触角电位生物测定作为寄主植物挥发物筛选工具

本实验的总体目标是快速筛选大量寄主植物挥发物是否具有潜在的生物活性。首先通过气相色谱-质谱联用技术（GCMS）收集并分析目标寄主植物的挥发物，随后对其中的化学组分进行鉴定与验证。

第三步是通过电生理分析，对各个组分进行足够重复次数的生物活性筛选。最后一步是配制并评估活性组分的混合物。最终，研究结果可提供一组经过筛选的单一组分或组分混合物，可用于后续针对目标昆虫的行为学研究。

该技术相较于现有方法（如耗时的行为学研究）的主要优势在于，通过脑电图分析进行快速筛选，可显著减少后续研究中所需测试的化合物数量，从而展示出一种高效的研究流程。MR Wage 是我实验室的技术员吗？在通过气相色谱-质谱联用技术鉴定出相关挥发性物质后，可首先对每种可获得的挥发性物质进行电生理图谱分析（EAG）。

然而，必须预先准备可用的挥发性物质。在可严密封闭的容器中，用戊烷配制每种挥发性物质的溶液，浓度为每毫升五毫克，并于四摄氏度保存。接下来，制备刺激用移液管。

每种挥发物标记10支移液管，并用一小块封口膜包裹其管尖。在初步筛选中，每种性别的低重复次数实验使用10支移液管已足够。现在将剩余的五支移液管排列在支架中，并将一个生物测定圆片放入每支移液管的开口端。

用镊子轻轻折叠一个圆盘，并将其部分插入移液管的宽口端，使圆盘露出2至3毫米。使用移液器或注射器将10 µL挥发性溶液加到每个圆盘上。正确计算、配制和准备溶液以确保重复实验的一致性极为重要。

等待两分钟后，将圆片完全推入移液管中。加载完成后，立即用石蜡密封每根移液管。根据所需重复次数，重复此移液管制备步骤。

采用相同的方案。在此实例中，准备仅含戊烷的阴性对照，以及苯乙酮和性激素的阳性对照。现在开始准备昆虫触角。

在本实验中，前置放大器将信号从叉状电极传递至EAG采集仪器。必须在软件中对EAG仪器配套的软件进行适当配置。首先将采样率设置为106.7，以完成参数设置。

在滤波器选项卡下，将整流切换开关设为“已知”，并将滤波器设置为0至42赫兹。启用EAG滤波器，并将低频截止设为0.1赫兹。然后将设置保存为配置文件以供将来使用。

运行该程序非常简单，只需打开一个新的项目文件，将其以特定名称保存，然后开始记录即可。红色三角形图标启动记录过程，并在每次单独的气流刺激期间保持开启，持续预定的时间。当所有针对触角的气流刺激完成后，黑色的 X 图标将停止记录，以便更准确地读取 EAG 反应。

可将一把小尺子用胶带固定在计算机屏幕信号基线位置。反应幅度以毫米记录，随后转换为微伏（µV）为单位的振幅。如有需要，可回放记录以进行进一步评估。

在此示例中，使用三至四日龄的脐橙雄蛾和交配后的雌蛾。然而，本方案可针对其他昆虫进行调整。将每只昆虫转移至一个小的铺有垫料的塑料容器中。

在分析当天，进行生物测定前，将昆虫插入移液器吸头的大端开口内，该吸头的小端开口仅稍大于昆虫头部。然后使用更小的移液器吸头，小心地将昆虫推向小端开口，直至其头部在体视显微镜下暴露出来。确保触角固定在固定管内，且触角基部暴露，以便切除。

接下来，将叉形电极架放置在靠近触角的位置，并在其上涂抹少量电极胶。使用显微剪刀轻轻分离，随后切除两条触角，并启动计时器，记录从该操作到后续刺激之间的时间间隔。使用一端带有少量胶液的金属丝工具，拾取一条触角并将其放置在叉形电极上。确保触角基部置于叉形电极的非红色无关接地电极上。

对第二根触角进行相同操作。将触角基部置于叉子的同一侧，间距两到三毫米，并调整触角位置。根据需要修剪触角尖端。

使用刷子将电极涂抹到凝胶上，并确保电极的底部和尖端均浸入电极凝胶中，以避免凝胶中产生气泡。避免将凝胶覆盖到触角的中央区域，以最大限度地增加触角表面暴露于挥发性气流的面积。待制备样品充分凝胶化后，将叉状电极连接至探针前置放大器。

现在，在制备物上施加湿润的空气流，以维持触角制备物的活性。在切除后10分钟，开始施加第一种刺激。刺激制备物的操作顺序以阳性对照开始和结束，中间以随机顺序施加各化合物，相邻刺激不能使用相同化合物，并至少包含一个阴性对照；施加到一根触角的化合物数量因物种而异。

一个柑橘天蛾的触角制备样本可保持活性超过30分钟，因此可在较低重复次数下快速分析多达10种挥发性物质。相同的样品递送原理适用于后续对初步筛选中发现能引发反应的混合化合物进行的筛选。第一根刺激进样毛细管必须在施加气流刺激前30秒准备好，打开毛细管并将其置于持针器中，使其气流方向对准距离触角2至3毫米处，该操作应在触角切除后10分钟内完成。

以每分钟300毫升的流速，持续一到两秒输送第一次刺激气流。现在，迅速更换移液管，使在第一次刺激后一分钟时输送第二次刺激。保持样品间操作的一致性将最小化实际喷出挥发性物质含量的变异。

在施加最后一次阳性对照气流后，取下触角并清洁叉状电极。使用浸有乙醇的擦拭巾清洁后，需待其完全干燥后再进行后续使用。为提高检测通量，助手应在上一轮准备结束前10分钟，提前准备好下一根带有洁净叉状电极的触角。

测试顺序需要使用多个叉；每次实验后，将测试用蛾类置于干冰环境中处死，并解剖雌性蛾类以检查其交配状态。假设共处一室的雄性已成功交配。取橘实蛾的触角制备样本，用持续两秒的气流刺激，随后在5毫伏量程下进行10秒记录，记录时间窗为10秒。

负向偏转是典型的反应。但记录的是绝对值。所有对阳性对照反应较弱的雌性标本均被弃用。

其余样品的平均反应为 2,600 微伏。同样，雄性对性信息素 pH 对照的平均反应通常为 3,000 微伏。因此，反应低于标准的个体被剔除；在试验过程中表现出反应衰减的触角所获得的数据也被舍弃。

如果 Anton 对最终阳性对照气流的反应值低于预实验对照（pre-con control）第一次气流反应值的 75%，或低于预实验对照第二次气流的反应值，则视为发生降解。对反应值的分析方法如下：取每轮实验的原始测量值，从该轮所有数值中减去该轮的阴性对照反应值。随后，计算每轮实验中所有阳性对照的平均值，并将其校正至 1000 微伏（Microvolts），同时记录每轮实验校正至 1000 微伏的校正比率。

随后，将测试化合物的数值乘以阳性对照校正比率。最后，通过比较每种测试化合物在所有运行中的平均校正反应，评估其是否值得进一步研究。切记，操作化学品可能具有极高危险性，必须始终采取适当的安全防护措施。