Name: 在中央小鼠中枢神经系统的干细胞移植的多模态成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学习使用生物发光成像和磁共振成像对小鼠中枢神经系统中的干细胞移植进行多模态成像，并通过组织学分析验证结果。该方法可追踪细胞存活和定位，为神经退行性疾病研究提供重要工具。

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本研究工作得到了安特卫普大学研究基金 ID-BOF 2006（授予 PPo 和 AVdL）、比利时弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen，比利时）的研究基金 G.0136.11 和 G.0130.11（授予 AVdL、ZB 和 PPo）以及 1.5.021.09.N.00（授予 PPo）、弗拉芒科学技术研究所（IWT）SBO 研究基金 IWT-60838：BRAINSTIM（授予 ZB 和 AVDL）、比利时弗拉芒政府部分资助的 Methusalem 研究基金（授予 ZB）、欧洲共同体第六框架计划网络研究项目 DiMI（EC-FP6-NoE DiMI，项目编号 LSHB-CT-2005-512146）和 EMIL（EC-FP6-NoE EMIL，项目编号 LSHC-CT-2004-503569），以及比利时大学间吸引力中心计划 IUAP-NIMI-P6/38（授予 AVDL）的支持。Nathalie De Vocht 获得了弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）的博士研究生奖学金。Peter Ponsaerts 是弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）的博士后研究员。

1. 细胞制备
<ol>
	<li>应使用经过基因工程改造、可表达荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告蛋白的体外培养干细胞群体启动实验。本实验采用如Bergwerf et al.2, 5先前所述的表达荧光素酶/eGFP的小鼠骨髓来源基质细胞（BMSC-Luc/eGFP）。</li>
	<li>在细胞标记前两天，将BMSC-Luc/eGFP细胞以每T75培养瓶8 × 105个细胞的密度接种于15 ml完全扩增培养基（CEM）中，并添加1 μg/ml嘌呤霉素。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养48小时。</li>
	<li>向正在生长的细胞培养物中加入每毫升培养基5 × 106个Glacial Blue微米级氧化铁颗粒（GB MPIO）（总计：每个T75培养瓶15 ml培养基中加入75 × 106个颗粒）。</li>
	<li>孵育16小时，以使细胞通过内吞作用摄取颗粒。</li>
	<li>洗去未被摄取的颗粒，并继续培养24小时，以获得细胞融合度及GB MPIO的均匀分布。</li>
	<li>通过荧光显微镜观察验证颗粒摄取情况，计数eGFP阳性细胞中同时为GB MPIO阳性的细胞比例。</li>
	<li>用10 ml PBS将标记了GB MPIO的BMSC-Luc/eGFP细胞洗涤两次，并在胰蛋白酶-EDTA处理后（每个T75培养瓶加入5 ml，作用5分钟）收集细胞。</li>
	<li>洗涤收集的细胞，并将其重悬于PBS中，最终浓度为133 × 106个细胞/ml。</li>
	<li>将细胞置于冰上保存，直至移植。</li>
</ol>
2. 小鼠中枢神经系统内的细胞移植
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）混合物麻醉小鼠。</li>
	<li>等待5分钟，使小鼠完全进入睡眠状态。</li>
	<li>剃除小鼠头部毛发，以便进行无菌操作。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪中。</li>
	<li>对皮肤进行消毒，并润湿小鼠眼睛以防止脱水。</li>
	<li>沿中线做头皮切口以暴露颅骨，并使用牙科钻头在以下坐标位置钻孔：前囟后方2 mm，外侧2 mm。</li>
	<li>短暂涡旋混匀细胞悬液，然后用注射器吸取细胞悬液。</li>
	<li>将注射器针头置于硬脑膜下2.5 mm深度，静置1分钟以平衡压力。</li>
	<li>使用自动微量注射泵，在硬脑膜下2 mm深度以0.70 μl/min的速度注射3 μl细胞悬液（含4 × 105 个细胞）。</li>
	<li>额外等待5分钟，防止注入的细胞悬液回流。</li>
	<li>缓慢撤出针头，在缝合皮肤前对伤口边缘进行消毒。</li>
	<li>皮下注射300 μl 0.9% NaCl溶液以防止脱水，并将小鼠置于加热灯下使其从麻醉中恢复。根据机构标准给予术后镇痛药物。</li>
</ol>
3. 体内 生物发光
<ol>
	<li>使用3%异氟烷与氧气的混合气体对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>将小鼠置于光子成像仪中，并将麻醉水平降低至1.5%异氟烷与氧气。</li>
	<li>以每公斤体重150 mg的剂量静脉注射D-荧光素酶底物（D-luciferin）。</li>
	<li>使用Photo Vision软件采集5分钟的图像。</li>
	<li>使用M3vision软件进行图像处理，并通过设定固定的感兴趣区域对检测到的信号进行定量分析。</li>
</ol>
4. 体内 磁共振成像
<ol>
	<li>使用3%异氟烷与O2:N2O（3:7）混合气体对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>将小鼠置于水平9.4T磁共振系统的固定器中，并将麻醉水平降低至1%异氟烷与O2:N2O（3:7）混合气体。</li>
	<li>润湿小鼠眼睛以防止脱水，连接直肠探头以监测体温，并将呼吸传感器置于小鼠腹部下方以监测呼吸频率。</li>
	<li>维持呼吸频率在110 ± 10次/分钟，并将体温稳定控制在37 ± 0.5 °C的狭窄范围内。</li>
	<li>将表面射频线圈置于小鼠头部上方，并将小鼠置于磁体中心位置。</li>
	<li>采集一组10张冠状面T2加权自旋回波（SE）图像以获取特定解剖信息，同时采集T2*加权梯度回波（GE）图像以研究干细胞迁移，面内分辨率为70 μm2。序列参数设置如下：重复时间（TR）：500 ms，回波时间（TE）：8 ms（GE序列）；重复时间（TR）：4200 ms，回波时间（TE）：12.16 ms（SE序列）；视野（FOV）：18×18 mm2，矩阵：256×256，层厚1 mm，层间距1 mm（使用Paravision 5.1软件）。</li>
	<li>使用Amira 4.0软件进行数据处理。</li>
</ol>
5. 尸检组织学
<ol>
	<li>通过吸入异氟烷（4%）、氧气（0.5 L/min）和氮气（1 L/min）的混合气体，使小鼠深度麻醉2分钟。通过颈椎脱臼法处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠脑组织从颅骨中取出，并在含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定2小时。</li>
	<li>通过将脑组织依次置于不同浓度梯度的蔗糖溶液中进行脱水处理：在含5%蔗糖的PBS中放置2小时，在含10%蔗糖的PBS中放置2小时，在含20%蔗糖的PBS中过夜。</li>
	<li>使用液氮冷冻脑组织，并将组织储存在-80 °C直至切片。</li>
	<li>使用冷冻切片机将脑组织切成10 μm厚的切片。</li>
	<li>使用荧光显微镜对未染色的冷冻切片进行筛选，观察GB MPIO颗粒产生的蓝色荧光以及表达eGFP的细胞产生的绿色荧光。</li>
	<li>对未染色的冷冻切片进行绿色/红色背景荧光的筛查，以检测炎症细胞的自发荧光。</li>
	<li>进行进一步的免疫组织化学和免疫荧光染色，以鉴定与细胞移植物相互作用的内源性细胞群体（例如小胶质细胞、星形胶质细胞、T细胞等）。</li>
</ol>
6. 代表性结果
我们在此直观展示了在小鼠中枢神经系统内对表达荧光素酶/eGFP的（干细胞）细胞群进行成功多模态成像的优化操作流程。首先，所述GB MPIO标记方法可实现对BMSC-Luc/eGFP细胞的高效标记，该效果可通过荧光显微镜轻松验证图2A）。接下来，将经GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP移植至小鼠中枢神经系统后，可通过生物发光成像 体内 基于荧光素酶活性的BLI（生物发光成像）图2B）。此外，可通过以下方法监测移植细胞的精确定位： 体内 基于GB MPIO铁含量的MRI图2C最后，组织学分析可用于验证通过生物发光成像（BLI）和磁共振成像（MRI）获得的结果。稳定的存活状态通过随时间推移eGFP表达的稳定性得以确认（图2D）。通过eGFP表达细胞与蓝色荧光MPIO的共定位，可精确定位移植细胞的位置并评估其存活情况。此外，干细胞的双重荧光标记可降低因炎症细胞产生的背景荧光而导致假阳性结果的可能性。5.
<img alt="细胞标记与移植过程。示意图显示了活体生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）以及死后组织学分析。" src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1."> 
图1. 操作流程概览
<ol class="lroman">
	<li>细胞标记：将 BMSC-Luc/eGFP 细胞以每毫升培养基 5 × 106 个 GB MPIO 粒子进行标记。经 16 小时孵育及随后 24 小时静置后，收集细胞用于脑内移植。</li>
	<li>细胞移植：将标记 GB MPIO 的 BMSC-Luc/eGFP 细胞移植至小鼠脑内，移植坐标为前囟后 2 mm，中线右侧 2 mm，硬膜下 2 mm。</li>
	<li>活体 生物发光成像（BLI）：静脉注射 D-荧光素钠 150 mg/kg 体重后，使用 Photon Imager 采集 5 分钟内的发光信号。</li>
	<li>活体 磁共振成像（MRI）：获取一组共 10 张冠状面 T2 加权自旋回波（SE）图像和 T2* 加权梯度回波（GE）图像，面内分辨率为 70 μm2。序列参数如下：重复时间（TR）：500 ms，回波时间（TE）：8 ms（GE 序列）；重复时间（TR）：4200 ms，回波时间（TE）：12.16 ms（SE 序列）；视野（FOV）：18×18 mm2，矩阵：256×256，层厚 1 mm，层间距 1 mm。</li>
	<li>死后组织学分析：使用荧光显微镜检测 10 μm 厚的冷冻切片中表达 eGFP 及呈蓝色荧光标记的 BMSC。</li>
</ol>
<img alt="体外细胞标记、活体成像、MRI扫描、死后组织学显示细胞分布。" src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2."> 
图2. 干细胞移植物的多模态成像
<ol class="ualpha">
	<li>Glacial blue (GB) MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP的直接免疫荧光显微镜观察</li>
	<li>在体 注射了 4x10⁶ 个细胞的小鼠的生物发光成像5 植入后第1周和第2周，GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP细胞。植入后第1周和第2周检测到的BLI信号的统计分析。数据表示为每秒每球面度每平方厘米的平均光子数（ph/s/sr/cm²）2) 来自小鼠注射部位显示清晰BLI信号的固定感兴趣区域，计算5分钟时间段内的±标准误。</li>
	<li>小鼠脑内GB部位经MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP（左图：(i) T2加权自旋回波图像和(ii) T2*加权梯度回波图像）与未标记的BMSC-Luc/eGFP（右图：(iii) T2加权自旋回波图像和(vi) T2*加权梯度回波图像）移植灶的冠状面二维磁共振成像。</li>
	<li>植入后第2周GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP移植物的组织学分析。（i）针对表达eGFP及GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP移植物定位的直接免疫荧光分析。（ii）（i）的高倍放大细节。（iii）GFAP抗原的免疫荧光染色，显示在GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP周围星形胶质细胞瘢痕组织的形成。（vi）Iba-1抗原的免疫荧光染色，显示小胶质细胞对GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP的侵袭及其周围的包绕。</li>
</ol>

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<li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter%3A+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本报告中，我们描述了一种优化的实验方案，结合三种互补的成像技术（生物发光成像、磁共振成像和组织学）对免疫功能正常小鼠中枢神经系统内的细胞移植进行详细表征。通过细胞报告基因标记（基于萤火虫荧光素酶和eGFP基因修饰）与GB MPIO直接细胞标记相结合，可实现对干细胞移植物的精确定量与定位分析 体内.
为了对BMSC进行颗粒标记，建议使用GB MPIO颗粒（粒径1.63 μm）并结合其阴离子表面（含羧基取代基），以促进非吞噬性细胞通过内吞作用摄取这些颗粒16-18。然而需要指出的是，获得高标记效率所需的孵育时间取决于细胞类型。例如，吞噬性细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）能够更快地内化这些颗粒（孵育时间为0.5–1小时），而非吞噬性细胞（如BMSC或神经干细胞）则需要至少16小时的孵育时间才能实现有效标记。在进行细胞标记实验时必须考虑这一因素，并且应始终在实验前通过荧光显微镜和/或流式细胞分析确定标记效率。由于使用GB MPIO对细胞群体进行标记不会影响细胞活力、细胞增殖或细胞表型5，因此这些颗粒中同时包含氧化铁和荧光染料，为...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Lonza Inc.</td><td>BE12-722F</td><td>细胞生长培养基CEM的组分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td>细胞生长培养基CEM的组分</td></tr><tr><td>马血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>1605-122</td><td>细胞生长培养基CEM的组分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td>细胞生长培养基CEM的组分</td></tr><tr><td>两性霉素B（Fungizone）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15290-018</td><td>细胞生长培养基CEM的组分</td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素（Puromycine）</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（trypsin）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>GB MPIO</td><td>Bangs Laboratories</td><td>ME04F/7833</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素（D-luciferin）</td><td>Promega Corp.</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketamine, Ketalar）</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylazine, Rompun）</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isoflurane）</td><td>Isoflo</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl溶液</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（paraformaldehyde）</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖（sucrose）</td><td>Applichem</td><td>A1125</td><td></td></tr><tr><td>微量注射泵（Micro-injection pump）</td><td>KD scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>光子成像仪（Photon imager）</td><td>Biospace Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4T磁共振成像仪（9.4T MR scanner）</td><td>Bruker Corporation</td><td>Biospec 94/20 USR</td><td></td></tr><tr><td>BX51显微镜（BX51 microscope）</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Mycrom HM冷冻切片机（Mycrom HM cryostat）</td><td>Prosan</td><td>HM525</td><td></td></tr><tr><td>注射器（syringe）</td><td>Hamilton Co</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30号针头（30 gauge needle）</td><td>Hamilton Co</td><td>7762-03</td><td></td></tr><tr><td>Photo Vision软件</td><td>Biospace Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3vision软件</td><td>Biospace Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paravision 5.1软件</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira 4.0软件</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

在过去的十年中，干细胞移植作为多种疾病在临床前和临床研究中的一种主要或辅助治疗手段，受到越来越多的关注。然而，迄今为止，关于干细胞移植后功能改善和/或组织再生的研究结果仍存在较大差异。通常可观察到一定的临床益处，但对其潜在机制尚缺乏深入理解1。因此，众多研究致力于开发不同的分子成像技术，以监测干细胞移植情况，最终准确评估移植干细胞的存活、命运及其生理状态，以及/或其微环境的变化。分子成像所检测到的一个或多个参数的变化可能与所观察到的临床效应相关。在这一背景下，我们的研究聚焦于联合使用生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）和组织学分析来评估干细胞移植效果。
BLI 通常用于在细胞移植后无创地进行细胞示踪，并随时间监测细胞存活情况2-7，其原理基于一种生化反应：表达荧光素酶报告基因的细胞在与其底物（例如 D-荧光素）相互作用后能够发光8, 9。另一方面，MRI 是一种具有临床适用性的非侵入性技术10，可用于高分辨率精确定位细胞移植物11-15，尽管其灵敏度在很大程度上取决于细胞标记磁共振成像对比剂后所产生的对比效果。最后，死后组织学分析是验证非侵入性技术所获得研究结果的首选方法，具有最高的分辨率和灵敏度。此外，终点组织学分析可基于荧光报告蛋白的使用和/或通过特异性抗体对细胞进行直接标记，对移植物细胞和/或周围组织进行详细的表型分析。
综上所述，本文通过直观展示生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）和组织学技术的互补性，揭示了小鼠中枢神经系统（CNS）内干细胞移植后与干细胞和/或微环境相关的不同特征。以骨髓来源的基质细胞为例，这些细胞经基因工程改造后可表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和萤火虫荧光素酶（fLuc），并标记了蓝色荧光的微米级氧化铁颗粒（MPIOs），将其移植到免疫功能健全的小鼠中枢神经系统中，并通过BLI、MRI和组织学方法对移植结果进行监测（图1）。

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。

在过去十年中，干细胞移植作为一种主要或辅助治疗手段，在多种疾病的治疗中受到越来越多的关注，……

本实验的总体目标是实现对移植到小鼠脑内的干细胞在体内的行为进行标准化的随访观察。首先，用荧光微米级氧化铁颗粒标记骨髓来源的基质细胞，这些细胞共表达 EGFP 和荧光素酶；其次，将标记了 MPIO 的骨髓细胞（BMCs）准确注射至小鼠脑组织中。接下来，利用生物发光成像和磁共振成像无创地追踪细胞移植物的存活情况和定位。最后一步是通过死后组织学分析验证活体成像结果。该方法可揭示干细胞移植到小鼠脑内后的行为特征，也可应用于其他系统，如模式生物及疾病研究。该方法的可视化演示至关重要，因为动物操作步骤难以掌握，静脉注射和脑内注射操作难度较大，且存在影响动物存活的风险。开始此操作时，将75乘以10的6次方个冰蓝微米级氧化铁颗粒加入亚融合生长的细胞培养物中。继续孵育16小时，使细胞通过内吞作用摄取颗粒，随后洗去未被摄取的剩余颗粒。继续培养细胞 24 小时，以获得细胞共融性和 G-B-M-P-I-O 的均匀分布。随后，通过荧光显微镜观察，计算 EGFP 阳性且 G-B-M-P-I-O 阳性细胞占总 EGFP 阳性细胞的比例，以直观验证颗粒的摄取情况。接着，用 10 毫升 PBS 洗涤标记了 G-B-M-P-I-O 的 BMSC luciferase EGFP 细胞两次。用胰蛋白酶EDTA处理细胞，随后收集细胞。然后洗涤细胞，并将其重悬于PBS中，最终浓度为每毫升133×10⁶个细胞。最后将细胞置于冰上，直至移植。在此操作中，通过腹腔注射每千克80毫克的氯胺酮和每千克16毫克的赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。等待5分钟后，待小鼠完全入睡，剃除其头部毛发以进行无菌操作。随后将小鼠置于立体定位仪中，并用酒精对皮肤进行消毒。随后，将药膏涂抹于其眼睛表面，以防止脱水。沿头皮正中线做切口，暴露颅骨，以便定位海马体。使用牙科钻头在颅骨上距离后方2毫米、侧方2毫米处钻孔。此时，轻轻涡旋震荡细胞悬液，然后用注射器吸取细胞悬液。随后将带针头的注射器插入硬膜下 2.5 毫米深度，静置 1 分钟以使压力平衡。1 分钟后，将针头回撤至硬膜下 2 毫米处。然后使用自动显微注射泵以每分钟0.70微升的速度注入3微升细胞悬液。注射完成后，额外等待5分钟，以防止注入的细胞悬液回流。接下来，缓慢撤出注射针。随后，对皮肤切口边缘进行消毒，然后缝合皮肤。皮下注射 300 µL 0.9% 氯化钠溶液，以防止脱水。最后，将小鼠置于加热灯下，使其从麻醉中恢复，以便进行生物发光成像。使用3%异氟烷、氟和氧气的混合物对小鼠进行麻醉。然后将小鼠置于光子成像仪中。通过将异氟烷浓度调整至1.5%来降低麻醉水平。接着，以每公斤体重150毫克的剂量静脉注射D-荧光素。使用 photo vision 软件采集图像五分钟。随后，使用 M three vision 软件进行图像处理，并利用固定的感兴趣区域对观察到的信号进行定量分析。进行磁共振成像时，用含3%异氟烷的氧气与一氧化氮混合气体对小鼠进行麻醉。然后将小鼠放入水平 9.4 特斯拉磁共振系统的固定器中。通过将异氟烷调节至 1% 来降低麻醉水平。接着，为小鼠眼睛涂抹眼膏以防止脱水。之后，使用直肠探针监测小鼠体温。然后将传感器置于小鼠腹部下方，以监测呼吸频率。将呼吸频率维持在每分钟110 ± 10次，并将体温保持在37 ± 0.5°C的狭窄范围内。随后将表面射频线圈放置于小鼠头部上方。将小鼠置于磁体中心位置。随后打开 ParaVision 5.1，根据随附的手稿设置序列参数。然后采集一组10张冠状面T2加权自旋回波图像，以获取特定的解剖学信息。采用NT双星加权梯度回波成像，以70平方微米的平面内分辨率研究干细胞迁移。在此步骤中，处死小鼠并取出脑组织。将脑组织在室温下用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定两小时。两小时后，将脑组织置于4°C下不同浓度梯度的蔗糖溶液中进行脱水。次日，使用液氮冷冻脑组织，并将组织储存在-80°C，直至准备切片。 使用冷冻切片机将脑组织切成10微米厚的切片。随后，在荧光显微镜下观察未染色的冷冻切片，筛选来自G-B-M-P-I-O颗粒的蓝色荧光以及来自表达EGFP细胞的绿色荧光。然后，继续观察未染色的冷冻切片，检测炎性细胞产生的绿色至红色背景荧光。所述的冰蓝色MPIO标记方法可实现对BMSC、荧光素酶EGFP细胞的高效标记，可通过荧光显微镜轻松验证。接下来，在将G-B-M-P-I-O标记的BMSC、荧光素酶EGFP细胞移植至小鼠中枢神经系统后，可通过基于荧光素酶活性的活体生物发光成像来监测细胞移植物的存活情况。此外，还可通过基于冰蓝色MPIO铁含量的活体磁共振成像来监测移植细胞的精确定位。最后，组织学分析验证了生物发光成像和磁共振成像所获得的结果。在细胞发育后，通过随时间推移稳定的EGFP表达证实了细胞的稳定存活。该技术为分子成像领域的研究人员探索神经退行性疾病不同动物模型中干细胞移植后的细胞与分子事件奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何开展分子成像，结合生物发光与磁共振成像技术，并通过死后组织病理学评估对活体结果进行充分验证。

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神经科学

在中央小鼠中枢神经系统的干细胞移植的多模态成像

来源：Daynac, M., et. al．从小鼠成年脑室下区分离神经干细胞与前体细胞及其细胞周期动态的活体成像．J. Vis. Exp.

小鼠神经干细胞分裂的共聚焦显微镜延时成像

双光子活体成像可用于研究骨髓嵌合动物在脊髓背柱受到创伤性脊髓 crush...

活体成像观察小鼠背柱 crush 损伤后轴突与小胶质细胞及巨噬细胞的相互作用

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

自体和同种异体骨移植是治疗严重颅面骨缺损的公认方法。然而，移植物成分对血管新生、细胞分化与骨形成之间相互作用的影响尚不明确。本文介绍一种多模态成像方案，旨在阐明移植物邻近区域血管生成与成骨作用之间的相互依赖关系。...

利用计算机断层扫描和光学成像技术研究颅骨自体移植与异体移植中成骨-血管生成偶联以评估骨整合

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。...

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

本文报道了一种通过小鼠颈总动脉或大鼠颈外动脉在缺血性脑卒中后递送神经干细胞的方法，该方法适用于注射溶液或悬浮液。注射后的细胞广泛分布于脑实质中，并可在递送后长达30天内被检测到。...

向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

本文介绍了一种用于在清醒且头部固定的活体小鼠中对脑细胞进行长期成像的慢性颅窗植入实验方案。...

植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。...

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本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

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用于转化癌症研究中活体显微成像与磁共振成像联合应用的背侧皮肤折叠窗室肿瘤小鼠模型

学习使用生物发光成像和磁共振成像对小鼠中枢神经系统中的干细胞移植进行多模态成像，并通过组织学分析验证结果。该方法可追踪细胞存活和定位，为神经退行性疾病研究提供重要工具。

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

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