使用未固定的冷冻组织研究天然黏蛋白分布

以下实验的总体目标是保存组织样本中分泌型黏液的糖基化自然分布状态。首先将组织包埋于最佳切割温度（OCT）介质中，以最大限度减少组织处理过程对糖基化的影响，进而实现对聚糖结构、黏蛋白及黏液的检测。随后将组织切片与凝集素、抗体以及组织化学染料进行孵育。

可通过竞争性抑制或酶切裂解聚糖表位来进一步验证凝集素结合的特异性。最终，可通过神秘化学分析方法比较黏液及冷冻组织样本中黏液的保存情况与石蜡包埋样本中黏液的保存效果。相较于现有方法（如将组织包埋于苯并使用羧酸溶液固定），该技术的主要优势在于无需使用特殊固定剂，并可利用实验室中已有的冷冻组织样本。

首先，将速冻组织放入冷冻切片机舱内，使其升温至负20摄氏度。同时，通过向一个浅层泡沫塑料盒中加入两甲基丁烷，再加入干冰，制备一个冷冻浴。接着，在可剥离冷冻模具底部加入适量OCT包埋剂以覆盖底部，然后将组织放入模具中。

确保组织以所需的方向平放在模具底部。用更多的OCT包埋剂覆盖组织，然后将模具放入冷冻浴中。随着组织冻结，OCT包埋剂会变为白色。待完全冻结后，将模具从冻好的组织块上剥离，并将组织块放入标记好的冷冻袋中。

将冷冻组织块在使用前保存于零下80摄氏度，直至进行切片。将待用的冷冻组织块置于冷冻切片机腔室内约30分钟，使其温度升至零下20摄氏度。当组织块温度适宜时，切下厚度为3至5微米的切片，然后将带正电荷的玻璃载玻片置于切片之上。

将组织在空气中干燥30至60分钟后，组织会黏附在载玻片上。室温下用10%缓冲固定液固定载玻片30分钟，然后在PB PBS中清洗载玻片，将载玻片在250毫升缓冲液中快速浸入10次，重复三次，以用aum进行染色。先用蓝色染色，将载玻片在水中漂洗，然后在3%乙酸中孵育3分钟。

然后将组织与AUM蓝色溶液孵育。30分钟后，用流动的自来水冲洗载玻片10分钟，再用去离子水漂洗。用核固红对细胞核复染5分钟，然后用去离子水冲洗载玻片三次。接着将载玻片脱水并透明：先在95%乙醇中孵育1分钟，随后在100%乙醇中快速更换三次，再在柑橘透明剂中更换三次，每次2分钟。

最后，使用共振介质（如 Cyto Seal 60）将盖玻片封固在载玻片上，以进行过碘酸希夫染色。首先，将载玻片在水中漂洗，然后与新配制的 1% 过碘酸溶液孵育 5 分钟。接着，用去离子水洗涤载玻片三次。

将切片在 Milli Q 水中浸洗一次，然后用希夫试剂（shiff reagent）染色组织。15 分钟后，用流动的自来水冲洗切片 10 分钟，再在去离子水中浸洗一次。用 sgio metin 对细胞核复染 30 秒，然后在去离子水中清洗切片三次。

最后将切片孵育30秒。在Scot's自来水蓝染试剂中漂洗后，再用去离子水洗涤三次，然后按照上述钙蓝染色的方法对组织进行脱水。使用盖玻片封片，通过凝集素进行糖类表位的荧光检测。

首先，用 PBS 中的 BSA 封闭载玻片，封闭时间为 10 至 30 分钟。然后，将载玻片与阿维丁（avadon）孵育 15 分钟以封闭内源性生物素，随后用 PBS 洗涤，再经另一次 PBS 洗涤后，用 0.01% 生物素孵育 15 分钟。将载玻片放入染色盒中，在每张组织切片上覆盖新配制的所需凝集素混合液，然后用石蜡油（parfum）轻轻覆盖凝集素混合液。

一小时后，将玻片置于避光环境中孵育。轻轻去除香精，用 PBS 洗涤玻片三次。然后在玻片上覆盖链霉亲和素偶联的 SCI5，30 分钟后再次置于避光环境中孵育，孵育结束后用 PBS 洗涤玻片三次，再用 DAPI 对细胞核进行复染。

最后，使用水性封片剂（如Vector Mount封片介质）和盖玻片对切片进行封片，用于sase酶对照。首先，在空的枪头盒底部加入水，以形成一个湿盒。将阴性对照切片正面朝上放置在枪头盒的上层托盘中。

在组织切片上铺加 150 至 200 微升的 US 溶液，然后为每张载玻片加盖盖玻片，避免产生气泡。关闭盒盖，将盒子在 37 摄氏度下孵育两个半小时。在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，以去除任何未结合的 slic 酸。

然后将载玻片与SNA在室温下孵育一小时，以进行竞争性抑制。将凝集素混合物各200微升分装至两个小离心管中作为对照。向其中一管加入200毫摩尔的Jacqueline抑制剂Meli二糖，向另一管加入SWGA抑制剂壳聚糖水解物，按1:10比例稀释。

然后将载玻片与含有抑制剂的混合物在室温下孵育一小时。在第一张图中，组织样本为小茴香小鼠或鸡结肠标本，经OCT包埋或石蜡包埋后冷冻，分别用过碘酸雪夫染色法（呈粉红色）或钙蓝染色法（呈蓝色）进行染色。比较石蜡包埋组织样本与OCT冷冻保护介质中冷冻的组织样本，发现两者在黏蛋白糖蛋白的保存及染色质量方面存在显著差异。

除了杯状细胞中的黏蛋白外，石蜡包埋组织中还可见分泌的黏液，如图中箭头所示。黏液染色局限于杯状细胞。本图中可观察到黏蛋白的显著减少以及经柑橘提取物孵育后的组织变化。

将冷冻的鸡回肠标本连续切片后，用10%缓冲福尔马林固定并保持湿润，随后依次在70%、90%和100%乙醇中各孵育20分钟进行脱水，或经乙醇脱水后再用citrus all透明处理1小时。单独使用乙醇脱水，或乙醇脱水联合citrus all透明处理均可改善组织形态学结构。进一步的单独乙醇脱水对蓝色染色无显著影响。

相比之下，柑橘类全部孵育处理使蓝色染色减弱，并将染色局限于杯状细胞，其模式与前一张图中所见石蜡包埋组织的染色模式相似。方框标示了番红O-亮绿（allium blue）染色组织切片中高倍放大的区域。在接下来的一系列图像中，展示了用OCT包埋后冷冻或石蜡包埋的鸡回肠标本，分别用Jacqueline标记蓝色、SWG标记绿色、SNA标记红色的荧光染色结果。

Jacqueline 与 O-连接聚糖的结合显示出一些结构，这些结构似乎正从杯状细胞渗入肠腔，如 OCT 冷冻组织切片中的箭头所示。相比之下，Jacqueline 在石蜡包埋组织中的结合仅限于杯状细胞和绒毛刷状缘，如这些箭头所示。SWGA 对 β1,4-半乳糖的染色在冷冻和石蜡包埋组织中均与 Jacqueline 凝集素的结合部分共定位，如箭头所示。

相比之下，红色的SNA凝集素（由箭头指示）在细胞内结合α2,6连接的唾液酸，且不与 Jacqueline（蓝色，由虚线箭头指示）共定位，如本图所示。唾液酸表位通过用US处理鸡回肠组织切片进行切除，或如本图所示，通过在醋酸钠缓冲液中孵育而不进行切除。US处理消除了生物素标记的SNA在未处理组织中所观察到的染色，证实了SNA对唾液酸结合的特异性。

凝集素特异性还可通过添加竞争性抑制剂来验证，例如在对鸡回肠标本进行Jacqueline染色时使用mely bios，或在进行SWGA染色时使用几丁质水解产物。再次将标本与Jacqueline和SWGA混合物共同孵育，此次同时加入特异性凝集素抑制剂mely bios或几丁质水解产物。结果显示，mely bios可抑制Jacqueline染色，而几丁质水解产物则不能；相反，几丁质水解产物可抑制SWGA染色，而mely bios则不能。

这一系列最终图像表明，临床上和科研实验室中常规获取的速冻组织样本可进一步包埋于OCT包埋剂中，用于研究黏蛋白、糖蛋白、糖脂以及糖类分子上的糖链结构。这些来自绒毛状癌和黏液癌组织的结直肠癌活检样本均经液氮速冻后包埋于OCT中，并成功对多种指定的黏蛋白及糖类表位进行了染色。观看本视频后，您应能充分掌握如何将组织包埋于OCT中，并了解如何利用免疫化学方法分析黏液及组织的糖基化修饰。