利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

本视频实验方案演示了如何利用羧基荧光素双乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定并分离人胶质母细胞瘤中分裂缓慢的细胞。首先采用神经球实验法培养胶质母细胞瘤肿瘤细胞，随后将形成的神经球解离为单细胞，并用CFSE进行染色。

将CFSE标记的细胞再次接种。在神经球培养中，将形成的神经球解离为单个细胞，然后通过流式细胞仪进行检测。根据细胞分裂过程中荧光强度的变化，鉴定并分选出分裂缓慢和快速的细胞。

频率异质性是癌症的一个重要特征。这种异质性支持肿瘤的稳健性，并为开发完全有效的治疗方案带来了巨大障碍。因此，开发用于研究和理解这种在遗传、表型和功能上定义的异质性的工具和检测方法至关重要。

在本视频方案中，我们描述了一种利用烟道和 I-C-F-S-C 的站立方法。该技术可通过流式细胞术鉴定并分离人源胶质母细胞瘤细胞培养物中具有不同功能特性的各个亚群。我们已利用该技术分离并表征了一类分裂速率较慢的肿瘤细胞群体，这种功能特性已被证明与胶质瘤的肿瘤起始能力相关。神经球培养物的建立与维持采用神经球检测法，该方法在屏幕上显示地址的另一个视频中有专门描述。

当胶质瘤细胞球的直径达到150至200微米时，移除含有细胞球的培养基，并将其转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以800转/分钟或110 ×g离心5分钟。随后弃去上清液，将细胞球沉淀重悬于1 mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液中，在37摄氏度水浴中孵育3至5分钟。然后加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，轻轻吹打混匀，以解离细胞球。

再次离心细胞悬液。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL神经干细胞基础培养基中。每染色100万个细胞，取10微升单细胞悬液，与90微升台盼蓝充分混匀后进行细胞计数。

通过将1微升5毫摩尔的CFSE染料加入1毫升神经干细胞基础培养基中，制备终浓度为5微摩尔的染色试剂。随后充分混匀染色溶液。将所需数量的细胞转移至另一离心管中，离心后弃去上清液。

随后将CFSE染色液加入细胞沉淀中，轻轻混匀至均匀，室温孵育10分钟以终止染色过程。向负载CFSE的细胞中加入5至10倍体积的预冷神经干细胞基础培养基，充分混匀。然后将细胞悬液离心，弃去上清液。

此时，试管底部应出现一层带有绿色色调的细胞环，表明染色成功。为去除多余的CFSE染料，需进行两到三次洗涤：将细胞沉淀重悬于1 mL神经干细胞基础培养基中，离心后弃去上清液。

第三次洗涤后，将细胞重悬于1 ml神经干细胞基础培养基中，并按照先前所述方法进行细胞计数以进行接种。完全神经干细胞培养基中添加EGF，使其终浓度为20 纳克/毫升。然后将CFSE负载组和未负载组的细胞分别加入各自的离心管中，使细胞终浓度达到每毫升50,000个细胞。

然后将细胞悬液充分混匀，并接种于无菌组织培养瓶中。随后对培养瓶进行标记。可通过荧光显微镜观察细胞以确认CFSE染色效果，接着将培养瓶置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养5至10天。

为了通过流式细胞术验证CFSE染色效果，将CFSE标记组和未标记的阴性对照组各500,000个细胞分别转移至不同的流式管中。根据流式细胞仪用户手册中的说明，调整仪器相关参数。首先检测未标记的对照细胞，根据前向散射光和侧向散射光特性记录事件，然后在细胞频率相对于CFSE荧光强度的直方图中，圈选主要细胞群，以确认CFSE荧光强度的水平。

接下来，使用与对照细胞相同的参数分析CFSE标记的细胞，这一点显而易见。CFSE阳性细胞的荧光强度比对照细胞高出几个数量级。当胶质瘤球体的直径达到平均约150至200微米时。

将球体进行传代，并按照先前所述方法从CFSE标记和未标记的两组样本中制备单细胞悬液。随后，将细胞重悬于适量无菌的1×PBS中，并进行细胞计数，以排除死细胞或受损细胞。在进行流式细胞术分选时，向每毫升细胞悬液中加入1 μL碘化丙啶，用于收集缓慢分裂和快速分裂的细胞。

分选时，准备两支无菌的15毫升组织培养管，每管含有1毫升完全神经干细胞培养基。然后在将细胞转移至流式细胞术实验平台的过程中，将细胞置于冰上。首先，将未加载细胞组的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。

根据前向散射与侧向散射的关系绘制细胞事件，以排除死亡或受损的细胞。根据侧向散射与碘化丙啶（PI）反应性的关系绘制细胞，并将单一的活细胞群体设为群体一。然后根据前向散射和侧向散射特性，从群体一中选择一个均一的细胞群体，设为群体二。随后，使用相同的参数和设门策略，将群体二以细胞频率对CFSE荧光强度的直方图形式展示，CFSE强度采用对数刻度。

将CFSE标记的细胞通过流式细胞仪进行检测和分析。随后，将底部85%的细胞设为快速分裂细胞，顶部5%的细胞设为缓慢分裂细胞。选取这些不同的目标细胞群体，并分选至分别含有1 mL完全神经干细胞培养基的15 mL无菌组织培养管中。

分选阈值速率应调整至每秒不超过2,500个事件。分选完成后，将细胞离心，弃去上清液，并将沉淀重悬于适量培养基中，进行细胞计数。随后，将不同分选群体的细胞以每毫升50,000个细胞的密度接种。

在添加了20纳克/毫升EGF的完全神经干细胞培养基中，将细胞孵育5至10天以形成球体。这是细胞的一个示例。在用CFSE染料标记后不久，所有细胞均呈现出强烈的绿色荧光，可在荧光显微镜下观察到。

这是接种六天后由加载了A-C-F-S-E的细胞获得的代表性胶质瘤球体的图像。请注意，部分细胞仍具有很强的CFSE染色。此图为流式细胞术直方图示例，显示CFSE荧光强度随时间衰减。

蓝色代表新近加载CFSE的细胞，显示出较高的荧光强度，其强度数量级远高于未加载CFSE的红色细胞。绿色代表细胞在加载CFSE后经过六天培养并发生分裂，荧光强度随之衰减后的水平。

这些是分离快速和慢速分裂细胞群后培养七天形成的代表性细胞球。两组之间的细胞球形成频率没有差异，但CFSC保留细胞生长较慢，形成的细胞球体积较小，而CFSC稀释细胞则形成较大的细胞球。利用CFSC根据细胞分裂速率来鉴定和分离细胞亚群，可作为后续实验及进一步表征的起点。

本方案提供了一个在人源胶质瘤衍生培养物中鉴定慢增殖细胞的示例，但也可应用于其他肿瘤细胞类型或非癌性系统。感谢您的观看，希望本方案对您的研究有所帮助。