Name: 从使用鸡蛋血吸虫作为在体内蠕虫引起的肺部炎症模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习使用曼氏血吸虫卵诱导小鼠肺部炎症模型的方法，通过纯化虫卵、免疫接种和静脉注射建立Th2免疫反应。该技术可评估炎症细胞募集、肉芽肿形成及肺组织病理变化，为研究寄生虫感染和过敏性疾病的免疫机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）AI091759项目以及美国克罗恩病和结肠炎基金会威廉与谢尔比·莫德尔家族基金会研究奖（授予MN）资助。感染血吸虫的小鼠由美国国家过敏和传染病研究所血吸虫资源中心提供（NIAID合同号N01 A130026）。

1. 纯化 曼氏血吸虫 卵
<ol>
 <li>用尾蚴感染Swiss-Webster小鼠，尾蚴是血吸虫（Schistosoma）生命周期中的感染阶段8。或者，可从美国国家过敏和传染病研究所血吸虫资源中心（<a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/</a>）获取已感染血吸虫的小鼠。感染后饲养小鼠6–7周，此时肝脏中已有虫卵，可按以下方法回收（见图1）。</li>
 <li>用CO2处死小鼠，并用70%乙醇润湿体表。将小鼠仰卧放置。使用钝头镊子和剪刀剪除皮肤及下方的腹膜。取出位于肋骨下方和膈肌下方的肝脏。</li>
 <li>将肝脏精细剪碎，每份肝脏加入20 mL消化液混合物，该混合物由胶原酶/分散酶（0.5 mg/mL）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）溶于PBS中配制而成。将混合物置于50 mL Falcon管中，在37 °C摇床中孵育过夜。</li>
 <li>在400 × g、3分钟、20 °C条件下离心混合物。轻轻倒去上清液，并用PBS充满管内。再次离心并重复PBS洗涤。最后一次离心后，将沉淀重悬于25 mL PBS中。</li>
 <li>将重悬的沉淀通过标准金属厨房滤网过滤（使用50 mL注射器活塞将肝组织压入玻璃烧杯），随后将混合物通过细筛过滤（使用10 mL注射器将混合物推过细筛进入第二个玻璃烧杯）。</li>
 <li>将过滤后的混合物放入50 mL Falcon管中。在400 × g、5分钟、20 °C条件下离心。小心倒出上清液，避免丢失沉淀。将沉淀重悬于3 mL PBS中。</li>
 <li>轻柔地将混合物叠加至20% Percoll梯度液上，梯度液总体积为40 mL，由8 mL Percoll和32 mL 0.25 M蔗糖（分子量=342.3，即8.56 g蔗糖/100 mL H2O）组成。</li>
 <li>在800 × g、10分钟、20 °C条件下离心。用移液器吸除并弃去上层胶状肝细胞层。用移液器取出底部的虫卵沉淀，转移至15 mL Falcon管中。</li>
 <li>使用离心条件：30 × g、3分钟、20 °C，用10 mL PBS/1 mM EDTA/1 mM EGTA洗涤沉淀3次。最后将沉淀重悬于500 μL PBS中。</li>
 <li>将混合物叠加至新的25% Percoll梯度液（2.5 mL Percoll和7.5 mL 0.25 M蔗糖）上，总体积10 mL，离心条件为：800 × g、10分钟、20 °C。</li>
 <li>使用离心条件：30 × g、3分钟、20 °C，用10 mL PBS洗涤3次。</li>
 <li>在最后一次10 mL洗涤中，取出100 μL用于计数虫卵。虫卵沉降迅速，因此在取样前必须充分混匀Falcon管。将100 μL样品与900 μL PBS稀释。取100 μL稀释液（即1:10稀释）滴于显微镜载玻片上，使用解剖显微镜进行计数。应使用宽口移液器吸头。</li>
 <li>将虫卵以50,000个/mL的浓度重悬于PBS中。虫卵可在-80 °C保存数月，并可解冻使用一至两次。使用前应在显微镜下检查，确保虫卵仍保持完整（见图1）。</li>
</ol>
2. 采用S. mansoni虫卵进行腹腔致敏：第0天
<ol>
 <li>在5 mL旋盖管中，用100 μL PBS配制5,000个卵。注射时，应准备比所需数量多50%的卵。</li>
 <li>使用23号3/4英寸针头和1 mL注射器，每只小鼠注射100 μL卵悬液。卵会沉降，因此应在使用前立即吸取卵悬液。</li>
 <li>每次注射前轻轻来回摇动注射器以混匀卵悬液，并对每只小鼠进行100 μL卵悬液的腹腔内注射。</li>
</ol>
3. 小鼠眼后静脉注射 S. mansoni 虫卵攻击：第14天
<ol>
 <li>按上述方法制备虫卵，浓度为 5,000 个虫卵/100 μL。</li>
 <li>使用异氟烷（4%）在专用麻醉舱内对小鼠进行麻醉，或通过腹腔注射赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（120 mg/kg）。通过夹捏足垫并确认无任何身体反应来判断麻醉深度。</li>
 <li>用 1 mL 注射器和 23 号3/4英寸针头吸取虫卵悬液后，用镊子将针头弯曲成 90° 角，使针尖斜面朝下并位于弯角处。确保无气泡存在。</li>
 <li>将小鼠侧放，牵拉皮肤使眼球突出，以与鼻部呈 45° 角的方向将 100 μL 虫卵悬液注入眼球后方的血管中。</li>
 <li>拔出针头后施加轻压以控制出血。</li>
</ol>
所有这些操作都必须谨慎进行，并且必须监测小鼠，直至其从麻醉中恢复。这些方案已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
4. 实验收获：第22天
<ol>
 <li>用 CO2 处死小鼠。</li>
 <li>用 70% 乙醇润湿小鼠，并将其仰卧放置。</li>
 <li>使用钝头镊子夹住小鼠腹部，在皮肤上做一个小切口。用剪刀小心去除皮肤，暴露肋骨和腹膜。</li>
 <li>切开腹膜，剪断腹主动脉，用巴斯德移液管回收血液。置于冰上保存。</li>
 <li>将肝脏向下移动以暴露膈肌。使用精细剪刀剪开膈肌，再小心剪开肋骨，暴露肺组织。</li>
 <li>用精细镊子取出引流肺部的胸腺旁淋巴结。这些淋巴结位于胸腺两侧、肋骨下方9。将其置于含 1 mL 无菌培养基（DMEM，添加 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、50 μM 2-巯基乙醇，均来自 Invitrogen）的容器中，置于冰上保存。</li>
 <li>为回收支气管肺泡灌洗液（BAL）并为组织学分析充盈肺部，需进行气管内插管。将唾液腺移向两侧以暴露气管，并将精细镊子置于气管下方。使用精细剪刀在气管中部剪一个小孔，将导管插入肺部，并用手术缝线固定导管。</li>
 <li>将装有 PBS 的 1 mL 注射器连接至导管，用 1 mL PBS 充盈肺部。再用注射器小心回收 BAL 灌洗液，置于冰上保存。</li>
 <li>将装有 PBS 配制的 4% 多聚甲醛（PFA）的 1 mL 注射器连接至导管，充盈肺部。</li>
 <li>移除导管，并拉紧手术缝线以防止 PFA 泄漏。</li>
 <li>小心分离肺组织，放入含 5 mL 4% PFA 的 50 mL Falcon 管中。</li>
</ol>
5. 恢复组织的制备
<ol>
 <li>血清：血液在冰上放置30分钟至2小时以促进凝固后，通过离心（13000 × g，10分钟，4 °C）分离血清。血清储存于-20 °C，可用于细胞因子ELISA或曼氏血吸虫（S. mansoni）虫卵抗原特异性IgG亚型ELISA6, 10。</li>
 <li>淋巴结：制备单细胞悬液，并通过细胞计数评估免疫反应强度。为检测Th2细胞极化，细胞用曼氏血吸虫（S. mansoni）虫卵抗原重新刺激72小时。通过流式细胞术检测细胞内细胞因子染色，上清液则收集后储存于-20 °C，用于Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）ELISA检测6。</li>
 <li>支气管肺泡灌洗液（BAL）：细胞经离心（400 × g，5分钟，4 °C）沉淀。收集BAL上清液并储存于-20 °C，用于ELISA检测Th2细胞因子。BAL细胞计数作为气道炎症的评估指标。取10,000–100,000个细胞进行细胞离心涂片（500 rpm，5分钟，4 °C），经Diffquik染色后可对炎性浸润细胞进行分类计数4, 6。此外，BAL细胞也可通过流式细胞术进行分析6。</li>
 <li>肺组织：肺组织于4 °C保存过夜。固定后的组织经石蜡包埋、切片并贴附于载玻片上，用于组织学及免疫荧光分析。</li>
</ol>
6. 代表性结果
本方案详细说明了以下所有必要步骤：（i）制备纯化的 曼氏血吸虫 用于卵子的 体内 使用（图1），（ii）用这些虫卵对小鼠进行致敏和激发，（iii）取器官以检测肺部炎症反应。这一 体内 模型可重复地引发强烈的 Th2 型肺部炎症反应。这通过支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞计数和细胞离心涂片所显示的气道炎症和嗜酸性粒细胞增多得以证实（图 2）。H&amp;E染色的肺组织切片可用于观察虫卵诱导的肉芽肿（图 3a），肺组织切片的免疫荧光染色可用于观察替代性活化的巨噬细胞以及Th2细胞因子诱导的基因，例如抵抗素样分子（RELM）α（图 3b）。通过ELISA检测抗原刺激的副胸腺淋巴结细胞产生的IL-5、IL-4和IL-13，以评估抗原特异性CD4 Th2细胞因子反应。图 4).
<img alt="曼氏血吸虫卵引起肉芽肿性肝脏示意图；从注射到第22天分析的感染时间线。" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. Schistosoma mansoni 虫卵注射模型。 展示了具有典型高负荷S. mansoni虫卵特征的肉芽肿性肝脏的代表性图像以及S. mansoni虫卵图像——平均大小为长（L）120 μm，宽（W）50 μm。
<img alt="细胞对曼氏血吸虫卵的反应；柱状图，显微镜图像；比较巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等细胞类型的免疫反应研究。" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. S. mansoni 虫卵注射诱导气道炎症。 A. 来自未处理（N）或注射S. mansoni（Sm）虫卵小鼠的支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞数量（x105）。*P&lt;0.05。B. BAL细胞的细胞离心涂片制备。Mac，巨噬细胞（MACROPHAGE）；Eos，嗜酸性粒细胞（EOSINOPHIL）；LYMPH，淋巴细胞（lymphocyte）。标尺，10 μm。
<img alt="组织学分析、组织染色比较、显微镜图像、细胞结构、实验结果。" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 肺部肉芽肿及围绕S. mansoni虫卵的替代性活化巨噬细胞的可视化。A. 在H&amp;E染色的肺组织切片中可见围绕Sm虫卵（黑箭头）的肺肉芽肿。B. 对RELMα（绿色）、甘露糖受体（红色）和DAPI（蓝色）进行免疫荧光染色，显示在肉芽肿中存在替代性活化的巨噬细胞（白箭头），该肉芽肿围绕自发荧光的Sm虫卵（黑箭头）。比例尺，50 μm。
<img alt="IL-4、IL-5、IL-13 表达柱状图；比较未处理组与 S. mansoni 卵注射组的免疫反应结果。" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4.S. mansoni 卵抗原特异性 Th2 细胞因子反应。 分离未处理（N）或注射Sm 卵抗原的小鼠引流胸腺旁淋巴结细胞，用Sm 卵抗原刺激 72 小时，随后通过 ELISA 检测上清液中 IL-4、IL-5 和 IL-13 的水平。标度单位：ng/mL。*P&lt;0.05。

<ol><li>World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+Technical+Report+Series+912%22">WHO Technical Report Series 912</a>. , Geneva. (2002).</li>
<li>Pearce, E. J., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of schistosomiasis.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).</li>
<li>Sandler, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiles+during+acute+pathogen-induced+pulmonary+inflammation+reveal+divergent+roles+for+Th1+and+th2+responses+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair.</a> J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).</li>
<li>Perrigoue, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-31-IL-31R+interactions+negatively+regulate+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).</li>
<li>Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulomas+in+schistosome+and+mycobacterial+infections%3A+a+model+of+local+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses.</a> Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).</li>
<li>Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophage-derived+RELM-%7Balpha%7D+is+a+negative+regulator+of+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).</li>
<li>Dalton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+schistosome+eggs+and+miracidia+free+of+contaminating+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues.</a> Parasitology. 115, 29-32 (1997).</li>
<li>Lewis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+laboratory+maintenance+of+Schistosoma+mansoni%2C+with+observations+on+three+schistosome%2Fsnail+host+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations.</a> J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).</li>
<li>Tilney, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+in+the+adult+laboratory+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat.</a> J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19(2001).</li>
<li>Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+cells+are+required+for+the+Schistosoma+mansoni+egg-induced+granulomatous+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response.</a> J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
<li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

此处采用一种模型 曼氏血吸虫 描述了通过虫卵诱导2型肺部炎症的方法。该模型的特征包括强烈的Th2免疫反应、气道炎症以及肺部肉芽肿的形成。由于这些参数依赖于CD4+ Th2细胞反应 11，这是研究蛋白质特异性或谱系特异性缺失对Th2细胞反应影响的有用模型。此处的检测指标包括抗原特异性Th2细胞因子的定量、气道内细胞浸润的分析以及肺部肉芽肿大小的评估。另一个可测量的参数是虫卵诱导的纤维化。 12。通过Masson三色染色法对注射虫卵的肺组织切片进行染色，可观察到血管周围、气道周围以及肉芽肿内部的胶原沉积（如图所示） 6).
尽管本实验方案使用了曼氏血吸虫（S. mansoni）虫卵，但该模型的一个局限性在于其无法模拟曼氏血吸虫（S. mansoni）感染过程，真正的感染需通过尾蚴感染小鼠来实现。然而，该模型的优势在于操作简便，且不存在研究人员被感染的风险。虫卵纯化后可方便地冷冻保存，并在数月后使用。解冻后的虫卵已无感染性，因此比活虫卵或感染性尾蚴更易于操作。在制备注射...

<table><tbody><tr><td>胶原酶/分散酶</td><td></td><td>罗氏应用科学</td><td>11 097 113 001 (500 mg)</td></tr><tr><td>Diff Quik Hema 3 染色</td><td>包装</td><td>Fisher Scientific Co. LLC</td><td>122-911</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>液体</td><td>Gibco</td><td>11965</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>包装</td><td>Falcon</td><td>352070</td></tr><tr><td>Intramedic PE导管</td><td></td><td>Becton Dickinson and Co.</td><td>427410（0.58毫米）</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td></td><td>Abbot Animal Health</td><td>52600405 (250mL)</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td></td><td>Fort Dodge 动物保健</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>甘露糖受体抗体</td><td>生物素</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2235B</td></tr><tr><td>金属筛网</td><td>标准厨房滤网</td><td>靶点</td><td>Laurentiis</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td></td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710 (16%)</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td></td><td>Gibco</td><td>15070（100倍）</td></tr><tr><td>Percoll</td><td></td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17 0891 01（1 升）</td></tr><tr><td>RELM&amp;alpha; 抗体</td><td></td><td>Peprotech</td><td>500-P214（50&amp;#x03BC;g）</td></tr><tr><td>手术缝合线</td><td></td><td>Surgical Specialties Corp.</td><td>SP118（2.0 USP 100码）</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td></td><td>BD Vacutainer 实验室 医学</td><td>305143（23号针头，3/4英寸）</td></tr><tr><td>美国标准试验筛</td><td></td><td>W.S. Tyler, Inc.</td><td>150&amp;#x03BC;米，0.0059&quot;&lt;br/&gt;
ASTME-11，规格编号 100</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td></td><td>Butler</td><td>20 mg/mL</td></tr></tbody></table>

使用鸡蛋从 曼氏血吸虫 作为一个 体内 寄生蠕虫诱导的肺部炎症模型

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma 寄生虫是一种血吸虫，全球约有 2亿人感染1。在慢性 Schistosoma 感染中，严重的病理变化（包括肝纤维化和脾肿大）是由宿主对寄生虫卵的免疫反应引起的，而非寄生虫本身所致2。寄生虫卵可诱导产生 Th2 型免疫反应，其特征是分泌 IL-4、IL-5 和 IL-13，巨噬细胞发生替代性活化，并募集嗜酸性粒细胞。本文中，我们描述了注射 Schistosoma mansoni 虫卵的方法，作为一种研究模型，用于检测肺组织及引流淋巴结中针对寄生虫的 Th2 细胞因子反应、虫卵周围肺部肉芽肿的形成以及气道炎症。 
经腹腔致敏和静脉激发后 S. mansoni 虫卵通过肺动脉被运送至肺部，并在肺实质内被由淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和替代性活化的巨噬细胞组成的肉芽肿所截留 3-6伴随肉芽肿形成，可观察到支气管肺泡腔内的炎症、引流淋巴结的肿大以及CD4 T细胞的活化。本文详细阐述了分离 曼氏血吸虫 来自感染肝脏的虫卵（改良自 7），使小鼠致敏并进行激发，随后回收器官（支气管肺泡灌洗液（BAL）、肺组织及引流淋巴结）用于分析。我们还提供了代表性的组织学和免疫学数据，并提出了进一步免疫学分析的建议。 
总体而言，该方法提供了一种in vivo模型，用于研究肺部由蠕虫诱导的免疫反应，广泛适用于包括蠕虫感染、纤维化疾病、过敏性炎症和哮喘在内的 Th2 型炎症性疾病的研究。该模型在研究肺部 2 型炎症方面的优势包括：可在肺组织及引流淋巴结中稳定地诱导强烈的 Th2 炎症反应，可通过组织学方法简便地评估虫卵周围肉芽肿的炎症程度，以及虫卵具备长期保存的潜力。

Schistosoma mansoni 虫卵是辅助性 T 细胞 2 型（Th2）免疫反应的强效刺激物，这类免疫反应是寄生虫感染、哮喘及过敏性炎症的特征。本方案利用 S. mansoni 虫卵注射，在肺部诱导由 CD4+ Th2 细胞因子介导的炎症反应，其特征为围绕虫卵形成的肺肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多以及巨噬细胞的替代性活化。

血吸虫是一种寄生性吸虫，全球约有2亿人感染1。在血吸虫慢性感染过程中，严重的……

以下实验的总体目标是研究肺部炎症及免疫细胞反应。首先从感染血吸虫的肝脏中纯化寄生蠕虫卵。第二步，用纯化的虫卵对小鼠进行免疫和激发，从而建立强烈的肺部炎症反应。接下来，分离小鼠的肺脏及引流淋巴器官，以评估对虫卵产生的炎症反应程度。实验结果表明，虫卵可诱导显著的肺部炎症，表现为炎性细胞向肺组织募集以及观察到虫卵引起的肺部病理变化。通常，初次操作该技术的研究人员会遇到一些困难，因为肺脏和淋巴结的解剖以及虫卵注射过程均需要精细的操作和谨慎的态度。然而，完善这一技术具有重要意义，因为它能够可视化宿主对曼氏血吸虫卵产生的强烈炎症性肺部反应。该技术由Nyer和Greenberg实验室的技术人员Karen和Will进行示范：将一只感染了曼氏血吸虫（Schistosoma circ）后已处死的小鼠仰卧放置，切开皮肤以暴露腹膜，切除位于肋骨下方及膈肌下方的肝脏，将肝脏组织充分剪碎后，每份肝脏加入20毫升消化液混合物（包含胶原酶、胰蛋白酶、青霉素和链霉素的PBS溶液）。将此混合物置于50毫升Falcon管中，在37摄氏度摇床中孵育过夜。第二天，将混合物离心。倒出上清液，向管中加入 PBS 重悬后再次离心，最后一次离心后重复 PBS 洗涤步骤。将沉淀重悬于25毫升PBS中。接着将重悬的沉淀先通过金属滤网过滤，再通过筛网过滤。将过滤后的混合物置于50毫升Falcon管中，离心。倒出上清液并重悬沉淀。将沉淀悬浮于三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。轻轻将混合液覆盖于40毫升梯度溶液上，每份样品八毫升，共32毫升0.25摩尔蔗糖溶液，于20摄氏度以800 × g离心10分钟。接下来，使用移液管弃去上层的肝细胞。收集底部的卵细胞沉淀，并将其放入一个50毫升的离心管中。用含有1 mmol/L EDTA和EGTA的10毫升PBS洗涤沉淀三次，并进行离心。将沉淀重悬于500微升PBS中。将此混合物覆盖于新的10毫升梯度液上，该梯度液包含2.5毫升per call和7.5毫升0.25摩尔蔗糖，然后离心。用10毫升溶液将沉淀洗涤三次。PBS 和离心。确保 Falcon 管充分混匀，并从最后一次洗涤中取出 50 微升。为计数虫卵，将这 50 微升样品进行稀释。加入450微升PBS混匀，取100微升该混合液滴加至置于解剖显微镜载物台上的载玻片上，计数液滴。用PBS将虫卵重悬至每毫升含50,000个虫卵。虫卵可在-80摄氏度保存数月，并可冻融一至两次用于实验。使用前，在5毫升带盖离心管中于显微镜下检查虫卵，确保其完整性。每只小鼠注射用卵的制备量为每100微升PBS中含5,000个卵。估算所需数量时，应多准备50%的卵。使用23号、五分之八英寸长的针头及1毫升注射器，每只小鼠加载100微升卵悬浮液。每次注射前，将注射器前后轻轻摇动以混匀虫卵，每只小鼠腹腔注射 100 µL 悬液，于致敏后第 14 天进行。按每 100 µL 含 5,000 个虫卵的比例制备虫卵悬液，用 1 mL 注射器及 23 号针头吸取虫卵悬液。使用镊子将针头弯成 90 度角，并确保无气泡存在。麻醉小鼠并将其侧放。以与鼻部呈45度角的方向，向眼球后方的血管内注射100 µL悬浮液。静脉攻击后第8天，处死小鼠，并在腹部皮肤上做一个小切口。切开腹膜，找到腹主动脉。剪断主动脉，用巴氏吸管收集血液，并将血液置于冰上保存。下移肝脏以暴露膈肌。使用精细剪刀剪开膈肌并小心切割。打开肋骨 cage 以暴露肺组织。胸腺旁淋巴结位于肺上方肋骨 cage 下方、胸腺两侧。用精细镊子回收淋巴结，并将其置于含有1毫升无菌培养基的冰上保存。开始插管操作时，将唾液腺移至一侧以暴露气管。将精细镊子置于气管下方，并使用精细剪刀。在气管中部切开一个小孔，将导管插入肺部。用手术缝合线绑紧导管以固定。然后将一支装有1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的注射器连接到导管上，用1毫升PBS充盈肺部。用注射器小心回收支气管肺泡灌洗液，并将其置于冰上保存。接着，将装有1毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液的注射器连接至导管，灌注并充盈肺部。然后移除导管，并扎紧手术缝线以防止多聚甲醛泄漏。最后，仔细分离出肺组织，并将其置于含有5毫升4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液的50毫升离心管中。在冰上孵育0.5至2小时后，离心收集的血液以分离血清层，该血清可用于曼氏血吸虫卵抗原特异性IgG亚型ELISA检测。切除的肠系膜淋巴结可用曼氏血吸虫卵抗原再次刺激，以分析抗原特异性的TH2型细胞因子。在离心并沉淀细胞后，回收支气管肺泡灌洗（BAL）液，用于ELISA法检测TH2型细胞因子。同时回收BAL细胞用于细胞离心涂片制备。用于组织学和免疫荧光裂解的过夜固定肺组织，此处显示的是肉芽肿性肝脏图像，这是高密度血吸虫卵负荷的特征。图中还展示了血吸虫卵。该图表示由注射日本血吸虫卵引发的气道炎症。左侧的图表显示，与未处理小鼠相比，注射了曼氏血吸虫卵的小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞数量显著升高。左侧图像为典型的细胞离心涂片，BAL细胞制备结果可见，其中的炎性浸润细胞包括巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞，均可清晰辨认。在H和E染色的肺组织切片中，显示了围绕esson卵的肺肉芽肿。该图像显示了realm alpha的免疫荧光染色，呈绿色；mano受体呈红色，DPI染料呈蓝色，白色箭头所示为观察到的替代激活型巨噬细胞。此处展示了经曼氏血吸虫卵抗原刺激后，幼稚小鼠与注射了曼氏血吸虫的小鼠在旁道淋巴结中针对该抗原的TH2型细胞因子应答。每组小鼠的淋巴结细胞均用曼氏血吸虫卵抗原刺激72小时，随后对上清液进行ELISA检测，以测定IL-4、IL-5和IL-13的水平。三种炎症性细胞因子的浓度在感染后的小鼠体内均显著升高。该技术为过敏与头盔寄生虫感染领域的研究人员提供了一种简便的方法，可用于在小鼠模型生物中研究感染及过敏反应所募集的免疫细胞。

using-eggs-from-schistosoma-mansoni-as-an-vivo-model-helminth-induced

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从使用鸡蛋<em&gt;血吸虫</em&gt;作为<em&gt;在体内</em&gt;蠕虫引起的肺部炎症模型

Trichuris muris 感染：肠道2型免疫与炎症的一个模型

我们描述了一种体外培养扁形寄生虫曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）幼虫（schistosomula）的方法，该方法通过从淡水螺类中间宿主光滑双脐螺（Biomphalaria...

尾蚴转化与 体外 培养 曼氏血吸虫 童虫

Heligmosomoides polygyrus 是一种具有强大免疫调节能力的小鼠线虫，其特性与人类高发的蠕虫感染非常相似。本文介绍了一种用于长期维持该线虫的实验方案 H. polygyrus 生命周期.

Heligmosomoides polygyrus的培养：一种免疫调节性线虫寄生虫及其分泌产物

本文介绍了一种用于大规模无菌分离和收集游离型人血吸虫毛蚴的实验方案 曼氏血吸虫 及其后续处理以引入 体外 培养...

大规模分离与 体外 软体动物体内人类血吸虫阶段的培养 曼氏血吸虫

本文介绍了一种蟋蟀卵显微注射的实验方案，该技术是开展蟋蟀多种实验研究的基础方法，包括但不限于RNA干扰和基因组编辑。...

注射Gryllus bimaculatus卵

本文提供了一种通过核转染子孢子或第二代裂殖子实现鸡艾美球虫（Eimeria）寄生虫稳定转染的方法。表达外源抗原基因的基因修饰艾美球虫可作为疫苗递送载体。...

核转染与鸡体内扩增 艾美耳球虫 寄生虫

微孢子虫寄生虫Nematocida parisii感染Caenorhabditis...

研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

表达IL-9的T细胞和ILC2细胞在……期间被诱导产生 N. brasiliensis 感染，但由于其频率较低且动力学特征不同，这些细胞在受感染肠道中的表征在很大程度上被忽视。本方案描述了从不同靶器官中分离这些细胞并鉴定其身份的方法。 通过...

一种研究Nippostrongylus brasiliensis感染模型中产生IL-9的淋巴细胞的策略

小鼠感染寄生性线虫Strongyloides ratti的实验方法

本文描述了in vitro条件下多房棘球绦虫（Echinococcus...

小细胞外囊泡的分离及其树突状细胞摄取 细粒棘球绦虫

本研究评估了以下生物学活性 Tithonia diversifolia 使用基于自由基的方法提取并分析 体外...

抗氧化与驱虫特性的评价 Tithonia diversifolia 使用提取物对抗胃肠道线虫卵 体外 检测方法

学习使用曼氏血吸虫卵诱导小鼠肺部炎症模型的方法，通过纯化虫卵、免疫接种和静脉注射建立Th2免疫反应。该技术可评估炎症细胞募集、肉芽肿形成及肺组织病理变化，为研究寄生虫感染和过敏性疾病的免疫机制提供重要工具。

使用鸡蛋从曼氏血吸虫作为一个体内寄生蠕虫诱导的肺部炎症模型

探索更多视频

使用鸡蛋从 曼氏血吸虫 作为一个 体内 寄生蠕虫诱导的肺部炎症模型

探索更多视频

使用鸡蛋从曼氏血吸虫作为一个体内寄生蠕虫诱导的肺部炎症模型