Name: 大鼠肝细胞的分离和小学文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-29T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习大鼠肝细胞分离的原位灌注技术，通过胶原酶灌注和密度梯度纯化获得高活力细胞。该方法每次可制备多达一亿个活力达88%-96%的肝细胞，适用于生化与代谢研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者谨此感谢 Josh Basford 先生和李晓敏博士提供的技术支持。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（DK70992 和 DK92779，授予 M.L.）的资助。

1. 准备
所有缓冲液均采用无菌技术新鲜配制，并使用康宁（Corning）0.22 μm 滤器过滤除菌。
<ol>
 <li>准备 灌注缓冲液 I 通过向不含钙的汉克平衡盐溶液（HBSS）中添加以下成分2+ 和 Mg2+，参见 表1): Mg2+ (MgCl₂)2将 EDTA 调至 0.5 mM，HEPES 调至 25 mM。</li>
 <li>准备 灌注缓冲液 II 通过向HBSS（含Ca）中添加以下成分2+ 和 Mg2+, 见 表1HEPES 至 25 mM。</li>
 <li>准备 灌注缓冲液II加胶原酶II：将胶原酶II（1000 U）溶于300 ml 灌注缓冲液 II 在灌注前将溶液置于水浴中保温。该溶液应在30分钟内使用，因为II型胶原酶的活性会随时间下降。</li>
 <li>配制William's完全培养基：在William's Medium E中加入以下成分，终浓度分别为：L-谷氨酰胺 2 mM、胎牛血清（FBS）5%、胰岛素 100 nM、地塞米松 100 nM、青霉素 100 IU/ml 和链霉素 100 mg/ml。</li>
 <li>这些缓冲液应在水浴中于37°C预热30分钟 42 °C，对应套管出口温度的最佳温度 37 °C.</li>
</ol>
2. 大鼠肝脏分离的灌注
<ol>
 <li>灌流系统由泵、可高压灭菌的硅胶管和水浴装置组成（参见 图1将蠕动灌注泵的流速预设为10 ml/min。</li>
 <li>用腹腔注射（ip）氯胺酮（87 mg/kg 体重）联合赛拉嗪（13 mg/kg 体重）麻醉一只成年大鼠（体重 300 g）。通过夹捏足趾反应监测麻醉深度。当大鼠对伤害性刺激无反应时，剃除腹部毛发，并用聚维酮碘和乙醇对腹部进行消毒。沿正中线切口进入腹腔。</li>
 <li>通过将腹腔内的内脏小心地向右移出腹腔外，暴露肝门静脉，并将一根18号套管针插入肝门静脉（参见 图1).</li>
 <li>将灌注液管路连接至针头，并启动输注 原位 以低流速（10 ml/min）使用预热（37 °C) 灌注缓冲液 I.</li>
 <li>如果操作得当，肝脏应立即开始变白。一旦确认插管成功，于下腔静脉（IVC）处剪开切口以允许流出图1）。可通过无菌棉签对下腔静脉施加轻柔压力，进一步检验插管是否成功；此时肝脏的所有叶应迅速开始肿胀。</li>
 <li>将流速提高至 25 ml/min。肝脏颜色应变为苍白。</li>
 <li>切换灌注液至 灌注缓冲液 II 加胶原酶 II 持续流动，中间不中断，再持续6分钟。</li>
 <li>每隔一段时间（消化过程中5-10次），用棉签对下腔静脉施加压力，每次持续5秒。肝脏将随之肿胀，从而促进肝细胞的解离，进而缩短总消化时间，并提高最终得率。</li>
 <li>胶原酶灌注后，肝脏应开始呈现松软状。将肝脏游离并取出，置于含有20 ml William's完全培养基的预冷无菌烧杯中，然后转移至组织细胞培养超净台。</li>
</ol>
3. 肝细胞分离
<ol>
 <li>在细胞培养罩内，使用细胞刮将细胞轻轻分散到无菌培养皿中的 William's 完全培养基中。</li>
 <li>将细胞悬液通过孔径为 100 μm 的细胞筛过滤至 50 ml 尖底离心管中，以去除结缔组织和未消化的组织碎片。</li>
 <li>将细胞悬浮于 40 ml William's 完全培养基中，在 4 °C 条件下以 50 × g 离心 3 分钟。</li>
 <li>吸除上清液，用 40 ml 冷的 William's 完全培养基轻柔重悬细胞以洗涤细胞，重复离心步骤。</li>
 <li>吸除上清液，用 25 ml William's 完全培养基轻柔重悬细胞，向管中加入 25 ml PBS 配制的 90% Percoll 溶液，并轻轻混匀。</li>
 <li>在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟，吸取梯度上层的死细胞，因为活细胞会保留在 Percoll 梯度的底部。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于 30 ml 温热的 William's 完全培养基中，再次离心后，将细胞沉淀重悬于 20 ml 温热的 William's 完全培养基中。</li>
 <li>使用血细胞计数板对细胞悬液中的细胞进行计数，并通过台盼蓝染色法测定细胞活力。</li>
</ol>
4. 肝细胞培养
<ol>
 <li>用预热的William's完全培养基将细胞稀释至所需浓度，例如 2.5 × 105 个细胞/ml。按所需体积将细胞接种于细胞培养板中，例如 5 × 105 个细胞 / 2 ml / 孔，6 孔板；或 2.5 × 105 个细胞 / 1.5 ml / 孔，12 孔板。肝细胞培养可使用未包被的培养板。</li>
 <li>在细胞活力 > 85% 的典型制备条件下，细胞密度应达到约 60–70% 的融合度，这可使细胞间保持接触，同时为肝细胞充分伸展至完整细胞大小提供足够空间，最终达到 90–95% 的融合度。</li>
 <li>为形成均匀的肝细胞单层（即尽量减少细胞在孔中央区域聚集的趋势，该现象可能与细胞培养箱内的气流有关），在将培养板放入培养箱前，先将其置于细胞培养超净台内静置 30 分钟。</li>
 <li>将细胞置于 37 °C、含 95% 空气和 5% CO2 的湿润环境中培养。培养 4 小时后，可继续使用含血清培养基，或更换为无血清培养基，例如 HepatoZYME-SFM（见表 1）。使用无血清培养基有助于维持细胞形态，且不会因血清中的激素成分产生不良影响。</li>
 <li>实验前应让细胞恢复并培养至少过夜。建议在 24 小时内进行实验，以利于维持关键酶（如 P450 酶）的功能。</li>
 <li>根据需要，每隔 2 天更换一次生长培养基。</li>
</ol>
5. 代表性结果
所述条件通常可从一只大鼠肝脏的单次制备中获得约 1.0 × 108 个细胞。通过台盼蓝排斥法测定的肝细胞活力 consistently 保持在 88 ~ 96% 范围内。
如图2所示，肝细胞在接种4小时后开始聚集并形成细胞簇。大多数分离的细胞展平并以典型的单层方式生长。24小时后，细胞边界清晰，细胞表面较为光滑，并可见脂滴。细胞含有1至3个核仁，呈圆形，位于细胞中央，且细胞间核的大小一致（图2）。
<img alt="肝脏灌注过程示意图，显示灌注泵、缓冲液和胶原酶溶液装置。" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 肝脏灌注示意图。将18号套管针插入肝脏门静脉，然后将灌注管路连接至针头。确认插管成功后，在下腔静脉（IVC）处剪开切口以允许流出。
<img alt="4小时和24小时的细胞生长比较；细胞生物学实验中的显微镜图像；时间推移研究。" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 培养肝细胞随时间的形态变化（4小时至24小时），放大倍数×200。培养24小时后，细胞呈典型的单层铺展生长，细胞间的连接呈线性。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>试剂名称</td>
 <td>公司</td>
 <td>目录号</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14174</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS（含 Ca2+ 和 Mg2+）</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14025</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Williams's Medium E</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12551-032</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>胶原酶 II</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004176</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>细胞滤网（100 μm）</td>
 <td>BD</td>
 <td>352360</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HepatoZYME-SFM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17705</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Percoll</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P4937</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>套管针（18 号）</td>
 <td>BD</td>
 <td>381705</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+agonists+induce+constitutive+androstane+receptor+%28CAR%29+and+cytochrome+P450+2B+in+rat+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes.</a> Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+in+primary+culture%3A+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar. J. 6, 169(2007).</li>
<li>Bu, S. Y., Mashek, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+long-chain+acyl-CoA+synthetase+5+mediates+fatty+acid+channeling+between+anabolic+and+catabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways.</a> J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).</li>
<li>Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+rat+liver+perfusion+for+optimal+harvest+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes.</a> J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).</li>
<li>Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+lectin+binding+to+adult+rat+hepatocyte+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces.</a> In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).</li>
<li>Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+II.+Primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. II. Primary culture.</a> In Vitro. 17, 926-934 (1981).</li>
<li>Hay, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operator-induced+contamination+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Stand%22%5BJournal%5D)">Operator-induced contamination in cell culture systems.</a> Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

原代肝细胞培养是一种广泛用于研究肝脏生理学和病理学各个方面的体外模型。例如，原代培养可用于评估药物代谢酶（包括细胞色素P450）的表达与功能、药物代谢、药物相互作用以及细胞毒性和基因毒性的机制3-7。本实验方案参考了Aiken et al.8 及其他研究者2,9,10报道的方法，并进行了修改。该方法可稳定获得每批次高达1.0 × 108个细胞的肝细胞，细胞活力维持在88 ~ 96%之间。以下是其他关键步骤：
<ol>
 <li>与任何描述细胞培养的实验方案一样，最关键的环节是采用严格的无菌技术，避免细菌或真菌病原体的污染。 11.</li>
 <li>灌注前应小心操作，避免穿破门静脉后壁。</li>
 <li>桥粒，也称为黏着斑，是一种专司细胞间黏附的细胞结构。桥粒的完整性依赖于钙离子，可被EDTA及无钙培养基破坏。胶原酶可使桥粒解离，从而实现肝细胞的分离。因此，灌注过程需使用Ca2+ 更换培养基并随后加入 Ca2+ 含钙的富集培...

大鼠肝细胞的分离与原代培养

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

原代肝细胞培养是一种重要的工具，已广泛应用于肝脏功能、疾病、病理生理学、药理学及其他相关领域的基础研究。基于两步胶原酶灌注法分离完整肝细胞的方法最早由Berry和Friend于1969年提出1，此后经历了多次改进。最常用的技术由Seglen于1976年描述2。该方法的基本步骤是：通过门静脉对麻醉后的成年大鼠进行非循环式胶原酶灌注，从而解离肝细胞。分离的细胞随后经孔径为100 μm的尼龙滤网过滤，并接种于培养板上。培养4小时后，更换为含血清或无血清培养基（例如HepatoZYME-SFM），继续培养一段时间。这些操作涉及手术及无菌培养步骤，采用视频方式展示比文字描述更为直观。本文通过视频和书面实验方案详细记录了这些操作步骤，可稳定地大量获得有活性的肝细胞。

原代肝细胞为在生理相关的实验体系中评估生化、分子及代谢功能提供了有价值的工具。本文描述了一种可靠的大鼠原位肝脏灌注方案，该方法可稳定地从每次制备中获得高达 1.0 × 108 个细胞的肝细胞，细胞活力维持在 88 ~ 96% 之间。

原代肝细胞培养是一种重要的工具，已广泛应用于肝脏功能、疾病、病理生理学、药理学等基础研究领域……

本实验的总体目标是展示一种可靠的方案，以大量制备具有活性的肝细胞。该方案首先通过大鼠门静脉灌注胶原酶溶液，随后利用尼龙筛网过滤器分离和纯化解离的细胞，并使用Percoll溶液将死细胞与活细胞分离。最后一步是将肝细胞在培养箱中进行培养。最终，该方案每次制备可获得多达一亿个细胞，细胞活力可达90%。本方法的可视化演示至关重要，因为该操作涉及手术及无菌步骤，通过视频展示比文字描述更易于理解。本视频中演示该操作的技术人员来自我的实验室。所有必需的灌注液、缓冲液及Williams完全培养基均需在使用前一天采用无菌技术预先配制。缓冲液应在42°C水浴中预热30分钟，以达到灌注导管出口处37°C的最佳温度。灌注系统由可高压灭菌的泵、硅胶弹性管路和水浴组成，并将蠕动灌注泵的流速预设为10毫升每分钟。接着，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉成年大鼠。当大鼠对疼痛刺激（如夹捏）不再产生反应时，剃除腹部毛发，并使用聚维酮碘和乙醇清洁手术区域。沿腹中线做切口进入，暴露肝门静脉。小心地将内脏移至腹腔外右侧，将18号套管针插入肝门静脉。将PERFUSE八通管路连接至针头，并以预热的灌注缓冲液一在C2处以低流速开始灌注。若操作得当，肝脏应立即开始变白。确认成功插管后，切开下腔静脉以允许灌流。另一个判断插管成功的测试方法是轻压下腔静脉，用棉签触压时，肝脏的所有叶应迅速开始肿胀。接下来，将缓冲液流速增加至25毫升每分钟。肝脏颜色应逐渐变浅。当肝脏变为浅色后，将灌注液更换为含胶原酶II的缓冲液II，进行6分钟的消化；在消化过程中，每隔5至10次用棉签对下腔静脉施加压力，持续5秒。肝脏会肿胀，从而促进肝细胞的解离，进而缩短总消化时间并提高最终得率。胶原酶灌注后，肝脏应开始呈现松软状态。游离肝脏并取出，将其置于预冷的无菌烧杯中，烧杯内含40毫升培养基，随后转移至细胞培养超净台进行细胞分离操作。将肝脏转移至含有20毫升威廉姆斯完全培养基的培养皿中，使用细胞刮棒轻轻分散肝组织以去除结缔组织及未消化的组织碎片。将细胞悬液通过孔径为100微米的细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。随后，将细胞重悬于40毫升培养基中，在4摄氏度条件下以50 × g离心3分钟。吸弃上清液，轻柔重悬细胞。用40毫升冷培养基洗涤细胞，离心后再次吸弃上清液，轻柔重悬细胞。用25毫升培养基将细胞沉淀，从密度梯度液顶部吸除死细胞，活细胞则保留在底部。将活细胞沉淀重悬于30毫升预热的培养基中，重复离心。将沉淀重新悬浮于20毫升培养基中。使用血细胞计数板对悬液中的细胞进行计数，并测定细胞活力。采用台盼蓝染色法，将肝细胞用预热的Williams完全培养基稀释至所需浓度，并按指定体积接种到未包被的培养板上。典型的制备结果应含有超过85%的活细胞，或接种后的细胞密度达到60%至70%的融合度。这可在保证细胞间接触的同时，为肝细胞生长留出足够的空间，使其充

isolation-and-primary-culture-of-rat-hepatic-cells

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

大鼠肝细胞的分离和小学文化

本文介绍了一种从大鼠肝细胞原代培养中获取巨噬细胞的新方法。该方法利用巨噬细胞在培养过程中的增殖特性，随后通过振荡培养瓶并利用巨噬细胞对塑料培养皿的特异性贴附能力进行纯化。该技术无需复杂设备和操作技能，即可高效地获得肝脏巨噬细胞。...

一种从成年肝细胞混合原代培养物中分离巨噬细胞的简单高效方法

一种从大鼠肝脏分离门静脉成纤维细胞的技术。肝脏经灌注并消化处理 原位 用胶原酶处理，随后 离体...

大鼠门静脉成纤维细胞的分离 原位 肝脏灌注

本文描述了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离人肝细胞。该方法也可应用于其他哺乳动物肝脏。所获得的肝细胞产量高、活性好，是肝脏再生、药代动力学和毒理学等科学研究领域的理想模型。...

通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

本文展示了一种从成年小鼠分离原代肝细胞的酶法，并描述了使用ELISA和实时PCR定量炎症反应的方法。...

小鼠原代肝细胞培养物中炎症反应的诱导

本文介绍了一种分离健康且具有功能的小鼠原代肝细胞的实验方案。同时提供了利用非放射性标记底物检测肝脏新生蛋白质合成的方法，以帮助理解肝脏在能量代谢稳态背景下蛋白质合成的相关机制。...

通过非放射性L-叠氮高丝氨酸标记法分离原代小鼠肝细胞用于新生蛋白质合成分析

本文介绍了一种利用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏中分离小鼠肝细胞的实验方案。同时描述了在三维胶原三明治结构中对肝细胞进行长期培养的方法，以及对细胞骨架成分进行免疫标记，以研究胆小管的形成及其对处理的响应。...

分离与三维胶原三明治培养原代小鼠肝细胞以研究细胞骨架在体外胆小管形成中的作用

原代肝细胞是研究肝脏反应和代谢的有力工具...

一种改进的小鼠原代肝细胞分离的省时高效方案

本方案详细介绍了使用特殊静脉导管、标准化的一次性无菌管路、结合实时监测的温度控制以及报警系统，进行两步胶原酶灌注，以提高分离的原代大鼠肝细胞的活力、得率和功能的一致性。...

通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

学习大鼠肝细胞分离的原位灌注技术，通过胶原酶灌注和密度梯度纯化获得高活力细胞。该方法每次可制备多达一亿个活力达88%-96%的肝细胞，适用于生化与代谢研究。

大鼠肝细胞的分离与原代培养

探索更多视频