Name: 使用不固定，冷冻的组织，以研究自然的粘蛋白分布 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 了解使用OCT包埋冷冻组织样本保存糖基化和粘蛋白天然分布的方法。该技术通过凝集素染色和免疫组织化学分析，实现对糖链结构的精确检测，为神经科学和生物化学研究提供可靠的组织学工具。

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作者感谢佐治亚大学的 Nicole M. Nemeth 和洛斯阿拉莫斯国家实验室（LANL）的 Jeanne M. Fair 在采集鸡组织过程中提供的帮助，以及 Steven A. Springer 在拍摄过程中的协助。本研究中所有禽类的饲养与管理均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物人道使用指南，所有实验方案均经洛斯阿拉莫斯国家实验室运营方洛斯阿拉莫斯国家安全有限责任公司（Los Alamos National Security, LLC）的机构动物照护与使用委员会批准（合同编号：DE-AC52-06NA25396，美国能源部）。本研究中对小鼠的照护符合加州大学圣地亚哥分校（UCSD）批准的动物实验方案。人类组织样本的获取遵循加州大学圣地亚哥分校批准的机构审查委员会（IRB）方案。本研究得到了加州大学校长实验室费用计划（University of California Lab Fee President Program）基金项目 118645（P.G.）以及美国国立神经疾病与中风研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke）基金项目 NS047101（加州大学圣地亚哥分校神经科学显微成像共享设施）的资助。

1. OCT包埋组织
<ol>
	<li>在浅的泡沫塑料盒中，将干冰加入2-甲基丁烷中，制备冷冻浴。</li>
	<li>采集组织，并用纸巾轻轻吸干以去除多余液体。若使用速冻组织（即在液氮中冷冻的组织），将其置于冷冻切片机舱内，使其温度升至-20 °C。</li>
	<li>向Peel-A-Way冷冻模具中加入少量OCT包埋剂，足以覆盖模具底部即可。</li>
	<li>将组织放入模具中，确保组织按所需方向平置于模具底部。组织块冷冻后，将从底部或侧面进行切片。</li>
	<li>用OCT包埋剂覆盖组织，然后将模具放入冷冻浴中。随着组织冻结，OCT包埋剂会变为白色。</li>
	<li>待完全冻结后，将模具从冻好的组织块上剥离，并放入标记好的冷冻袋中。</li>
	<li>冷冻组织块可于-80 °C保存，直至使用。</li>
</ol>
2. 组织切片
<ol>
	<li>将组织块放入冷冻切片机腔室中，使其温度降至 -20 °C（约需 30 分钟）。</li>
	<li>切取 3–5 μm 厚的切片，并将带正电荷的玻璃载玻片置于切片上，组织将黏附于载玻片上。</li>
	<li>将组织在空气中干燥 30–60 分钟。</li>
	<li>载玻片可在此阶段直接使用，也可于 -80 °C 保存以备后续使用。</li>
</ol>
3. 组织染色
<ol>
	<li>储存于 -80 °C 的载玻片：将载玻片在室温下解冻并风干 30 分钟。</li>
	<li>用 10% 缓冲福尔马林在室温下固定载玻片 30 分钟。</li>
	<li>在 PBS 或 TBST 缓冲液中洗涤三次，每次洗涤将载玻片在 250 ml 缓冲液中浸洗 10 次。免疫荧光染色可使用 PBS 缓冲液，但若使用碱性磷酸酶偶联抗体进行显色检测，则应使用 TBST 缓冲液，因为 PBS 中的磷酸盐会抑制碱性磷酸酶的活性。</li>
	<li>组织切片载玻片现已准备好进行染色。</li>
</ol>
4. 使用组织化学染色法（如阿利新蓝和过碘酸雪夫染色）检测黏液
<ol>
	<li>阿利新蓝染色：
	<ol>
		<li>将切片用清水冲洗，在3%乙酸溶液中室温孵育3分钟。</li>
		<li>用pH 2.5的阿利新蓝染色液室温染色30分钟。</li>
		<li>将切片在流动的自来水下冲洗10分钟，再用去离子水冲洗。</li>
		<li>用核快红复染5分钟，室温。</li>
		<li>用去离子水清洗切片三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过碘酸雪夫染色：
	<ol>
		<li>将切片用清水冲洗，加入新配制的1%过碘酸溶液中孵育5分钟。</li>
		<li>用去离子水清洗三次，再浸入一次miliQ水中。</li>
		<li>用雪夫试剂室温染色15分钟。</li>
		<li>将切片在流动的自来水下冲洗10分钟，再用去离子水冲洗。</li>
		<li>用Surgipath苏木精复染30秒，室温。</li>
		<li>用去离子水清洗切片三次。</li>
		<li>将切片在Scott's自来水溶液中室温孵育30秒。</li>
		<li>用去离子水清洗三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水并透明切片：将切片在95%乙醇中孵育1分钟，随后依次快速更换三次100%乙醇，再更换三次Citrisolv，每次2分钟，均在室温下进行。</li>
	<li>用树脂封固剂（Cytoseal 60）将切片封片。</li>
</ol>
5. 使用凝集素和抗体（表1）通过组织化学方法检测糖类表位
<ol>
	<li>使用凝集素进行三种糖类表位的荧光检测时，用含1% BSA的PBS在室温下封闭载玻片10-30分钟。</li>
	<li>由于使用了生物素标记的凝集素，需在室温下先用0.1%亲和素孵育15分钟，再用0.01%生物素孵育15分钟，以封闭内源性生物素。</li>
	<li>每次封闭步骤后均用PBS洗涤载玻片。</li>
	<li>在HEPES/NaCl缓冲液（10 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.5）中新鲜配制以下混合液：1 μg/ml罗丹明标记的琥珀酰化小麦胚芽凝集素（sWGA）、1.3 μg/ml生物素标记的Sambucus nigra凝集素（SNA）和5 μg/ml荧光素标记的刺毛黧豆凝集素（Jacalin）。</li>
	<li>将载玻片置于平坦表面或染色盒中，加入上述凝集素混合液覆盖表面。可通过轻轻覆盖一层Parafilm来减少液体体积，Parafilm可使液体展平并防止蒸发。</li>
	<li>在避光条件下室温孵育1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片三次。</li>
	<li>在载玻片上覆盖0.7 μg/ml CY5标记的链霉亲和素（用于检测生物素化的SNA），避光条件下室温孵育30分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片三次。</li>
	<li>用0.1 μg/ml DAPI对细胞核进行复染。</li>
	<li>使用水性封片介质（如VectaMount封片剂或其他水性介质）将载玻片封固于盖玻片上。</li>
</ol>
6. 控制凝集素染色特异性
<ol>
	<li>凝集素染色特异性可通过染色前对目标聚糖表位进行特异性酶解或通过小分子竞争来控制。</li>
	<li>Sambucus nigra 凝集素（SNA）结合特异性的酶解处理
	<ol>
		<li>将 Arthrobacter ureafaciens 神经氨酸酶（AUS）用50 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.5）稀释至250 mU/mL。</li>
		<li>在空的枪头盒底部加入去离子水，以形成孵育过程中的湿盒环境。</li>
		<li>将载玻片正面朝上放置于枪头盒的顶层托架上，每张载玻片上加150–200 μL AUS溶液，然后加盖盖玻片，避免产生气泡。</li>
		<li>盖上盒盖，在37 °C孵育2.5小时。</li>
		<li>在室温下用PBS洗涤载玻片三次，以去除所有游离的唾液酸。这些载玻片在SNA染色中应呈阴性结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jacalin 和 脱乙酰化小麦胚芽凝集素（sWGA）特异性的竞争性抑制剂实验
	<ol>
		<li>将第5.4步制备的凝集素混合液各取200 μL分装至两个Eppendorf管中。</li>
		<li>在一个管中加入200 mM蜜二糖（Jacalin抑制剂），在另一个管中加入1:10稀释的甲壳素水解物（sWGA抑制剂）。</li>
		<li>将含抑制剂的混合液覆盖于阴性对照载玻片上，与其他载玻片同时在室温下孵育1小时。这些载玻片应分别对Jacalin或sWGA染色呈阴性结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 代表性结果
对石蜡包埋组织样本与冷冻保护介质（OCT）包埋的冷冻组织样本进行比较，发现两者在黏蛋白糖蛋白的保存效果和染色质量方面存在显著差异。使用组织化学染料（如阿利新蓝和过碘酸希夫试剂）对组织进行染色时，相同类型的组织切片在冷冻或石蜡包埋样本中呈现出截然不同的结果（图1）。似乎在石蜡包埋过程中使用的有机溶剂（二甲苯或Citrisolv）会影响上皮细胞表面分泌型黏蛋白的分布，并去除样本中的大部分糖脂（图2）。因此，黏液层在黏膜细胞表面出现塌陷，主要局限于杯状细胞内。而将组织在冷冻保护介质（OCT）中快速冷冻，则能维持样本的水合状态，并保留分泌型黏液层的原有结构尺寸。石蜡包埋过程也以类似方式影响其他与黏液相关的聚糖和糖脂。聚糖分布通过凝集素进行检测，凝集素是糖类检测中常用的工具（图3），此外还使用针对黏蛋白和糖脂上表位的抗体进行检测（图6）。由于凝集素结合特异性尚不完全明确，且受聚糖空间分布及结构本身的影响14,15，因此在凝集素染色中设置适当的对照至关重要。本文展示了在待测组织上控制凝集素染色的两种方法：酶切处理和竞争性抑制。聚糖表位的切除可通过使用特异性针对聚糖的酶消化组织切片实现，例如使用细菌来源的唾液酸酶作为SNA结合唾液酸的对照（图4）。当缺乏可特异性去除目标聚糖表位的酶（例如 糖苷酶）时，可通过添加竞争性抑制剂来验证凝集素的特异性，例如使用蜜二糖作为Jacalin染色的抑制剂，或使用几丁质水解物作为sWGA染色的抑制剂（图5）。
本文证明，临床和科研实验室常规获取的速冻组织样本可进一步包埋于OCT中，用于研究黏蛋白糖蛋白及其上存在的多种聚糖。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>凝集素 / 抗体</td>
			<td>来源</td>
			<td>主要特异性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LFA</td>
			<td>Limax flavus（黄蛞蝓）</td>
			<td>末端唾液酸（Terminal Sia）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAA*</td>
			<td>Maackia amurensis（东北山黧豆）</td>
			<td>Siaα2-3Galβ1-R / Galβ1-R 上的 3-O-硫酸化物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNA</td>
			<td>Sambucus nigra（接骨木莓）</td>
			<td>Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WGA</td>
			<td>Triticum vulgaris（小麦胚芽）</td>
			<td>GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / 唾液酸（Sia）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sWGA</td>
			<td>琥珀酰化的 Triticum vulgaris（小麦胚芽）</td>
			<td>GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA</td>
			<td>Arachis hypogaea（花生）</td>
			<td>Galβ1-3GalNAc（未修饰的 T 抗原）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jacalin</td>
			<td>Artocarpus integrifolia（刺桐凝集素）</td>
			<td>O-连接聚糖上的 Galβ1-3GalNAc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECA</td>
			<td>Erythrina cristagalli（珊瑚树）</td>
			<td>Galβ1-4GlcNAc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TKH2</td>
			<td>抗体</td>
			<td>O-连接聚糖上的 Siaα2-6GalNAc（STn）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA19-9</td>
			<td>抗体</td>
			<td>Siaα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc（SLea）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNH3</td>
			<td>抗体</td>
			<td>Siaα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc（SLex）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
缩写：Ab，抗体；Sia，唾液酸；Gal，半乳糖；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺；GlcNAc，N-乙酰葡萄糖胺；Fuc，岩藻糖；STn，唾液酸基-Tn；SLea，唾液酸基-Lewis a；SLex，唾液酸基-Lewisx。* MAA 的商业来源包括 MALI、MALII 和 MAH。
表1. 用于糖类表位的凝集素和抗体的部分列表。
<img alt="组织学染色比较；PAS 和 AB 方法；人、小鼠、鸡组织；显微镜观察。" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. 冰冻和石蜡包埋结肠组织的阿利新蓝与过碘酸-雪夫染色。 对包埋于OCT中的冰冻组织（上图）或石蜡包埋的人、小鼠或鸡结肠组织切片，分别使用过碘酸-雪夫（PAS）或阿利新蓝（AB）进行染色。这两种试剂分别将黏液染成粉红色或蓝色。上图：在冰冻组织中，除杯状细胞内的黏蛋白外，分泌的黏液也清晰可见（箭头所示）。下图：在石蜡包埋组织中，黏液染色仅局限于杯状细胞。细胞核使用Surgipath（PAS）或Mayer（AB）苏木精复染。比例尺为100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="组织学分析，H&amp;E 和阿尔新蓝染色；肝脏组织与对照组、乙醇组、Citrisolv组的比较。" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图2. Citrisolv孵育导致黏蛋白显著丢失。 冷冻鸡回肠标本的连续切片经10%缓冲福尔马林固定后，分别保持水化状态（左图）、通过依次在70%、90%和100%乙醇中各孵育20分钟进行脱水（中图），或在乙醇脱水后用Citrisolv透明1小时（右图）。脱水后的样本在进行苏木精-伊红（H&amp;E）或阿尔新蓝染色前，需重新水化至PBS中。乙醇脱水和Citrisolv透明改善了组织形态学结构（例如，上排图像中，中图和右图与左图相比）。乙醇脱水对阿尔新蓝染色无明显影响（中排图像，比较左图与中图）。相比之下，Citrisolv孵育减少了阿尔新蓝染色信号，并将其限制在杯状细胞内（中排图像，右图），该模式与石蜡包埋组织中观察到的结果相似（图1）。这些数据表明，石蜡包埋样本中黏液颗粒的强染色是由于透明步骤中杯状细胞内黏液发生收缩和浓缩所致。而在冷冻OCT包埋组织中黏液染色较弱且密度较低，反映了黏液在组织中更自然的分布状态。方框区域的高倍放大图像以箭头标示。比例尺表示50 μm（上排和中排）和10 μm（下排）。
<img alt="冰冻组织与石蜡组织染色；Jacalin、sWGA、SNA 标记物；免疫荧光分析。" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 凝集素对冰冻组织和石蜡包埋组织中糖链表位的结合。 鸡小肠（回肠）标本经 OCT 包埋冷冻（上排）或石蜡包埋（下排），分别用 Jacalin（蓝色）、sWGA（绿色）和 SNA（红色）进行检测。方框区域的高倍放大图以箭头标示。在冰冻组织中，Jacalin 对 O-连接聚糖的结合显示出似乎从杯状细胞渗入管腔的结构（Jacalin，上排，箭头）。相比之下，Jacalin 在石蜡包埋组织中的结合局限于杯状细胞（Jacalin，下排，箭头）和绒毛刷状缘（左下图，箭头）。sWGA 对 β1-4GlcNAc 的染色在冰冻组织（上排，箭头）和石蜡包埋组织（下排，箭头）中均与 Jacalin 凝集素的结合部分共定位。相反，SNA 凝集素对 α2-6 连接唾液酸的结合位于细胞内（SNA，空心箭头），不与 Jacalin 共定位（彩色图像中，SNA 以红色显示，空心箭头标示；Jacalin 以蓝色显示，虚线箭头标示）。比例尺表示 100 μm（左侧图像）和 20 μm（放大方框区域）。
<img alt="未经处理与AUS处理组织的荧光比较；显微图像展示染色效果。" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 使用SNA进行唾液酸染色的酶切对照实验。 鸡小肠组织样本分别在含有250 mU/ml Arthrobacter ureafaciens 神经氨酸酶（AUS）或50 mM pH 5.5醋酸钠缓冲液中，37 °C孵育2.5小时。AUS处理消除了生物素标记SNA的染色信号，证实SNA对唾液酸结合的特异性。比例尺为100 μm。
<img alt="荧光显微镜，聚糖检测，Jacalin，sWGA，抑制剂效应，结合分析。" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 使用 Jacalin 和 sWGA 进行聚糖染色的竞争性抑制对照实验。 鸡小肠（回肠）组织样本在特异性凝集素抑制剂存在下，与 Jacalin 和 sWGA 混合物共同孵育：蜜二糖（中间列）、壳聚糖水解物（右列）或无抑制剂（A 和 D）。上图：（左）无抑制剂时的 Jacalin 染色；（中）蜜二糖抑制了 Jacalin 染色；（右）壳聚糖水解物未抑制 Jacalin 染色。下图：（左）无抑制剂时的 sWGA 染色；（中）蜜二糖未抑制 sWGA 染色；（右）壳聚糖水解物抑制了 sWGA 染色。该抑制结果证实了凝集素与组织之间的特异性相互作用。星号标记了染色被抑制的图像区域。比例尺为 100 μm。
<img alt="比较绒毛状癌和黏液癌中MUC5AC、CA19-9标志物染色的组织学切片。" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 冷冻人源结直肠癌组织中分泌型黏蛋白、糖脂及糖链表位的检测。 来自绒毛状癌和黏液癌的结直肠癌活检组织经液氮速冻后包埋于OCT中。组织切片先后与针对分泌型黏蛋白MUC5AC、存在于神经节苷脂上的唾液酸化路易斯a糖链表位（结直肠癌标志物CA 19-9）、以及黏蛋白上富集的唾液酸化-Tn糖链表位（使用TKH2抗体检测）的抗体在室温孵育1小时，随后与生物素化驴抗小鼠IgG二抗孵育30分钟，再与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育30分钟。另取部分组织切片与生物素化凝集素SNA和sWGA在室温孵育1小时，随后同样与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育30分钟。辣根过氧化物酶显色使用AEC试剂盒进行。黑色标尺表示200 μm。

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<li>Ota, H., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+laminated+array+of+two+types+of+mucin+in+the+human+gastric+surface+mucous+later%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+J%22%5BJournal%5D)">Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous later.</a> Histochemical J. 24, 86-92 (1992).</li>
<li>Matsuo, K., Ota, H., Akamatsu, T., Sugiyama, A., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+of+the+surface+mucous+gel+layer+of+the+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Histochemistry of the surface mucous gel layer of the human colon.</a> Gut. 40, 782-789 (1997).</li>
<li>Boyde, A., Maconnachie, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+lithium+salts+reduces+ethanol+dehydration+shrinkage+of+glutaraldehyde+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Treatment with lithium salts reduces ethanol dehydration shrinkage of glutaraldehyde fixed tissue.</a> Histochemistry. 66, 181-187 (1980).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

冷冻组织中黏液和糖类表位的保存效果优于石蜡包埋组织。我们展示了与石蜡包埋组织相比，冷冻组织中分泌的黏液层（图1和图3）以及三种糖类结构的分布情况（图3）。已有专门的固定液（如Carnoy's溶液（60%乙醇、30%氯仿、10%乙酸））被开发用于在组织样本中最佳保存黏液层17。理想情况下，该溶液应用于专用于黏液研究的组织样本采集，并已被证明可保持黏液层的平滑外观16-17。未固定的冷冻样本在OCT包埋后，其黏液层表面显得粗糙，某些区域可能从组织上脱落；然而，整体黏液层厚度与经Carnoy's溶液固定后石蜡包埋的组织所观察到的结果一致16-17。例如，冷冻人结肠组织切片中的黏液层厚度约为100 μm（图1），该数值处于经Carnoy's溶液固定的结肠样本报道范围之内（55.4±2.5 μm，范围为7.7 - 204.8 μm）16。
数十年来已知，乙醇脱水会导致生物样本收缩约30%18，而二甲苯、Citrisolv和氯仿等有机溶剂则会从组织中提取脂质、糖脂，并在一定程度上提取蛋白质13。石蜡包埋的组织处理包括以下步骤：固定（10%缓冲甲醛）、脱水（梯度乙醇）和透明（Citrisolv或二甲苯）。通过对未固定的冷冻组织切片模拟这些步骤，我们证明Citrisolv可从冷冻组织切片中提取黏液，从而产生与石蜡包埋组织相似的组织形态（图2，右图）。相比之下，用甲醛或乙醇孵育并未改变黏液层（图2，左图和中图）。这表明标准石蜡包埋程序中的透明步骤（需长时间孵育于Citrisolv/二甲苯中）会导致黏液层塌陷。甲醛固定不会破坏黏液层，经甲醛固定的冷冻组织切片可直接使用凝集素及针对聚糖、糖脂和蛋白质的抗体进行染色（图2、图3和图6）。这些影响在研究膜结合蛋白和组织病理学时可能微不足道，但对于高度水合的结构（如分泌型黏液层）则具有破坏性。然而，目前对黏蛋白的组织学研究仍主要使用石蜡包埋样本，而此类样本中黏液层的保存效果并不理想。对黏液层成分的深入分析，例如精确鉴定分泌型或膜结合型MUC糖蛋白的组合，需要特异性抗体和质谱技术以确定蛋白质骨架。黏液层的保存仅是开展此类研究的初步前提。
许多实验室都保存着过去为不同项目采集并用OCT包埋冷冻的组织样本，这些组织可直接用于研究黏蛋白、糖脂及聚糖分布，从而无需再使用专为保存黏液而设计的特殊固定剂来收集组织。冷冻组织经过的处理步骤较少，因此天然水合状态的聚糖自然分布得以保留。这一点在微生物与宿主相互作用的研究领域尤为重要。了解分泌型黏蛋白及其所携带的多种聚糖结构在“屏障”分子上的自然分布与丰度，对于理解宿主防御机制、微生物的利用策略以及致病过程具有关键意义。

<table><tbody><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>AEC 过氧化物酶底物试剂盒</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4200</td><td></td></tr><tr><td>阿辛蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>抗 CA 19-9 单克隆抗体</td><td>Calbiochem</td><td>CA1003</td><td></td></tr><tr><td>抗 MUC5AC 单克隆抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB2011</td><td></td></tr><tr><td>亲和素-生物素封闭试剂盒</td><td>Vector Labs</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>生物素化驴抗小鼠抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>90863</td><td></td></tr><tr><td>生物素化 SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>壳聚糖水解物</td><td>Vector Labs</td><td>SP-0090</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica CM 1800</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Surgipath Medical Ind.</td><td>3801570</td><td></td></tr><tr><td>30% 过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td></td></tr><tr><td>刺槐凝集素-FITC</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1151</td><td></td></tr><tr><td>梅耶氏苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>蜜二糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5500</td><td></td></tr><tr><td>核固红</td><td>Vector Labs</td><td>H-3403</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记链霉亲和素</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>94638</td><td></td></tr><tr><td>希夫试剂</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>26052</td><td></td></tr><tr><td>sWGA-罗丹明</td><td>Vector Labs</td><td>RL1022S</td><td></td></tr><tr><td>TKH2 单克隆抗体</td><td>ATCC</td><td>HB-9654</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount 水溶性封片介质</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A Way 模具</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18646A-1</td><td></td></tr></tbody></table>

使用未固定的冷冻组织研究天然黏蛋白分布

Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

黏蛋白是一类复杂且高度糖基化的O连接糖蛋白，其糖类成分按重量计超过70%1-3。由杯状细胞和胃黏膜分泌的黏蛋白可形成微米级厚度的黏液层，覆盖于肠道和呼吸道上皮表面3,4。除了黏蛋白外，黏液层还含有抗菌肽、细胞因子和免疫球蛋白5-9。黏液层是宿主先天免疫系统的重要组成部分，构成了抵御入侵微生物的第一道防线8,10-12。因此，黏液会与多种微生物（包括病原体和共生菌）发生广泛的相互作用，而分泌型黏蛋白则成为介导这些相互作用的关键界面。对这类生物学相互作用的研究通常涉及组织取材与染色的组织学方法。在临床和科研实验室中，最常用的两种组织取材与保存的组织学方法分别为：甲醛固定后石蜡包埋，以及组织冷冻后包埋于冷冻保护介质中。
石蜡包埋的组织样本可产生适合组织学观察的优质切片，具有清晰度高和形态结构分明的特点。然而，在石蜡包埋过程中，许多表位会发生改变，为了研究这些表位，组织切片必须经过多种抗原修复方法中的一种进一步处理。13在石蜡包埋脱蜡步骤中，分泌型黏蛋白和脂质会从组织中被提取出来，此过程需要长时间孵育于有机溶剂（二甲苯或Citrisolv）中。因此，该方法在研究黏蛋白和黏液的性质与分布时并非最优选择 体内.
相比之下，将组织在最佳切割温度（OCT）包埋介质中进行冷冻可避免样本的脱水和透明处理，从而保持样本的水合状态。这有助于更好地保存水合的黏液层，进而允许研究黏蛋白在上皮生物学中的多种作用。由于该方法对组织的处理步骤最少，组织得以保持更接近自然的状态。因此，冷冻组织切片在染色前无需任何额外处理，可直接用于免疫组织化学分析。
我们展示了在冷冻的结肠样本中可保存数微米厚的分泌型黏液层。而当相同组织包埋于石蜡中时，该黏液层则显著减少。我们还展示了利用植物凝集素对黏蛋白上的糖链表位进行免疫荧光染色的方法。该方法的优势在于无需使用特殊固定剂，并可利用实验室中已保存的冷冻组织样本。

嵌入最佳切割温度介质（OCT）中的未固定冷冻组织样本可用于研究分泌型黏液的天然分布及其糖基化状态。该方法对组织的处理步骤最少，可保留糖脂、黏蛋白及糖链表位的天然构象。可通过免疫组织化学方法结合荧光或显色检测对组织切片进行分析。

黏蛋白是一类复杂且高度糖基化的O-连接糖蛋白，其糖类成分按重量计超过70%1-3。分泌型黏蛋白由……产生

以下实验的总体目标是保存组织样本中分泌型黏液的糖基化自然分布状态。首先将组织包埋于最佳切割温度（OCT）介质中，以最大限度减少组织处理过程对糖基化的影响，进而实现对聚糖结构、黏蛋白及黏液的检测。随后将组织切片与凝集素、抗体以及组织化学染料进行孵育。可通过竞争性抑制或酶切裂解聚糖表位来进一步验证凝集素结合的特异性。最终，可通过神秘化学分析方法比较黏液及冷冻组织样本中黏液的保存情况与石蜡包埋样本中黏液的保存效果。相较于现有方法（如将组织包埋于苯并使用羧酸溶液固定），该技术的主要优势在于无需使用特殊固定剂，并可利用实验室中已有的冷冻组织样本。首先，将速冻组织放入冷冻切片机舱内，使其升温至负20摄氏度。同时，通过向一个浅层泡沫塑料盒中加入两甲基丁烷，再加入干冰，制备一个冷冻浴。接着，在可剥离冷冻模具底部加入适量OCT包埋剂以覆盖底部，然后将组织放入模具中。确保组织以所需的方向平放在模具底部。用更多的OCT包埋剂覆盖组织，然后将模具放入冷冻浴中。随着组织冻结，OCT包埋剂会变为白色。待完全冻结后，将模具从冻好的组织块上剥离，并将组织块放入标记好的冷冻袋中。将冷冻组织块在使用前保存于零下80摄氏度，直至进行切片。将待用的冷冻组织块置于冷冻切片机腔室内约30分钟，使其温度升至零下20摄氏度。当组织块温度适宜时，切下厚度为3至5微米的切片，然后将带正电荷的玻璃载玻片置于切片之上。将组织在空气中干燥30至60分钟后，组织会黏附在载玻片上。室温下用10%缓冲固定液固定载玻片30分钟，然后在PB PBS中清洗载玻片，将载玻片在250毫升缓冲液中快速浸入10次，重复三次，以用aum进行染色。先用蓝色染色，将载玻片在水中漂洗，然后在3%乙酸中孵育3分钟。然后将组织与AUM蓝色溶液孵育。30分钟后，用流动的自来水冲洗载玻片10分钟，再用去离子水漂洗。用核固红对细胞核复染5分钟，然后用去离子水冲洗载玻片三次。接着将载玻片脱水并透明：先在95%乙醇中孵育1分钟，随后在100%乙醇中快速更换三次，再在柑橘透明剂中更换三次，每次2分钟。最后，使用共振介质（如 Cyto Seal 60）将盖玻片封固在载玻片上，以进行过碘酸希夫染色。首先，将载玻片在水中漂洗，然后与新配制的 1% 过碘酸溶液孵育 5 分钟。接着，用去离子水洗涤载玻片三次。将切片在 Milli Q 水中浸洗一次，然后用希夫试剂（shiff reagent）染色组织。15 分钟后，用流动的自来水冲洗切片 10 分钟，再在去离子水中浸洗一次。用 sgio metin 对细胞核复染 30 秒，然后在去离子水中清洗切片三次。最后将切片孵育30秒。在Scot's自来水蓝染试剂中漂洗后，再用去离子水洗涤三次，然后按照上述钙蓝染色的方法对组织进行脱水。使用盖玻片封片，通过凝集素进行糖类表位的荧光检测。首先，用 PBS 中的 BSA 封闭载玻片，封闭时间为 10 至 30 分钟。然后，将载玻片与阿维丁（avadon）孵育 15 分钟以封闭内源性生物素，随后用 PBS 洗涤，再经另一次 PBS 洗涤后，用 0.01% 生物素孵育 15 分钟。将载玻片放入染色盒中，在每张组织切片上覆盖新配制的所需凝集素混合液，然后用石蜡油（parfum）轻轻覆盖凝集素混合液。一小时后，将玻片置于避光环境中孵育。轻轻去除香精，用 PBS 洗涤玻片三次。然后在玻片上覆盖链霉亲和素偶联的 SCI5，30 分钟后再次置于避光环境中孵育，孵育结束后用 PBS 洗涤玻片三次，再用 DAPI 对细胞核进行复染。最后，使用水性封片剂（如Vector Mount封片介质）和盖玻片对切片进行封片，用于sase酶对照。首先，在空的枪头盒底部加入水，以形成一个湿盒。将阴性对照切片正面朝上放置在枪头盒的上层托盘中。在组织切片上铺加 150 至 200 微升的 US 溶液，然后为每张载玻片加盖盖玻片，避免产生气泡。关闭盒盖，将盒子在 37 摄氏度下孵育两个半小时。在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，以去除任何未结合的 slic 酸。然后将载玻片与SNA在室温下孵育一小时，以进行竞争性抑制。将凝集素混合物各200微升分装至两个小离心管中作为对照。向其中一管加入200毫摩尔的Jacqueline抑制剂Meli二糖，向另一管加入SWGA抑制剂壳聚糖水解物，按1:10比例稀释。然后将载玻片与含有抑制剂的混合物在室温下孵育一小时。在第一张图中，组织样本为小茴香小鼠或鸡结肠标本，经OCT包埋或石蜡包埋后冷冻，分别用过碘酸雪夫染色法（呈粉红色）或钙蓝染色法（呈蓝色）进行染色。比较石蜡包埋组织样本与OCT冷冻保护介质中冷冻的组织样本，发现两者在黏蛋白糖蛋白的保存及染色质量方面存在显著差异。除了杯状细胞中的黏蛋白外，石蜡包埋组织中还可见分泌的黏液，如图中箭头所示。黏液染色局限于杯状细胞。本图中可观察到黏蛋白的显著减少以及经柑橘提取物孵育后的组织变化。将冷冻的鸡回肠标本连续切片后，用10%缓冲福尔马林固定并保持湿润，随后依次在70%、90%和100%乙醇中各孵育20分钟进行脱水，或经乙醇脱水后再用citrus all透明处理1小时。单独使用乙醇脱水，或乙醇脱水联合citrus all透明处理均可改善组织形态学结构。进一步的单独乙醇脱水对蓝色染色无显著影响。相比之下，柑橘类全部孵育处理使蓝色染色减弱，并将染色局限于杯状细胞，其模式与前一张图中所见石蜡包埋组织的染色模式相似。方框标示了番红O-亮绿（allium blue）染色组织切片中高倍放大的区域。在接下来的一系列图像中，展示了用OCT包埋后冷冻或石蜡包埋的鸡回肠标本，分别用Jacqueline标记蓝色、SWG标记绿色、SNA标记红色的荧光染色结果。Jacqueline 与 O-连接聚糖的结合显示出一些结构，这些结构似乎正从杯状细胞渗入肠腔，如 OCT 冷冻组织切片中的箭头所示。相比之下，Jacqueline 在石蜡包埋组织中的结合仅限于杯状细胞和绒毛刷状缘，如这些箭头所示。SWGA 对 β1,4-半乳糖的染色在冷冻和石蜡包埋组织中均与 Jacqueline 凝集素的结合部分共定位，如箭头所示。相比之下，红色的SNA凝集素（由箭头指示）在细胞内结合α2,6连接的唾液酸，且不与 Jacqueline（蓝色，由虚线箭头指示）共定位，如本图所示。唾液酸表位通过用US处理鸡回肠组织切片进行切除，或如本图所示，通过在醋酸钠缓冲液中孵育而不进行切除。US处理消除了生物素标记的SNA在未处理组织中所观察到的染色，证实了SNA对唾液酸结合的特异性。凝集素特异性还可通过添加竞争性抑制剂来验证，例如在对鸡回肠标本进行Jacqueline染色时使用mely bios，或在进行SWGA染色时使用几丁质水解产物。再次将标本与Jacqueline和SWGA混合物共同孵育，此次同时加入特异性凝集素抑制剂mely bios或几丁质水解产物。结果显示，mely bios可抑制Jacqueline染色，而几丁质水解产物则不能；相反，几丁质水解产物可抑制SWGA染色，而mely bios则不能。这一系列最终图像表明，临床上和科研实验室中常规获取的速冻组织样本可进一步包埋于OCT包埋剂中，用于研究黏蛋白、糖蛋白、糖脂以及糖类分子上的糖链结构。这些来自绒毛状癌和黏液癌组织的结直肠癌活检样本均经液氮速冻后包埋于OCT中，并成功对多种指定的黏蛋白及糖类表位进行了染色。观看本视频后，您应能充分掌握如何将组织包埋于OCT中，并了解如何利用免疫化学方法分析黏液及组织的糖基化修饰。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用不固定，冷冻的组织，以研究自然的粘蛋白分布

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