Name: 慢分裂的细胞在人脑胶质瘤羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的分离与鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学习使用CFSE荧光染料和流式细胞术分离鉴定人胶质母细胞瘤中慢分裂细胞的方法。该技术通过神经球培养、单细胞解离和荧光强度分析，帮助研究人员识别不同增殖速率的肿瘤细胞亚群，为理解肿瘤异质性和开发靶向治疗策略提供重要工具。

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本研究工作得到了佛罗里达脑肿瘤研究中心、小普雷斯顿·A·威尔斯脑肿瘤治疗中心以及美国国立卫生研究院（1R21CA141020-01）的支持。

1. 制备胶质母细胞瘤单细胞悬液
<ol>
 <li>胶质瘤球培养采用神经球检测法（NSA），具体方法如前所述2,11,12。</li>
 <li>当胶质瘤球需要传代时，吸除含有瘤球的培养基，转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以800 rpm（110 g）离心5分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将瘤球沉淀重悬于1 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中，于37 °C水浴孵育3–5分钟。</li>
 <li>随后加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。</li>
 <li>轻轻吹打细胞悬液，确保细胞均匀分散并完全中和胰蛋白酶活性。</li>
 <li>再次以800 rpm离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml NeuroCult NSC基础培养基中。</li>
 <li>取10μl单细胞悬液与90μl台盼蓝混合，进行细胞计数。</li>
</ol>
2. 使用细胞示踪羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）绿色荧光染料染色
<ol>
 <li>每染色100万个细胞，需配制1 ml染色试剂：将1 μl的5 mM Cell Trace CFSE染料（Molecular Probes, Invitrogen）加入1 ml NeuroCult NSC基础培养基中，终浓度为5 μM。</li>
 <li>将含有细胞的染色试剂充分混匀至均一状态，并在室温下孵育10分钟。</li>
 <li>在孵育期间，预先准备好冰冻的NeuroCult NSC基础培养基作为淬灭溶液。</li>
 <li>为终止染色过程，向载有CFSE的细胞中加入约5–10倍体积的冰冻淬灭溶液。</li>
 <li>随后以800 rpm离心5分钟，并弃去上清液。</li>
 <li>此时，离心管底部应可见细胞沉淀，呈亮绿色，表明染色成功。</li>
 <li>通过将细胞沉淀重悬于1–2 ml新鲜NeuroCult NSC基础培养基中进行洗涤，800 rpm离心5分钟，弃去上清液；重复该步骤，共洗涤三次。</li>
 <li>第三次洗涤后，将细胞重悬于1 ml NeuroCult NSC基础培养基中，并进行细胞计数。</li>
 <li>将CFSE标记的细胞以适当密度（50,000个细胞/ml）接种至无菌组织培养瓶中，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。</li>
</ol>
3. CFSE 负载验证
<ol>
 <li>在NSA培养体系中培养的细胞可通过荧光显微镜观察以验证CFSE染色效果。在此阶段，所有细胞均呈现明亮的绿色（图1）。或者，也可将CFSE染色后的细胞悬液滴加至载玻片上，加盖盖玻片，随后在荧光显微镜下观察细胞形态。</li>
 <li>CFSE标记的成功与否还可通过流式细胞术进一步确认。每组取1-5 × 105个细胞即足以用于CFSE染色的验证。将CFSE负载的细胞与未负载的阴性对照细胞分别重悬于1 × PBS或NeuroCult NSC基础培养基中，总体积为500 μl，并分装至不同的FACS管中。</li>
 <li>根据流式细胞仪用户手册中的说明，调整仪器相关参数。CFSE的最大激发波长为492 nm，最大发射波长为517 nm。</li>
 <li>首先检测未负载的对照细胞，记录前向散射光与侧向散射光（FSC vs. SSC）及直方图数据，并对主要细胞群进行设门（图2A）。</li>
 <li>同样地，使用与对照细胞相同的参数分析CFSE负载的细胞（图2B）。</li>
</ol>
4. 使用荧光激活细胞分选（FACS）分离慢分裂（即CFSE保留）细胞群体
<ol>
 <li>分裂后，CFSE 荧光强度降低，hGBM 细胞形成胶质瘤球，其内部细胞表现出不同水平的绿色荧光强度（图3）。当胶质瘤球体达到平均直径约150-200 μm 直径达到一定大小时（根据细胞系的生长速率，通常在CFSE标记后约5至10天），移除含有细胞球的培养基，转移至适当大小的无菌组织培养管中，室温下以800 rpm离心5分钟。</li>
 <li>单细胞悬液按先前步骤制备，细胞重悬于PBS中进行细胞计数，以制备密度高达10的细胞悬液7 每毫升细胞数 </li>
 <li>在用适当体积的 PBS 重悬细胞后，加入碘化丙啶（Propidium Iodide, PI, Sigma, 500 μg/ml) 的添加浓度为 1 μl/ml 排除死细胞的细胞悬液，在流式细胞术分选/分析时使用。</li>
 <li>两个15 ml无菌组织培养管，每管含有1 ml完全NeuroCult NSC培养基，用于收集分选后的慢速分裂细胞（CFSE保留细胞）和快速分裂细胞（CFSE稀释细胞）。</li>
 <li>首先，将未加处理的细胞组的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。 </li>
 <li>细胞（事件）根据前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）进行绘图，调整这两个参数的电压，使大多数细胞包含在流式图中。</li>
 <li>为排除死细胞或受损细胞，根据SSC与PI反应性对细胞进行散点图分析，并圈选单个活细胞群体（PI阴性）。</li>
 <li>然后，根据前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）选择均一的细胞群体。</li>
 <li>将均一的单个活细胞群体根据细胞频率与CFSE强度的关系绘制在直方图上，CFSE强度采用对数刻度。调整CFSE激光强度，使阴性信号位于0至100之间。</li>
 <li>使用相同的参数和类似的设门策略，将CFSE标记的细胞通过流式细胞仪进行检测和分析（图 4C).</li>
 <li>随后，根据细胞保留CFSE（CFSE）的能力，鉴定出缓慢分裂的细胞群体和总体细胞群体（快速分裂的细胞）。高-顶部5% 和 CFSE低-底部85%，分别）。 </li>
 <li>将这些不同的细胞群体分别分选至含有1 ml完全NSC培养基的独立15 ml无菌组织培养管中。</li>
 <li>分选后的细胞在800 rpm下离心5分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将沉淀物重悬于适量培养基中（根据分离得到的细胞数量或沉淀物大小确定体积），并进行细胞计数。</li>
 <li>将不同分选群体的细胞以每毫升50,000个细胞的密度接种于适当的无菌组织培养瓶中，并置于 37 °C 在5% CO2加湿培养箱中培养5-10天，随后进行连续传代或用于下游实验。 </li>
</ol>
5. 代表性结果
CFSE标记后，所有细胞在显微镜下均呈现强烈的绿色荧光（图1）。这种绿色甚至肉眼可见（见视频）。通过流式细胞术分析这些细胞，与对照细胞相比也显示出强烈的绿色荧光（图2）。将CFSE标记的细胞接种至神经球培养体系中后，这些细胞增殖并在5至10天内形成直径为150–200 μm的胶质瘤球。随着细胞不断增殖，荧光染料在每次细胞分裂时均等地分配给子代细胞，导致每经历一次细胞分裂，荧光强度减半。胶质母细胞瘤在功能上具有异质性，包含以不同时间尺度增殖的细胞群体。本实验方案所述方法可根据细胞稀释或保留CFSE的能力，分别鉴定并分离出快速和缓慢分裂的细胞（图3，亦见视频）。
对由CFSE标记细胞和未标记细胞解离得到的胶质瘤球进行流式细胞术分析，显示出不同的CFSE保留特性（图4）。在神经球培养条件下，快速分裂的细胞（底部85%）或缓慢分裂的细胞（顶部5%——CFSEhigh）均表现出形成胶质瘤球的能力（图5）。
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig1.jpg" alt="CFSE 荧光显微镜图像；细胞增殖实验；绿色荧光；细胞染色。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 用CFSE染料标记后立即分离的肿瘤细胞。细胞呈现明亮的绿色，表明标记成功。原始放大倍数：10 ×。
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="流式细胞术示意图；细胞分析；CFSE 数据；图形比较；细胞群体分化。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用流式细胞术验证 CFSE 标记效果。A) 未标记细胞，B) CFSE 标记细胞，以及 C) 比较标记与未标记细胞中 CFSE 荧光强度。注意标记细胞与未标记细胞之间的荧光强度相差多个数量级。
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="细胞分裂过程，CFSE染色细胞，荧光显微镜图像" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 一个来自接种后第6天CFSE标记细胞的代表性胶质瘤球。部分细胞显示出非常明亮的CFSE染色。原始放大倍数：63 ×。
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg" alt="流式细胞术分析；图表显示细胞散射、CFSE荧光及细胞增殖动力学。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. CFSE标记后第6天快速与慢速分裂细胞分离的代表性流式细胞术图谱/直方图。A) FSC 与 SSC 显示全部细胞群体，B) SSC 与 PI 反应性以排除死亡或受损细胞，C) FSC 与 SSC 用于圈选均一的活细胞群体，D) 显示CFSE标记后第6天仍保留CFSE的细胞，其荧光强度高于阴性对照，表明CFSE阳性细胞的存在；直方图还显示CFSE荧光强度随时间逐渐减弱，E) 直方图展示用于识别CFSE保留细胞（前5%）和CFSE稀释细胞（后85%）的设门策略。
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="细胞分裂分析；细胞来源的球体显微图像；柱状图比较分裂速度。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 由A) 快速分裂细胞（CFSElow）和B) 缓慢分裂细胞（CFSEhigh）生成的代表性胶质瘤球。原始放大倍数：分别为 10x 和 20x。C) 在传代时从快速或缓慢分裂细胞来源的培养物中获得的代表性细胞计数。P&lt;0.05，t 检验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。

<ol><li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li>
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<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
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<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

越来越多的研究表明，在癌症中存在一类分裂缓慢的细胞亚群，这类细胞对肿瘤的形成和治疗耐药性具有重要作用2-8。因此，描述并标准化可用于研究这一特定细胞亚群的实验方法至关重要，或者更广泛地说，用于比较具有不同增殖速率的细胞亚群。利用CFSE根据细胞分裂速率来识别和分离细胞亚群，是进一步表征这些特定细胞组分的起点，有助于加深我们对肿瘤异质性的理解。在本实验方案中，我们以胶质母细胞瘤中慢分裂细胞群的识别与分离为例进行说明，但该方案同样适用于其他肿瘤细胞，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌和皮肤癌。对这些细胞群可进行后续分析，包括增殖潜能2、成瘤能力2、治疗敏感性以及（表观）遗传学特征的比较研究。该方法也可应用于非癌性疾病系统，例如体细胞干细胞/前体细胞的研究。
实验过程中的关键技术要点包括使用胰蛋白酶充分解离细胞，以及将细胞在染色缓冲液中充分重悬，以建立适当的细胞密度并确保染色均匀。应取少量新染色的细胞通过流式细胞术进行检测，以确认标记的均一性，表现为类似高斯分布的狭窄峰型（见图2B）。如果初始标记...

<table><tbody><tr><td>NeuroCult NSC 基础培养基（人源）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05750</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC 增殖添加剂（人源）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05753</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T80 培养瓶</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr></tbody></table>

利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（cfse）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

肿瘤异质性是支持肿瘤稳健性的基本特征，也是开发治疗策略面临的主要障碍1为克服肿瘤异质性问题，必须开发出能够对驱动特定疾病病理并代表临床相关靶点的肿瘤亚群进行表型、（表观）遗传及功能层面鉴定与表征的检测方法和工具。目前已有充分证据表明，肿瘤包含具有不同细胞分裂频率的独立亚群，且在多种癌症（包括脑癌、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌以及白血病）中，细胞增殖缓慢这一功能性特征与成瘤能力呈正相关。2-8荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）已被用于追踪细胞的分裂频率 体外 和 在体 在血液传播性肿瘤和胶质母细胞瘤等实体瘤中2,7,8细胞可渗透的非荧光CFSE前体药物可被细胞内酯酶转化为荧光化合物，该化合物通过其琥珀酰亚胺基团与细胞内胺基发生反应，共价结合于蛋白质，形成稳定的酰胺键，从而保留在细胞内。9荧光染料在细胞分裂时均等地分配到子细胞中，导致每次细胞分裂后荧光强度减半。这使得细胞周期频率可被追踪至八到十次分裂轮次。10采用CFSE保留能力法对脑肿瘤细胞进行分析，以鉴定和分离出具有较慢增殖周期的亚群（染料保留率最高的前5%细胞），该亚群被证实富含癌症干细胞活性。2. 
本方案描述了使用CFSE对细胞进行染色，并通过流式细胞术分离培养的人源胶质母细胞瘤（GBM）细胞中具有不同分裂速率的亚群的技术2。该技术已用于鉴定并分离出一类因能够保留CFSE标记而表现出缓慢循环特性的脑肿瘤细胞亚群。

本视频方案演示了如何应用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）根据细胞分裂频率来鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的不同细胞亚群。

利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

肿瘤异质性是支持肿瘤稳健性的基本特征，也是肿瘤治疗开发中的主要障碍……

本视频实验方案演示了如何利用羧基荧光素双乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定并分离人胶质母细胞瘤中分裂缓慢的细胞。首先采用神经球实验法培养胶质母细胞瘤肿瘤细胞，随后将形成的神经球解离为单细胞，并用CFSE进行染色。将CFSE标记的细胞再次接种。在神经球培养中，将形成的神经球解离为单个细胞，然后通过流式细胞仪进行检测。根据细胞分裂过程中荧光强度的变化，鉴定并分选出分裂缓慢和快速的细胞。频率异质性是癌症的一个重要特征。这种异质性支持肿瘤的稳健性，并为开发完全有效的治疗方案带来了巨大障碍。因此，开发用于研究和理解这种在遗传、表型和功能上定义的异质性的工具和检测方法至关重要。在本视频方案中，我们描述了一种利用烟道和 I-C-F-S-C 的站立方法。该技术可通过流式细胞术鉴定并分离人源胶质母细胞瘤细胞培养物中具有不同功能特性的各个亚群。我们已利用该技术分离并表征了一类分裂速率较慢的肿瘤细胞群体，这种功能特性已被证明与胶质瘤的肿瘤起始能力相关。神经球培养物的建立与维持采用神经球检测法，该方法在屏幕上显示地址的另一个视频中有专门描述。当胶质瘤细胞球的直径达到150至200微米时，移除含有细胞球的培养基，并将其转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以800转/分钟或110 ×g离心5分钟。随后弃去上清液，将细胞球沉淀重悬于1 mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液中，在37摄氏度水浴中孵育3至5分钟。然后加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，轻轻吹打混匀，以解离细胞球。再次离心细胞悬液。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL神经干细胞基础培养基中。每染色100万个细胞，取10微升单细胞悬液，与90微升台盼蓝充分混匀后进行细胞计数。通过将1微升5毫摩尔的CFSE染料加入1毫升神经干细胞基础培养基中，制备终浓度为5微摩尔的染色试剂。随后充分混匀染色溶液。将所需数量的细胞转移至另一离心管中，离心后弃去上清液。随后将CFSE染色液加入细胞沉淀中，轻轻混匀至均匀，室温孵育10分钟以终止染色过程。向负载CFSE的细胞中加入5至10倍体积的预冷神经干细胞基础培养基，充分混匀。然后将细胞悬液离心，弃去上清液。此时，试管底部应出现一层带有绿色色调的细胞环，表明染色成功。为去除多余的CFSE染料，需进行两到三次洗涤：将细胞沉淀重悬于1 mL神经干细胞基础培养基中，离心后弃去上清液。第三次洗涤后，将细胞重悬于1 ml神经干细胞基础培养基中，并按照先前所述方法进行细胞计数以进行接种。完全神经干细胞培养基中添加EGF，使其终浓度为20 纳克/毫升。然后将CFSE负载组和未负载组的细胞分别加入各自的离心管中，使细胞终浓度达到每毫升50,000个细胞。然后将细胞悬液充分混匀，并接种于无菌组织培养瓶中。随后对培养瓶进行标记。可通过荧光显微镜观察细胞以确认CFSE染色效果，接着将培养瓶置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养5至10天。为了通过流式细胞术验证CFSE染色效果，将CFSE标记组和未标记的阴性对照组各500,000个细胞分别转移至不同的流式管中。根据流式细胞仪用户手册中的说明，调整仪器相关参数。首先检测未标记的对照细胞，根据前向散射光和侧向散射光特性记录事件，然后在细胞频率相对于CFSE荧光强度的直方图中，圈选主要细胞群，以确认CFSE荧光强度的水平。接下来，使用与对照细胞相同的参数分析CFSE标记的细胞，这一点显而易见。CFSE阳性细胞的荧光强度比对照细胞高出几个数量级。当胶质瘤球体的直径达到平均约150至200微米时。将球体进行传代，并按照先前所述方法从CFSE标记和未标记的两组样本中制备单细胞悬液。随后，将细胞重悬于适量无菌的1×PBS中，并进行细胞计数，以排除死细胞或受损细胞。在进行流式细胞术分选时，向每毫升细胞悬液中加入1 μL碘化丙啶，用于收集缓慢分裂和快速分裂的细胞。分选时，准备两支无菌的15毫升组织培养管，每管含有1毫升完全神经干细胞培养基。然后在将细胞转移至流式细胞术实验平台的过程中，将细胞置于冰上。首先，将未加载细胞组的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。根据前向散射与侧向散射的关系绘制细胞事件，以排除死亡或受损的细胞。根据侧向散射与碘化丙啶（PI）反应性的关系绘制细胞，并将单一的活细胞群体设为群体一。然后根据前向散射和侧向散射特性，从群体一中选择一个均一的细胞群体，设为群体二。随后，使用相同的参数和设门策略，将群体二以细胞频率对CFSE荧光强度的直方图形式展示，CFSE强度采用对数刻度。将CFSE标记的细胞通过流式细胞仪进行检测和分析。随后，将底部85%的细胞设为快速分裂细胞，顶部5%的细胞设为缓慢分裂细胞。选取这些不同的目标细胞群体，并分选至分别含有1 mL完全神经干细胞培养基的15 mL无菌组织培养管中。分选阈值速率应调整至每秒不超过2,500个事件。分选完成后，将细胞离心，弃去上清液，并将沉淀重悬于适量培养基中，进行细胞计数。随后，将不同分选群体的细胞以每毫升50,000个细胞的密度接种。在添加了20纳克/毫升EGF的完全神经干细胞培养基中，将细胞孵育5至10天以形成球体。这是细胞的一个示例。在用CFSE染料标记后不久，所有细胞均呈现出强烈的绿色荧光，可在荧光显微镜下观察到。这是接种六天后由加载了A-C-F-S-E的细胞获得的代表性胶质瘤球体的图像。请注意，部分细胞仍具有很强的CFSE染色。此图为流式细胞术直方图示例，显示CFSE荧光强度随时间衰减。蓝色代表新近加载CFSE的细胞，显示出较高的荧光强度，其强度数量级远高于未加载CFSE的红色细胞。绿色代表细胞在加载CFSE后经过六天培养并发生分裂，荧光强度随之衰减后的水平。这些是分离快速和慢速分裂细胞群后培养七天形成的代表性细胞球。两组之间的细胞球形成频率没有差异，但CFSC保留细胞生长较慢，形成的细胞球体积较小，而CFSC稀释细胞则形成较大的细胞球。利用CFSC根据细胞分裂速率来鉴定和分离细胞亚群，可作为后续实验及进一步表征的起点。本方案提供了一个在人源胶质瘤衍生培养物中鉴定慢增殖细胞的示例，但也可应用于其他肿瘤细胞类型或非癌性系统。感谢您的观看，希望本方案对您的研究有所帮助。

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慢分裂的细胞在人脑胶质瘤羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的分离与鉴定

CFSE 可将荧光染料羧基荧光素共价标记到细胞内长寿命的分子上。因此，当 CFSE 标记的细胞发生分裂时，其子代细胞的荧光强度减半，从而可用于评估细胞增殖。本文描述了通常用于 CFSE...

使用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）监测淋巴细胞增殖

在本视频中，我们介绍一种对胶质瘤细胞进行基因工程改造以表达红外荧光蛋白（iRFP）的实验方案。这些带有荧光标记的胶质瘤细胞可用于深层组织成像，以研究脑肿瘤的发生与发展过程。...

胶质瘤细胞的荧光标记：一种基于慢病毒载体转染的方法以获得表达荧光蛋白的胶质瘤细胞用于深层组织成像

来源：Parker, J. J., et al. 一种用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物个体化效应的人源胶质母细胞瘤类器官切片培养模型。J. Vis. Exp.

利用延时扫描共聚焦显微镜成像胶质母细胞瘤组织中的肿瘤细胞迁移

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。...

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

本文介绍了一种高效筛选方案，用于鉴定可促进胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞分化的...

基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

肿瘤细胞的原位颅内注射已广泛应用于癌症研究，以探讨脑肿瘤的生物学特性、进展过程、演化规律及治疗反应。本文介绍了肿瘤异种移植模型的荧光分子断层成像技术，该技术可实现临床前胶质母细胞瘤模型中肿瘤组织的实时活体成像与定量分析。...

荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

本文介绍了一种利用染料稀释法检测CD4+...

使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性CD4+ T细胞

本文介绍了一种易于使用的共培养实验方法，用于分析胶质母细胞瘤（GBM）细胞在图案化神经元上的迁移。我们开发了一个FiJi软件宏，可简便地定量GBM细胞在神经元上的迁移，观察到神经元可改变GBM细胞的侵袭能力。...

在图案化神经元上共培养胶质母细胞瘤干细胞样细胞以研究迁移和细胞相互作用

我们报道了一种可在胶质母细胞瘤（GBM）细胞侵袭脊椎动物脑组织过程中实现微管动态活体成像的技术。通过将荧光标记的GBM细胞正位注射至透明的斑马鱼脑中，并结合高分辨率的活体成像，可实现对细胞骨架动态变化的观测 原位...

活体成像斑马鱼脑内侵袭性胶质母细胞瘤细胞中微管的动态变化

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。...

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

我们介绍一种利用新诊断和复发性肿瘤患者来源的磁性胶质瘤球体构建的三维胶质母细胞瘤迁移模型。该平台可实现对患者特异性迁移动态的可视化，并可用于评估治疗效果。在迁移完成后，该检测方法还可进行多重分析，以评估蛋白质的定位和表达模式。...

可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

学习使用CFSE荧光染料和流式细胞术分离鉴定人胶质母细胞瘤中慢分裂细胞的方法。该技术通过神经球培养、单细胞解离和荧光强度分析，帮助研究人员识别不同增殖速率的肿瘤细胞亚群，为理解肿瘤异质性和开发靶向治疗策略提供重要工具。

利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

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