Name: 一个小鼠模型，通过神经肌肉电刺激肌肉训练 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学习使用神经肌肉电刺激技术在小鼠模型中进行肌肉训练的方法。该方案通过改良表面电极刺激前侧肌群，可研究肌肉生理学与血管生成机制，为临床康复应用提供实验依据。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）物理治疗师和职业治疗师培训资助项目——康复研究综合培训机会（K12 HD055931）、物理治疗基金会以及匹兹堡克劳德·D·皮珀老年美国人独立中心（P30 AG024827）资助。

1. 电极制备
<ul>
	<li>裁剪一块 1 cm × 1 cm 的矢量电路板。</li>
	<li>使用虎钳固定两根线绕针，使针脚间距约为 3.5 mm，线绕针的分叉端应朝上。</li>
	<li>使用尖嘴钳在线绕针约一半长度处将其弯折成 90° 角。</li>
	<li>从导线连接点起约 7 cm 处剥除导线绝缘层，露出连接器的铜线部分。</li>
	<li>将一根铜线焊接到其中一根线绕针的分叉端，再对另一根线绕针重复相同的焊接步骤。</li>
	<li>将热缩管拉至铜线与金针的焊接连接处，以实现绝缘和加固；使用烙铁头加热热缩管使其收缩。</li>
	<li>将未焊接的线绕针尖端插入面包板电路板的相邻插孔中。</li>
	<li>确保线绕针彼此平行，并穿过面包板，使针尖从板上穿出的距离一致。</li>
	<li>将焊接端的针脚嵌入透明环氧树脂中，静置约 10 分钟，或直至完全固化。</li>
	<li>重复涂抹环氧树脂，直至针脚和矢量电路板完全被包裹，以增强导线的结构强度并提供应力释放。</li>
	<li>使用金属锉刀打磨环氧树脂，以露出金针的尖端。</li>
	<li>使用万用表检测，确保两条导线之间无电气短路，并确认导线通路正常。</li>
	<li>将 NMES 设备的电极导线连接至双孔母头线缆连接器（Pomona 跳线）。</li>
</ul>
2. 动物准备
<ul>
	<li>使用2%异氟烷（Abbott Laboratories, North Chicago, IL）与100% O2气体通过吸入法对动物进行麻醉。在整个NMES过程中，动物应保持麻醉状态。</li>
	<li>开始NMES方案前，应进行足趾夹捏测试，以确认动物已完全麻醉。</li>
	<li>应定期检查动物对刺激的反应，以确保麻醉深度足够。必要时应调整麻醉剂量。应定期评估除被刺激肢体外的其他部位是否出现运动、呼吸深度的变化以及黏膜颜色，以监测麻醉深度。</li>
	<li>将动物置于侧卧位。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。</li>
	<li>剃除待治疗的后肢区域毛发，并用酒精擦拭。</li>
	<li>用3%漂白剂擦拭电极，然后用水冲洗。</li>
	<li>在电极放置部位涂抹一层导电凝胶。在整个NMES方案过程中，应根据需要重新涂抹，以确保电极与皮肤之间的电流传导。</li>
	<li>应使用加热灯或循环水毯以维持正常的机体核心温度范围。</li>
	<li>注意：所有实验程序均已通过匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的审查和批准，并在获得PHS认证及AAALAC International认证的项目和设施中进行。</li>
</ul>
3. 刺激
<ul>
	<li>电极放置：
	<ul>
		<li>为了刺激包括胫骨前肌和趾长伸肌在内的前肌室肌肉，应将表面电极直接放置在动物的腓深神经上，该神经是腓总神经的一个远端分支，位于腓骨头前方稍偏位置。</li>
		<li>当刺激引发踝关节完全背屈及足趾完全伸展时，表明电极放置位置正确。相反，若仅有背屈而无足趾伸展，则提示仅胫骨前肌被激活。根据实验设计的不同，这种靶向性的收缩反应可能是理想的。</li>
		<li>肌肉收缩分为两个刺激阶段：第一个阶段为自由运动的向心收缩期，持续约0.5秒。在此阶段初期，足爪从静息位置移动至最大背屈和足趾完全伸展状态。第二个阶段为在最大背屈和足趾伸展位置维持的等长收缩。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>刺激参数：
	<ul>
		<li>本神经肌肉电刺激（NMES）模型采用300 PV Empi多功能电疗仪，该设备提供两个常规NMES通道（见表格）。在本模型中仅使用一个通道。</li>
		<li>所用参数包括对称波形、脉冲持续时间为150 μs、频率为50 Hz。刺激时间设定为5秒，包含0.5秒的上升斜坡和0.5秒的下降斜坡，以使肌肉更渐进地适应刺激。在当前方案中，两次收缩之间的间歇时间为10秒，但可根据所需效果进行调整。缩短间歇时间将更快引发肌肉疲劳。这些刺激参数基于临床方案设计，旨在通过神经肌肉电刺激增强肌肉力量，同时避免引起显著的骨骼肌损伤1, 15, 16。</li>
		<li>小鼠完成两组各10次收缩，组间休息5分钟。</li>
		<li>对于成年动物，NMES刺激强度通常从9 mA开始。根据我们的经验，此强度接近不会在刺激后立即引起明显步态障碍的最大起始强度。在后续NMES疗程中，每当动物能够完成20次完整背屈动作时，刺激强度即增加1 mA。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>完成刺激方案并从麻醉中恢复后，动物通常表现出正常的步态与姿势。在整个NMES干预过程中，步态应始终保持无异常。</li>
</ul>
4. 典型结果
本文所述的NMES方案已在多种小鼠品系中实施，包括：野生型（B6/10）、B6.SCID和mdx/SCID小鼠。展示了在3至5月龄的mdx/SCID小鼠中，连续4周（共20次）进行NMES的代表性结果。
动物在麻醉状态下通过颈椎脱位实施人道安乐死。取胫前肌组织后立即置于液氮预冷的2-甲基丁烷中速冻，并于-80 °C保存。制备连续横切面冰冻切片（10 μm），贴附于载玻片上。采用标准统计软件包（SPSS，v19.0软件）进行统计分析。首先采用Levene检验评估方差齐性，随后采用独立样本t检验分析NMES组与对照组之间的差异。
采用苏木精-伊红（H&amp;E）染色法，以检测NMES方案是否会导致肌营养不良肌肉的损伤加重。选取一张切片，使用光学显微镜（Nikon Eclipse E800；Nikon，日本）拍摄图像。利用美国国立卫生研究院（NIH）开发的图像分析软件Image J，人工计数肌纤维总数以及细胞核位于中央的肌纤维数量。与对照组相比，接受NMES处理的动物其再生指数（中央核肌纤维数/总肌纤维数）未见显著升高（p=0.802；图1）。这表明，NMES的应用并未加剧肌营养不良动物中所观察到的变性-再生级联反应，因此不太可能引起肌肉损伤的加重。
采用CD31免疫荧光染色以研究为期4周的神经肌肉电刺激（NMES）方案对肌肉血管化的影响。简言之，肌肉切片经4%甲醛固定后，使用5%马血清（HS）进行封闭。切片与大鼠抗小鼠一抗（1:300稀释于5% HS中）孵育，随后用555标记的山羊抗大鼠二抗（1:300稀释于5% HS中）处理。为定量CD31阳性细胞总数，选取一个切片，采用荧光显微镜（Nikon Eclipse E800；日本）拍照。毛细血管总数通过Northern Eclipse软件（Empix Imaging Inc.）手动计数。接受NMES处理的动物组中CD31阳性细胞数量较对照组显著增加（p&lt;0.01；图2），表明所述NMES方案可促进骨骼肌血管生成。
在体收缩功能测试：在完成神经肌肉电刺激（NMES）方案4周后，使用在体测试装置（型号809B，Aurora Scientific Inc，加拿大）、刺激器（型号701C，Aurora Scientific Inc，加拿大）和力传感器（Aurora Scientific Inc，加拿大）对前肌室肌肉进行收缩功能测试。简要而言，通过膝关节外侧的小切口分离麻醉动物的腓神经。随后将小鼠仰卧固定于平台，待测足部置于足板上。测试所用后肢通过胶带在膝部和足部进行固定。通过插入皮下的钩状电极对肌肉进行刺激。以150 Hz频率持续350 ms诱导肌肉强直性收缩，以评估为期4周的NMES方案是否可改善肌肉力量。实验结果按湿肌重量进行标准化处理。与对照组相比，接受NMES处理的动物强直性收缩力提高约30%（p=0.005）（图3），表明所述方案可改善mdx/SCID动物骨骼肌的收缩力量。
<img alt="显示肌纤维排列的组织学切片，显微镜图像展示结构差异。" src="/files/ftp_upload/3914/3914fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 营养不良（mdx）/免疫缺陷小鼠（4-5个月）骨骼肌的苏木精与伊红染色结果（10倍放大）：A）未经处理的对照组，B）经4周神经肌肉电刺激（NMES）后的样本。
<img alt="细胞培养物的荧光显微镜图像，显示比较分析中的蛋白质表达水平。" src="/files/ftp_upload/3914/3914fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 营养不良（mdx）/免疫缺陷小鼠（4-5个月）骨骼肌中作为骨骼肌血管化标志物的CD31免疫荧光（红色）（20倍放大）A）未处理对照组，B）NMES治疗4周后。
<img alt="扭矩-时间曲线；对照组与NMES组；比较肌肉反应；曲线分析；生理学研究。" src="/files/ftp_upload/3914/3914fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 对照组与接受为期4周NMES治疗动物的前部肌群收缩功能测试。mNm = 毫牛顿·米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3914/3914fig3large.jpg">点击此处查看高清大图</a>。

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</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

这些结果表明，我们建立的小鼠NMES模型可促进骨骼肌血管生成（图2）和肌肉增强（图3），但不会引起骨骼肌损伤（图1）。
需要注意的是，此处所述的刺激参数旨在对前部肌群产生肌肉超负荷效应。与临床情况类似，可根据需要调整电极放置位置以刺激其他肌群，但不同肌群对神经肌肉电刺激（NMES）的反应可能因其肌纤维类型组成不同而有所差异。根据研究设计，可调整NMES的持续时间、治疗总次数以及重复总次数。
与任何实验方案一样，本方法也存在一些需要注意的局限性。在本研究中，刺激作用于腓深神经。然而，在临床实践中，刺激通常施加于运动单元。在动物模型中，刺激神经需要较低的强度即可引发完全的肌肉收缩。本模型的另一个局限性在于，由于动物处于麻醉状态，我们无法获得应用神经肌肉电刺激（NMES）过程中关于舒适度的信息。因此，难以评估临床人群中类似强度刺激的耐受性。然而，我们的组织学结果表明，所描述的NMES模型不会引起肌肉损伤。
开发能够模拟临床常用治疗模式的动物模型，为我们提供了有用的实验工具，有助于更深入地理解细胞和分子对治疗干预的反应。此外，这些模型还可用于开展临床前研究，以优化现有的康复方案并开发新的适应证。

<table><tbody><tr><td>带分叉焊片端子的向量线绕接柱</td><td>Newark Inc</td><td>T68</td><td></td></tr><tr><td>向量电路板</td><td>Newark Inc</td><td>3662-2</td><td></td></tr><tr><td>Pomona 跳线</td><td>Newark Inc</td><td>P-36-0</td><td></td></tr><tr><td>5 分钟环氧树脂</td><td>VO Baker Co.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra 360 电极凝胶</td><td>Milliken Medical</td><td>MR41217</td><td></td></tr><tr><td>便携式神经肌肉刺激装置</td><td>EMPI</td><td>300pv</td><td></td></tr></tbody></table>

一种通过神经肌肉电刺激实现肌肉训练的小鼠模型

A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

神经肌肉电刺激（NMES）是一种常见的临床治疗手段，广泛用于恢复1、维持2或增强3-5肌肉功能能力。经皮表面刺激骨骼肌时，电流在阴极和阳极之间流动，从而引发运动单位及其周围肌纤维的兴奋。
神经肌肉电刺激（NMES）是一种具有吸引力的研究骨骼肌适应性反应的方法，原因如下。首先，它提供了一种可重复的实验模型，其中多种生理适应已被充分记录，例如肌纤维肥大和肌肉力量增强6、血管生成7-9、生长因子分泌9-11以及肌肉前体细胞的活化12。这些生理反应可通过调节不同的刺激参数进行精确控制（有关Cochrane综述，参见13）。此外，NMES以非选择性、空间固定且时间同步的方式募集运动单位14，从而能够对所有类型的肌纤维均产生治疗效应。尽管在某些临床人群中存在明确的禁忌证，例如外周静脉疾病或恶性肿瘤，但NMES总体上安全且可行，即使对于病情严重和/或卧床患者，以及难以进行高强度运动的人群亦适用。
本文演示了如何改装市售电极，并使用小鼠模型进行神经肌肉电刺激（NMES）的操作流程。该动物模型的优势在于可使用临床现有的设备，并能即时反馈电极放置位置，以诱发目标肌肉的收缩效应。在本研究中，我们将详细描述对小鼠后肢前群肌肉进行刺激的具体操作步骤。

本文描述了一种针对小鼠前 compartment 肌肉的神经肌肉电刺激（NMES）的啮齿类动物模型，该方法是一种安全且经济的临床手段。该模型的优势在于可对一种 readily available 的临床设备进行改造，以实现对小鼠特定目标肌肉收缩的诱导。

神经肌肉电刺激（NMES）是一种常见的临床治疗手段，广泛用于恢复1、维持2或增强3-5肌肉功能……

本实验的总体目标是通过神经肌肉电刺激，展示一种小鼠肌肉训练的模型。首先，将临床上用于人体的表面电极进行改造，使其适用于小鼠；随后，对动物进行麻醉并摆好刺激所需体位。然后，将表面电极直接放置于腓骨头远端的腓深神经上方。最后一步是实施前部卷曲肌的刺激方案。最终，组织学分析显示骨骼肌血管化程度增加，原位收缩功能测试显示最大力量增强。你好，我叫Fabrizio。我是匹兹堡大学物理医学与康复系的助理教授，同时也是细胞康复实验室的主任。今天，我们将向您演示一种利用神经肌肉电刺激进行肌肉训练的镜像模型。在本次演示的第一部分中，我们将向您展示如何将临床上可用的表面电极改装成可用于刺激小鼠骨骼肌的电极。在第二部分中，我们将演示如何在实验中实施这种神经肌肉电刺激方案，以及如何开发出高度模拟临床状况的动物模型。使用临床相关模型非常重要，因为它可以帮助我们回答与骨骼肌生理学相关的问题，例如肌肉激活如何触发机械传导反应，而我们可以在分子、细胞和组织水平上对此进行研究。大家好，我叫Ricardo Ferrari。我是匹兹堡大学物理治疗系的一名博士生。在临床中，邻近肌肉的电刺激是一种常用的方法，用于增强肌肉力量并促进肌肉修复。然而，关于应采用的最佳参数，仍有许多问题尚未明确。该动物模型可能有助于制定用于临床环境的特定电刺激方案。准备电极时，首先将两根六毫米长的金针弯成90度角。接着，通过去除外部绝缘层，露出约七厘米长的两根铜线。然后将连接器上的导线焊接到两个相距约 3.5 毫米的金针上。接着，在铜导线与金针的连接处套上热缩管，以实现绝缘和稳定；加热热缩管，确保两根金针相互平行，并将其穿过电路板，使针尖对齐。接下来，分多次在针脚上涂抹透明环氧树脂，每次涂抹后均需待环氧树脂完全干燥。最后，将环氧树脂打磨平整，以露出金针的针尖。接下来，使用电压表检查导线是否未发生电气短路。然后使用塑料管对雌性双向电线连接器的金属插针进行绝缘。接着，将NMES设备的电极导线连接到雌性双向电线连接器上。所有操作均经匹兹堡大学动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准，并在获得公共卫生服务（PHS）保证且通过国际实验动物评估和认可委员会（ALAC）国际认证的项目和设施中进行。通过吸入异氟烷对动物进行麻醉，且动物在整个神经肌肉电刺激（NMES）过程中应保持麻醉状态。应使用脚趾夹捏伸肌反射试验确认麻醉效果。然后将动物置于侧卧位。随后剃除后肢毛发，用酒精擦拭，再用3%次氯酸钠溶液擦拭电极。然后使用水，设置刺激参数，包括150微秒的脉冲持续时间和50 PP s的频率。接着将刺激时间设为5秒，其中包含0.5秒的上升斜坡和0.5秒的下降斜坡。这将使肌肉逐渐适应刺激，同时提高动物的舒适度。随后，将收缩间歇的关闭时间设置为10秒。该参数可根据所需效果进行调整，但缩短关闭时间将导致肌肉疲劳更快发生。接下来，用3%的漂白剂对电极进行消毒，然后用水冲洗，并在电极上涂抹导电凝胶，用于刺激前部肌群，包括胫骨前肌和趾长伸肌。将表面电极直接放置于动物外侧股骨髁远端附近的坐骨神经共同分支（common perineal nerve）上。当电刺激引发踝关节完全背屈及足趾完全伸展时，可确认电极位置正确。相反，若仅出现足背屈而无足趾伸展，则提示仅胫骨前肌被刺激。接下来，将神经肌肉电刺激（NMES）强度设为9毫安，完成两组收缩，每组共20次收缩，组间休息5分钟；在休息期间，对对侧肢体进行刺激。现在将动物放入恢复室。在3至5月龄的MDX肌萎缩小鼠中，经过四周的神经肌肉电刺激（NMES）后，通过苏木精-伊红骨骼肌染色显示，与未受刺激的对照组相比，中心核纤维数量未见增加。这表明NMES的应用并未引发肌肉的变性-再生级联反应。作为内皮细胞标记物的CD31免疫组织化学结果显示，与未接受刺激的对照组小鼠相比，经四周神经肌肉电刺激（NMES）后，受刺激肌肉出现了显著的血管生成。该图显示了接受NMES处理的肌肉相对于未处理对照肌肉的峰值强直收缩力增强。一旦掌握该技术，完成每只动物的实验操作约需15分钟。本方案中最困难的部分是找到电极的合适放置位置，以引发预期的肌肉反应。感谢您的观看。如果您有任何疑问，请随时与我们的实验室联系。

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一个小鼠模型，通过神经肌肉电刺激肌肉训练

程序性电刺激可用于评估心脏的传导特性，并通过不同的起搏方案诱导和终止心律失常。利用经静脉导管，在小鼠中实施程序性电刺激方案后，可获取心内电图记录，以识别致心律失常的基质。...

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我们提出了一种评估神经肌肉功能变化的实验方案。经皮电神经刺激是一种可诱发肌肉反应的非侵入性方法。通过分析这些反应的电生理学和机械特性，可对从大脑到肌肉的神经肌肉功能（包括脑-脊髓上、脊髓及外周水平）进行评估。...

采用经皮电神经刺激评估神经肌肉功能

本方案描述了利用慢性收缩活动运动模型，观察大鼠后肢骨骼肌在刺激诱导下的适应性变化。...

应用慢性刺激研究收缩活动诱导的大鼠骨骼肌表型适应

脊髓损伤是一种创伤性医学状况，可能导致慢性继发性代谢紊乱的风险升高。本文介绍了一种联合应用表面神经肌肉电刺激抗阻训练与功能性电刺激下肢骑行的方案，作为改善上述多种医学问题的策略。...

脊髓损伤后下肢电刺激训练范式

测量啮齿类动物骨骼肌的收缩功能是一种有用的工具，可用于追踪疾病进展以及评估治疗干预的效果。本文描述了一种非侵入性的、可在活体（in...

小鼠背屈肌功能的非侵入性评估

我们描述了一种可重复、自动化且无偏倚的成像系统，该系统利用人源工程化骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉接头功能。该系统能够随时间对神经肌肉连接的功能进行定量分析，并可检测由神经毒素及重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能下降。...

构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

本方案描述了一种称为剂量调整阻力训练（DART）的独特技术，该技术可应用于在小动物（如小鼠）中开展的精准康复研究。...

剂量调整型抗阻训练在降低肌肉损伤风险小鼠中的应用

斑马鱼在细胞生物学和生理学研究中具有显著的光学透明优势。本文描述了在个体动物中测量细胞生长的可靠方法，这些方法能够提供新的见解，揭示骨骼肌及邻近组织的生长如何与整体身体生长相协调。...

对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

本研究展示了一种改进的单纤维肌电图（SFEMG）方案，用于在啮齿类动物模型中实现神经肌肉接头（NMJ）传递功能的体内测量。文中详细描述了SFEMG技术的逐步操作流程，以实现对大鼠腓肠肌中神经肌肉接头传递变异性和传递失败的定量评估。...

刺激性单纤维肌电图（SFEMG）用于评估啮齿类动物模型中神经肌肉接头传递功能

学习使用神经肌肉电刺激技术在小鼠模型中进行肌肉训练的方法。该方案通过改良表面电极刺激前侧肌群，可研究肌肉生理学与血管生成机制，为临床康复应用提供实验依据。

一种通过神经肌肉电刺激实现肌肉训练的小鼠模型

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