使用不固定，冷冻的组织，以研究自然的粘蛋白分布

嵌入在的最优切削温度介质（OCT）的未定影的冰冻组织标本可用于研究自然分布和糖基化的分泌粘液。在这种方法中组织处理是最小的，自然呈现的糖脂，粘蛋白和糖基表位被保留。组织切片，可以用荧光或发色检测用免疫组织化学分析。

以下实验的总体目标是保持组织样品中分泌粘液的糖基化自然分布。这是通过首先将组织包埋在最佳切割温度、培养基或 OCT 中以最大限度地减少组织处理，然后允许检测聚糖结构、粘蛋白和粘液来实现的。切片与凝集素抗体和组织化学染色剂一起孵育。

凝集素结合可以通过竞争性抑制或聚糖表位的酶促切割来进一步挑战，以确认凝集素结合特异性。最终，粘液和冷冻组织样品的保存可以与通过神秘化学分析保存石蜡包埋样品中的粘液进行比较。与现有方法（例如将组织包埋在 paren 中和用 car noise solution 固定 eh 固定）相比，使用该技术的主要优点是该方法不需要使用专门的固定剂，并且允许利用实验室中可能已经存在的冷冻组织。

首先，将冷冻组织放入冷冻切片机室中，让其升至零下 20 摄氏度。同时，将两个甲基丁烷加入浅泡沫塑料盒中，然后在盒子中加入干冰，形成冷冻浴。接下来，加入刚好足够的 OCT 以覆盖剥离的冷冻模具的底部，然后将组织放入模具中。

确保纸巾以所需的方向放在模具底部。用更多的 OCT 覆盖组织，然后将模具放入冷冻浴中。OCT 化合物会随着组织冻结而变白冷冻后，将霉菌从冷冻块上剥下来，然后将块放入标记的冷冻袋中。

将冷冻块储存在零下 80 摄氏度直至使用，然后再切片组织。将感兴趣的冷冻块放入冷冻切片机室中约 30 分钟，使其达到零下 20 摄氏度。当温暖的块切成 3 到 5 微米厚的切片时，然后在切片顶部放置一个带正电的载玻片。

将组织风干 30 至 60 分钟后，组织将粘附在载玻片上。在室温下用 10% 缓冲配方将玻片固定 30 分钟，然后在 PB PBS 中洗涤玻片 3 次，在 250 mL 缓冲液中快速浸入 10 次，用 aum 对组织进行染色。先蓝色，用水冲洗玻片，然后在 3% 乙酸中孵育 3 分钟。

然后用 AUM 蓝色溶液孵育组织 30 分钟后，用流水清洗载玻片，自来水 10 分钟，然后用去离子水冲洗。用细胞核固红对细胞核复染 5 分钟，然后用去离子水洗涤玻片 3 次。现在，通过在 95% 乙醇中孵育 1 分钟，然后在 100% 乙醇中快速更换 3 次，然后在柑橘分解中更换 3 次，每次 2 分钟，脱水并清除玻片。

最后，用共振介质（如 Cyto Seal 60）将盖玻片安装在载玻片上，以用高碘酸转移对组织进行染色。首先，用水冲洗玻片，然后与新鲜制备的 1% 高碘酸孵育 5 分钟。现在，用 di 水洗涤载玻片 3 次。

将载玻片浸入 Milli Q 水中一次，然后用 shiff 试剂对组织进行染色。15 分钟后，用流水清洗玻片，再用自来水浸泡 10 分钟，然后浸入 di 水中一次。用 sgio metin 对细胞核进行复染 30 秒，然后用去离子水洗涤载玻片 3 次。

最后，将玻片孵育 30 秒。在 Scot 的自来水中，蓝化试剂在去离子水中再洗涤 3 次，然后在脱水后将组织脱水，如图所示，用于钙蓝染色。用盖玻片安装载玻片，以便使用凝集素对聚糖表位进行荧光检测。

首先，用 PBS 中的 BSA 封闭玻片 10 到 30 分钟。然后用 avadon 孵育玻片 15 分钟，然后进行 PBS 洗涤，然后在另一次 PBS 洗涤后与 0.01% 生物素孵育 15 分钟，从而封闭内源性生物素。将载玻片放入染色盒中，在每个组织切片的顶部放置新鲜制备的所需凝集素混合物，然后用香水轻轻覆盖凝集素混合物。

现在，在黑暗中孵育玻片一小时后。轻轻取出香水，用 PBS 洗涤载玻片 3 次。然后将载玻片与偶联 SCI 5 中的 strep avid 分层，并在 30 分钟后再次在黑暗中孵育，用 PBS 洗涤载玻片 3 次，然后用 dappy 对细胞核进行复染。

最后，使用水性介质（例如用于 sase 酶控制的载体封固剂）用盖玻片封片。首先在空吸头盒的底部加水，形成一个潮湿的腔室。将阴性对照玻片正面朝上放在吸头盒的顶部托盘上。

将 150 至 200 微升 US 溶液铺在组织切片上，然后用盖玻片覆盖每张载玻片，避免形成气泡。盖上盒盖，并在 2 个半小时后在 37 摄氏度下孵育盒子。在室温下用 PBS 洗涤载玻片 3 次，以去除任何游离的片酸。

然后将玻片与 SNA 在室温下孵育 1 小时以进行竞争性抑制。将 200 微升凝集素混合物控制到两个 einor 小瓶中。然后将 200 毫摩尔的 Jacqueline 抑制剂 Meli bios 添加到其中一个小瓶中，并将 SWGA 抑制剂几丁质水解物以 1 比 10 的稀释度添加到另一个小瓶中。

然后将玻片与含有抑制剂的混合物在室温下孵育 1 小时。在第一个图形组织中，用粉红色的高碘酸或钙蓝色的高碘酸盐或鸡结肠标本或石蜡中冷冻的孜然小鼠或鸡结肠标本的切片进行染色。将石蜡中包埋的组织样品与OCT Cryoprotectant培养基中冻存组织的冷冻组织进行比较，发现冷冻组织中粘蛋白糖蛋白的保存和染色质量存在显著差异。

除了杯状细胞中的粘蛋白外，分泌的粘液也可见，如石蜡包埋组织中的箭头所示。粘液染色局限于杯状细胞。在该图中，可以观察到粘蛋白和在 citrus resolve 中孵育的组织的巨大损失。

将冷冻鸡回肠标本的连续切片固定在 10% 缓冲的福尔辛中并保持水合，通过在 70%90% 和 100% 乙醇中连续孵育在乙醇中脱水 20 分钟，或在乙醇中脱水，然后用柑橘澄清 1 小时。单独乙醇脱水和乙醇脱水加柑橘均清除改善了组织形态。单独的进一步乙醇脱水对蓝色染色没有显着影响。

相比之下，柑橘类全孵育将蓝色染色减少并局限于杯状细胞，其模式类似于在上图中看到的石蜡包埋组织观察到的模式。方框表示葱蓝染色组织切片中放大倍数较高的区域。在下一组图像中，鸡回肠标本在 OCT 中冷冻或包埋在石蜡中，然后用蓝色的 Jacqueline、绿色的 SWG 和红色的 SNA 探测，显示在冷冻组织中。

Jacqueline 与 olink 聚糖的结合揭示了似乎从杯状细胞渗入管腔的结构，如 OCT 冷冻组织切片中的箭头所示。相比之下，Jacqueline 与石蜡包埋组织的结合仅限于杯状细胞和这些箭头指示的绒毛刷边界。β 1 4 GL 的 SWGA 染色部分定位于冷冻和石蜡包埋组织中杰奎琳凝集素的结合，如箭头所示。

相比之下，红色的 SNA 凝集素（由箭头指示）在细胞内与 α 2 六键唾液酸结合，并且不与杰奎琳共定位，杰奎琳是蓝色的，用虚线箭头表示 在本图中。通过用 US 消化组织切片从鸡回肠标本中切割切片酸表位，或者通过孵育和乙酸钠缓冲液切割，如图所示。a US 处理消除了在未处理组织中观察到的生物素化 SNA 染色，证实了 SNA 与唾液酸的结合特异性。

凝集素特异性也可以通过添加竞争性抑制剂来确认，例如用于 Jacqueline 染色的 mely bios 或用于 SWGA 染色的几丁质水解物，再次与 Jacqueline 和 SWGA 混合物一起孵育鸡回肠标本。这次也在特异性凝集素抑制剂存在下，mely bios 或几丁质水解物 Jacqueline 染色被 mely bios 抑制，但未被几丁质水解物抑制。相反，SWGA 染色被几丁质水解物抑制，但 mely bios 没有抑制。

这最后的一系列图像表明，在临床和研究实验室中常规获得的速冻组织样品可以进一步嵌入 OCT 中，并用于研究粘蛋白、糖蛋白、糖脂和聚糖上的聚糖。这些来自绒毛癌和粘液癌组织的结直肠癌活检在嵌入 OCT 中的液氮中快速冷冻，并成功对各种指示的粘蛋白和聚糖表位进行染色。观看此视频后，您应该对如何将组织包埋在 OCT 中以及如何使用免疫化学方法分析粘液和组织糖基化有很好的了解。