在带槽板上，无需使用T型带。
<img alt="带均匀分布孔洞的金属支撑条，结构加强部件，示意图。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 带槽平板用作手柄。带槽平板的长度取决于杜瓦瓶的深度。本例中使用了 4 英尺长的带槽平板。带槽平板的厚度至关重要，因为在从充满液氮的杜瓦瓶中取出样品时，过薄的带槽平板（<14 规格）会使装置变得不稳固。
<img alt="静态平衡尺，ΣFx=0，示意图，展示系统沿程的平衡与力分布。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 将由紧固件和T型带组成的平板基座固定在开槽板的一端。将T型带剩余角上的较大孔与平板上的槽对齐，并使用六角螺栓和螺母紧固。该装置现在可用于从杜瓦瓶中取出冻存盒。
<img alt="静力平衡示意图；机械装置中的力臂；ΣFx=0，MA=0 原理。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 使用钳子将开槽平板的一端弯曲，并用泡沫材料包裹，以提供更好的抓握力，尤其适用于较深的杜瓦瓶，如此处所示。
<img alt="带标注部件的厨房滤网示意图：边缘、颈部、手柄；教育用插图。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 使用带金属网和不锈钢手柄的滤网从杜瓦瓶中取出冻存管。如果手柄上未预设槽口，则需使用碳化钨钻头钻孔。
<img alt="带槽板、颈部、边缘的动态系统装置；力分布图，静态分析。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8. 为便于取出冻存管，使用钳子沿筛网颈部将其弯曲成勺状。若筛网带有边缘（如此例所示），可使用钳子进行弯曲。这样可确保筛网不会卡在杜瓦瓶内。
<img alt="单摆运动示意图，展示简谐振荡和重力作用原理。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. 使用六角螺母和螺栓将滤网在一端固定到带槽的平板上。
<img alt="凝胶电泳结果，DNA条带，泳道 M-1-4，分子标记物，DNA分离过程。" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10. 在不同样本处理条件下总RNA的完整性分析。 为探究样本处理条件对RNA质量的影响，将同一来源的一组RNA样本采用两种不同的处理方式进行处理。方法A包括将RNA储存在杜瓦瓶中，并使用自制装置进行样本取用，从而避免部分解冻；方法B包括将RNA储存在杜瓦瓶中，并通过短期多次从杜瓦瓶中取出样本造成反复的部分解冻，以此模拟长期储存过程中因周期性倾倒而取回掉落样本的情形。随后通过凝胶电泳分析总RNA的完整性。泳道1：储存在杜瓦瓶前的样本；泳道2：采用方法A从杜瓦瓶中取出的样本；泳道3、4：采用方法B从杜瓦瓶中取出的样本；M：100 bp DNA ladder。

<ol><li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKittel%2C+P+%22Advances+in+Cryogenic+Engineering%22">Advances in Cryogenic Engineering</a>. , Springer. 41(1996).</li>
<li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdeskuty%2C+FJ+%22Stewart+Safety+in+the+handling+of+cryogenic+fluids%22">Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids</a>. , Plenum Press. New York. (1996).</li>
<li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCouncil%2C+NR+%22Prudent+Practices+in+the+Laboratory%3A+Handling+and+Management+of+Chemical+Hazards%22">Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards</a>. , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues%3A+checkpoint+towards+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li>
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<li>Harper, C. A., Petrie, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastics+materials+and+processes%3A+a+concise+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley-Interscience%22%5BJournal%5D)">Plastics materials and processes: a concise encyclopedia.</a> Wiley-Interscience. , (2003).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

从杜瓦罐底部取回冻存盒和冻存管最常见的方法之一是将液氮倾倒至备用容器中，然后取出残留在烧瓶内或漂浮在倾倒出的液氮中的样品。然而，这种做法存在安全隐患，可能因长时间暴露于液氮蒸气而导致低温灼伤或窒息2。另一种常见的取回掉落冻存管的方法是使用冻存管夹3。但由于液氮充满罐体内部，空间黑暗，可视性受限，限制了夹具的操作灵活性。
上述描述的耐低温DIY取物装置为从可视性受限的深瓶底部取回掉落的冻存盒和冻存管提供了一种成本更低、更安全且更简便的替代方案。该DIY取物装置操作简便，无需在取物前清空瓶内内容物。此外，使用该装置可由单人完成冻存管的取回。同时，使用该DIY取物装置显著缩短了同一存储单元中其他样本在常温环境下的暴露时间，从而改善了样本的保存条件6,7。
许多常用材料，如塑料、碳钢和橡胶，在液氮中会变脆，通常在受力时发生断裂8,9,10。DIY装置中使用的不锈钢或镀锌部件则能够耐受低温冷冻液体的冰冻温度而不受损。此外，这些部件在当地五金店易于...

自制装置用于回收意外落入深低温储存罐的冷冻保存样本

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks 

液氮是一种无色、无味、极低温（-196 °C）且在加压条件下保存的液体。它通常用作低温流体，用于血液、细胞和组织等生物材料的长期保存1,2。尽管液氮的低温特性非常适合样品保存，但其与活体组织接触时可导致组织迅速冻结——即所谓的“低温冻伤”2，这可能使在杜瓦瓶中进行样品存储和取用操作的人员遭受严重冻伤。此外，液氮在蒸发过程中会降低空气中的氧气浓度，在密闭空间中尤其可能导致窒息2。
在实验室中，生物样本通常保存在杜瓦罐内的不锈钢架上，这些架子上堆叠着冻存管或冻存盒1。这些储存架配有长杆，以防止在常规操作过程中冻存盒从架子上滑落至杜瓦罐底部。然而，贵重样本的冻存盒或冻存管仍经常滑出并沉入充满液氮的罐底。在这种情况下，可通过将液氮转移至备用容器或排空液氮后，费力地找回样本。随后可相对安全地从排空的杜瓦罐中回收冻存盒和冻存管。然而，液氮的低温特性及其极高的膨胀率使得打捞沉没样本存在较大危险。安全管理部门通常建议，不得由单人进行样本打捞操作。另一种替代方法是使用市售的低温抓取器或夹钳来取出冻存管3。然而，由于杜瓦罐内部充满深色液体，可视性极差，严重限制了此类工具的使用效果。
本文介绍了一种耐低温的DIY取样装置的构建方法，该装置可安全、便捷地从盛有低温液体的杜瓦瓶中进行样品取样。

本文介绍一种低成本、耐用的耐低温装置，用于从装有液氮的杜瓦罐中取样。该装置易于制作且采用模块化设计，使从低温罐中取样的过程变得安全且简便。

液氮是一种无色、无味、极低温（-196 °C）、在加压条件下储存的液体。它常被用作长期保存的低温流体。

本实验的目的是通过使用一种易于制作的装置，简化从充满液氮的杜瓦罐中取出冻存盒和冻存管样本的操作。首先，从杜瓦罐中取出一个或两个冻存架，以腾出操作空间，随后将该装置垂直插入杜瓦罐内。第二步是用该装置轻轻刮擦杜瓦罐底部。接下来，沿容器壁将装置垂直上提。为舀出液氮罐中的冻存盒，最后一步是取回从容器底部取出的盒子，并重新安装已移除的冻存架。该技术相较于现有方法（如倾倒法或使用充满液氮的提桶）的主要优势在于，它提供了一种简便、安全且快速的替代方案，能够保持样本完整性，并可由单人操作完成。开始组装耐低温装置时，使用钳子将三面式扎带的一侧扳直，制成LHA型扎带。如图所示，强固扎带的尺寸可根据操作者颈部的直径进行选择。应制作两个这样的强固扎带，以便装置能够取放5.5英寸×5.5英寸的冻存盒。使用皇冠螺栓、螺母垫圈和螺钉，通过强固扎带TST扎带将部件固定，形成冻存铲的基座。该装置现在应呈现如图所示的外观。接下来，使用开槽板，将强固连接T型支架上的槽口与开槽板一端的槽口对齐。然后使用Hillman螺母和螺栓将两者固定在一起。如果开槽板和加固件没有预钻孔，则需钻孔以便安装。如有需要，可将开槽板的另一端弯曲形成手柄，并用泡沫包裹。为更牢固地握持装置，务必在水上密闭测试前取下泡沫。这种耐低温的DIY取用装置也可改装用于取用冻存管。该改装包括将平底替换为经过改造的不锈钢滤网，以便从液体中舀取冻存管。开始组装时，首先拧下盖形螺母和螺栓，将强力轮胎T形绑带连接到带槽板上。然后，在将不锈钢滤网固定到带槽平板之前，使用钳子轻轻弯曲滤网的颈部，使底部倾斜成一定角度，以形成类似勺子的形状。如果所用滤网带有边缘，可用钳子将边缘向下弯曲，以便更方便地操作该装置。将滤网手柄上的孔与带槽板上的孔对齐，并使用Hillman螺母和螺栓固定滤网。如果滤网未预先钻孔，请钻孔。开始从液氮罐中取出冷冻盒时，务必先戴上低温手套。然后从液氮罐中取出一到两个冻存架，以便为操作设备腾出空间。接着，使用带有牢固绑带底座的直立式耐低温 DIY 取样装置，轻轻沿液氮罐底部刮取，收集掉落到罐底的冻存盒。随后，沿液氮罐内壁将装置竖直上提，将冻存盒从罐中捞出。请注意，应垂直握住装置并垂直向上拉出，以避免盒子滑回冻存罐中。取出冻存管时，应使用配有滤网的冻存管铲，轻轻刮取冻存罐底部，类似于取出冻存盒的操作，然后将装置垂直提起，从滤网中取出收集的冻存管。基因表达研究中的一个主要挑战是，RNA的质量取决于冷冻组织样本和提取RNA的储存条件。该图展示了样本处理方式对总RNA完整性的影响。来自相同组织来源的总RNA在实验前经历了不同的样本处理。完整的总RNA制备物显示出清晰的28S和18S核糖体RNA条带，其中28S核糖体RNA条带的强度约为18S核糖体RNA条带的两倍，表明RNA保持完整。第3道和第4道显示的样本由于从冻存容器中短期反复取出而导致部分反复冻融，出现明显降解，模拟了因需要取出倾倒掉落的冻存管而进行长期储存并周期性取样的情况。然而，使用 DIY 装置存放在 doer 服务中的样本因此未发生部分解冻，在第二泳道中仍含有完整的 RNA。观看本视频后，您应能充分了解如何从充满液氮的 dvar 中取回样本，而无需倾倒液氮。

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