Name: 作为寄主植物挥发物的筛选工具electroantennographic生物活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 了解利用触角电位分析快速筛选寄主植物挥发物的方法，通过测量脐橙螟成虫触角的电生理反应来评估单一组分及混合物的生物活性，为害虫防治策略提供依据。

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本研究在 USDA-ARS CRIS 项目 5325-42000-037-00D 下开展，并获得了合作研发协议 CRADA 58-3K95-7-1198 和技术转让协议 TFCA 58-5325-8-419 结果的支持。作者衷心感谢 Suterra 惠赠 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛，感谢 B. Higbee 提出的有益讨论，以及 J. Baker 提供的技术协助。

1. 用于EAG筛选的寄主植物挥发物的制备
<ol>
 <li>在通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对所有挥发性物质进行适当的鉴定与确认后，对每种可获得的挥发性物质进行触角电生理（EAG） puff 分析。初步筛选时，每种性别的触角反应可采用较低的重复次数（N=3–5），以在较短时间内获得相对化学感受敏感性的初步评估。表1).</li>
 <li>配制每种挥发性物质在戊烷中的溶液，浓度为 5 mg/mL。密封后冷藏保存，待立即使用时取出（例如苯乙酮，密度 = 1.03 g/mL，体积 = (0.005 g/1.03 g/mL) × 1,000 = 4.85 μL 将苯乙酮加入1.0 mL容量瓶中，并用戊烷定容至1.0 mL。</li>
 <li>在进行EAG分析前，取出装有待测挥发物（5 mg/mL浓度）的小瓶，置于室温下回温。同时，标记相应数量的巴斯德移液管，使其与每种待测挥发物一一对应，并用一小块帕拉膜（约15 × 15 mm）覆盖移液管尖端。在初步筛选阶段，准备10根刺激用移液管（每份雄性和雌性样本N=4），以应对制备失败或其他意外情况。</li>
 <li>使用一对镊子，将生物测定圆片轻轻对折，以方便放入移液管中，然后将对折后的圆片部分插入移液管的宽口端，使约2–3 mm的圆片露出。将已标记并准备好的移液管整齐排列在支架中。</li>
 <li>使用移液器或注射器，加载 10 μL (50 μg将挥发性溶液滴加到每个圆盘上，静置2分钟后，再将圆盘完全插入移液管中。加载完成后，立即用Parafilm封膜（约15 × 30 mm）密封移液管末端。所用挥发性刺激物的剂量及喷出量可能因昆虫种类不同而有所差异。</li>
 <li>按照上述相同方案制备每项分析中需包含的对照样本。对于阴性对照，上样 10 μL 仅将戊烷加到每个圆盘上，等待2分钟，装入已标记的移液管中并密封。对于阳性对照，装入 10 μL (50 μg将样品滴加到圆盘上，静置2分钟，用标记好的移液器吸取，并用封口膜密封。</li>
 <li>昆虫触角标本的存活能力很可能因物种而异，但我们发现 Amyelois transitella 触角通常保持活跃且稳定 &gt; 切除后30分钟，使用所述方案。该时间通常可支持评估4-10个挥发性样品。 表2 提供了时间与序列的示例。</li>
</ol>
2. EAG 生物测定用昆虫触角的制备
<ol>
 <li>本实验的重点是触角电位（EAG）分析；因此，默认每位研究人员均可获得经过适当饲养的昆虫。</li>
 <li>本实验将研究3-4日龄、已交配的雄性和雌性蛾类。在分析当天，将单个蛾子转移至小型带盖塑料容器中。在进行生物测定前，立即以头部朝前的方式将待测蛾子转移至固定装置（例如由不同塑料移液器吸头制成）中，并从后方固定。可在低倍立体显微镜下观察昆虫的操作过程，以便于进行组织切除。</li>
 <li>使用带金属尖端的工具将触角轻轻分离。叉状电极支架上涂有一层薄薄的导电胶，应放置在附近以便快速转移触角。使用显微剪刀切除第一条触角，并将其放置在叉状支架上，确保触角基部置于支架非红色区域（即无关电极/接地电极）。启动计时器（设定为10分钟），随后切除第二条触角，并将其与第一条并列放置，两条触角的基部均位于叉状支架的同一侧。</li>
 <li>或者，也可将触角保留在固定管内，直接在管中切除，然后使用末端沾有少量导电胶的金属尖工具，从管壁与昆虫之间轻轻取出触角。</li>
 <li>检查触角，确保其基部和末端均浸入导电胶中，且胶内无气泡存在。必要时可修剪触角末端，以确保其充分接触导电胶。操作时需注意，避免将触角其余部分覆盖导电胶，从而保证最大面积的触角表面暴露于气流刺激中。</li>
 <li>将准备好的叉状支架插入探针前置放大器中，并在接下来的10分钟等待期间，持续以200 mL/min的流速通入湿润空气。记录切除时间及EAG开始时间（表2）。在首次刺激气流前30秒，打开含有阳性对照物的移液管密封，并将其放入支架中，调整位置使气流/喷气方向距离准备好的触角2-3 mm。</li>
 <li>每次实验结束后，将测试用蛾子置于干冰环境中实施安乐死，并按规定妥善处理。</li>
 <li>解剖雌性蛾子以确认其交配状态；共居的雄性个体默认为已交配。</li>
</ol>
3. 各组分的EAG实验方案
<ol>
 <li>通过Syntech EAG仪器配套的AutoSpike软件记录触角反应。在AutoSpike属性选项卡中，EAG探针所在通道的设置为采样率106.7，不整流，滤波范围为0–42 Hz。在滤波器选项卡中，EAG滤波器设为开启，低频截止设为0.1 Hz。</li>
 <li>刺激气流持续时间为1–2秒。每次气流刺激后启动一个时长为1分钟的计时器。</li>
 <li>打开下一个测试挥发物的移液管并插入支架中。按照测试挥发物的顺序（例如表2），在每次气流刺激之间严格间隔1分钟进行测试，且不同实验轮次间随机化顺序，以确保没有测试化合物始终紧随另一测试挥发物之后。</li>
 <li>为便于读取EAG反应，可在计算机屏幕上放置部分标尺，测量基线至向下偏转信号峰顶的距离（单位为mm），并记录在数据表中（例如，对于5 mV设置，33 mm = 2.5 mV）。该软件具备回放已保存记录的功能，可用于后续分析。毫米（mm）到毫伏（mV）或微伏（μV）振幅的换算在后续数据分析中进行。</li>
 <li>在最后一次阳性对照气流刺激（例如记录编号#12）完成后，取下触角，用乙醇浸湿的擦拭纸清洁叉状支架，并在下次使用前使其干燥。</li>
 <li>为提高检测通量，可在当前实验结束前约10分钟（即在第四次气流刺激后，按表2为当前实验的第二个测试挥发物）由第二名实验人员开始下一组触角的切除操作，以便在当前实验一结束即刻开始下一轮实验。</li>
 <li>对于感兴趣的化合物，可增加重复次数（使用不同的触角），以提供更充分的统计学验证。</li>
</ol>
4. 混合物或其他基质的EAG分析示例（表3）
<ol>
 <li>接下来，计算两种三元混合物（三组分混合物）的比例和体积，以举例说明如何组合能引起较强触角电位反应的挥发性物质（表4）。计算基于一些基本比例：α-蛇麻烯 : 2-十一烷酮 : 2-苯乙醇的摩尔比为1:1:1，随后与另一种混合比例1:2:4进行比较。</li>
 <li>采用此前描述的类似实验方案，配制混合物，并将混合物及必要的阳性和阴性对照分别加入已标记的巴斯德移液管中。</li>
 <li>将挥发性样品吹过雄性和雌性触角，测量其反应并记录在数据表上（表3）。</li>
</ol>
5. 代表性结果
对于雌性脐橙螟蛾，使用以下设置：2秒气流脉冲，10秒记录时间，10秒时间窗口，以及5 mV量程。典型的反应为负向偏转，但记录其绝对值（例如，-3,400 μV的偏转记录为3,400 μV）。若样品对阳性对照的反应较弱，则该结果予以舍弃。图1展示了脐橙螟蛾对阳性对照反应较差的图示。
以较差的对照结果为例，雌性触角对苯乙酮的平均反应通常约为 2,600 μV（图 2）；如果制备样本的反应值仅为约 1,300 μV，则该样本将被弃用，并重新制备另一对触角。类似地，雄性对(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛的平均反应通常为 3,000 μV；因此，任何低于 1,500 μV 的反应值通常均被弃用。
每次实验开始和结束时的阳性对照还可提供有关触角状态的信息。我们遵循的快速筛选经验法则是，若触角对实验后对照气流（记录编号#12）的反应 表 2小于75%的1st 预对照的喷气（记录编号 #1， 表 2）或少于 2nd 预对照的喷射（记录编号 #2， 表2）则该实验不纳入数据分析，以避免因样品制备可能发生的降解而影响结果图3）。第一条经验法则的一个示例是记录编号 #1 = 2,730 μV 并记录 #12 = 1,680 μV；经验法则之二：若记录编号 #2 = 2,350 μV 并记录 #12 = 1,680 μV在这些情况中的每一种中，制备过程和实验结果都将被弃用。
以下是一个针对阳性对照测得的EAG反应值进行校正的代表性示例。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>运行次数 #</td>
 <td>EAG (μV)</td>
 <td>运行次数 #2</td>
 <td>EAG (μV)</td>
 <td>运行次数 #3</td>
 <td>EAG (μV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2800</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2420</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>3030</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>化合物 A</td>
 <td>3000</td>
 <td>化合物 A</td>
 <td>2500</td>
 <td>化合物 A</td>
 <td>3440</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(-) 对照</td>
 <td>530</td>
 <td>(-) 对照</td>
 <td>755</td>
 <td>(-) 对照</td>
 <td>910</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>化合物 B</td>
 <td>2400</td>
 <td>化合物 B</td>
 <td>2000</td>
 <td>化合物 B</td>
 <td>2560</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2770</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2400</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>3020</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
根据上述N=3实验的数值，每个实验中的每个值均减去阴性对照反应，其假设为阴性对照代表触角对机械气流及残留溶剂的基线响应。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>运行次数 #1</td>
 <td>EAG (μV)</td>
 <td>运行次数 #2</td>
 <td>EAG (μV)</td>
 <td>运行次数 #3</td>
 <td>EAG (μV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2270</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>1665</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2120</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>化合物 A</td>
 <td>2470</td>
 <td>化合物 A</td>
 <td>1745</td>
 <td>化合物 A</td>
 <td>2530</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(-) 对照</td>
 <td>0</td>
 <td>(-) 对照</td>
 <td>0</td>
 <td>(-) 对照</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>化合物 B</td>
 <td>1870</td>
 <td>化合物 B</td>
 <td>1245</td>
 <td>化合物 B</td>
 <td>1650</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2240</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>1645</td>
 <td>(+) 对照</td>
 <td>2110</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
每个实验的阳性对照将被取平均值并校正至1,000 μV，同时记录校正至1,000 μV的比值。可使用数据表（例如Excel）轻松处理，将反应信号转换为可用数据。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>运行次数 #1</td>
 <td>平均值 (μV)</td>
 <td>运行次数 #2</td>
 <td>平均值 (μV)</td>
 <td>运行次数 #3</td>
 <td>平均值 (μV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(+) Ctrl</td>
 <td>2255</td>
 <td>(+) Ctrl</td>
 <td>1655</td>
 <td>(+) Ctrl</td>
 <td>2115</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(+) Ctrl adj.</td>
 <td>1000 (0.443)</td>
 <td>(+) Ctrl adj.</td>
 <td>1000 (0.604)</td>
 <td>(+) Ctrl adj.</td>
 <td>1000 (0.473)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
通过在每个实验中乘以校正系数，对化合物 A 和化合物 B 的数值进行调整。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>运行次数 #1</td>
 <td>校正后EAG(μV)</td>
 <td>运行次数 #2</td>
 <td>校正后EAG(μV)</td>
 <td>运行次数 #3</td>
 <td>校正后EAG(μV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cmpnd A</td>
 <td>1094</td>
 <td>Cmpnd A</td>
 <td>1054</td>
 <td>Cmpnd A</td>
 <td>1197</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cmpnd B</td>
 <td>828</td>
 <td>Cmpnd B</td>
 <td>752</td>
 <td>Cmpnd B</td>
 <td>780</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
随后确定每种化合物的平均值（均值）以及其他相关统计学数据，并可据此评估所测试化合物的EAG反应，以筛选出适合进一步研究的候选物质。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>化合物</td>
 <td>EAG (μV)</td>
 <td>运行次数，N=</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>A</td>
 <td>1115</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B</td>
 <td>787</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<img alt="Autospline software graph; showing data analysis with spline interpolation highlights." src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 雄性触角反应的代表性EAG1,180 μV) 与预对照 (1st 阳性对照气流）在确认触角与凝胶接触良好后，若触角反应不佳则予以弃用。底部窗口中的蓝色条形代表持续两秒的挥发性物质气流。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank"> 单击此处以查看大图</a>.
<img alt="Spectroscopy graph; displays signal analysis with transient absorption data on software interface." src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 雌性触角反应的代表性EAG3,400 μV) 加入到 1st 适当的吹气预控制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<img alt="Electrophysiology analysis graph displaying voltage-clamp data with traces for ion channel activity." src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 雌性触角反应的代表性EAG1,680 μV) 与对照后组（每次实验的最后一个阳性对照）相比，若结果较差，则提示触角可能已降解&lt;75%st 预对照或 &lt; 2nd 预控制的 puff 值）。在此示例中，第 1 个st 预对照喷气 2,730 μV 和 2nd 预对照喷气 2,350 μV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<img alt="吸收和激发光谱数据分析图；软件界面显示。" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 雌性触角对候选挥发性混合物气流刺激的典型EAG反应（3,800 μV），以及随后测量的最大初始偏转（3,800 μV）、气流持续期间的初始斜率（0.3 s/1.2 mV = 0.25 s/mV）和剩余气流持续时间的斜率（1.6 s/1.9 mV = 0.84 s/mV）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="含有营养肉汤的微生物发酵装置；带有光谱分析的实验室实验。" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 小型改良容器，内含待吹过A. transitella触角的样品基质及其相关挥发物。
<img alt="非帕里尔杏仁（2007年）原位挥发物释放及使用Autospike程序中不同且灵敏度较低配置测得的EAG响应的气相色谱结果表，包含化合物保留指数分析。" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1. 原位 非帕里尔杏仁（2007年）的挥发物释放及其通过Autospike程序中不同且灵敏度较低的配置测定的EAG响应结果。
<img alt="分析杏仁中挥发性化合物的EAG数据表；包含ACep、UDON、2PEA等化合物。" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 2"> 
表 2. 记录雄性和雌性触角对单一挥发性成分反应的表格示例。
<img alt="雄性和雌性挥发性混合物的EAG反应表格，包含苯乙酮和戊烷等化合物。" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 3"> 
表 3. 记录雄性和雌性触角对挥发性混合物和/或香精反应的记录表示例。
<img alt="化学混合物比例的静态平衡方程；表格显示摩尔数和密度计算。" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 4"> 
表 4. 两种不同配比混合物制备 10 mL 浓度为 5 mg/mL 溶液的示例。
<img alt="杏仁挥发物的触角电位图结果；包含EAG时间、化合物及性别差异的表格。" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 5"> 
表 5. 记录单一挥发性组分在雄性和雌性触角上连续两次气流刺激反应的记录表示例。

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<li>Burks, C. S., Brandl, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+abundance+of+navel+orangeworm+%28Leipidoptera%3A+Pyralidae%29+in+figs+and+effect+of+peripheral+aerosol+dispensers+on+sexual+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Seasonal abundance of navel orangeworm (Leipidoptera: Pyralidae) in figs and effect of peripheral aerosol dispensers on sexual communication.</a> J. Insect Sci. 4, 1-8 (2004).</li>
</ol>

作者与Paramount Farming Company（一家与Suterra LLC有关联的公司）已有现有的合作研究与开发协议。

利用触角电位图（EAG）记录作为生物测定方法来确定目标昆虫的化学感受反应较为常见，文献中已有大量研究采用EAG作为气相色谱流出物的检测器（GC-EAD）。9,10 本文所展示的方法能够对等量挥发性组分进行快速筛选，并具有较高的重复性，从而可靠地评估相对响应程度。Syntech软件中的AutoSpike程序适用于挥发性物质的初步筛选，因其可提供来自昆虫触角的最大偏转信号振幅（图1-3），本文将此值称为“筛选”值。此外，根据配置参数及研究者所需获取的信息，AutoSpike还可提供一些适用于半高级应用的基本数据（见图4）。GcEAD或EagPro Syntech程序则更适合于更高级的实验，或适用于熟悉电生理反应的研究人员，因为其输出的波形图可更详细地反映触角去极化反应随时间变化的过程。
在对寄主植物中检测到的化合物进行筛选之前，对挥发性物质进行准确鉴定至关重要，且应遵循严格的鉴定规程。如果条件允许，应使用两根极性不同的气相色谱柱（例如 DB-Wax 和 DB-1），通过匹配保留指数（RIs，见<...

触角电位生物测定作为寄主植物挥发物筛选工具

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

植物挥发物在植物与昆虫的相互作用中起着重要作用。植食性昆虫利用植物释放的挥发物（称为利己素）来定位其寄主植物。1,2 当寄主植物为重要的农业经济作物时，害虫取食造成的损害可能给种植者带来严重的经济损失。因此，利己素可作为引诱剂用于吸引或干扰这些昆虫，从而为害虫防控提供一种环境友好的农药替代方案。3 然而，植物会释放大量挥发物，其成分种类及排放比例随作物物候期或一天中的时间而变化。这使得鉴定具有生物活性的单一成分或挥发性成分组合变得极为困难。为了帮助鉴定寄主植物挥发物中具有生物活性的成分，我们采用基于实验室的电生理筛选生物测定法——触角电位（EAG）。EAG是一种有效的工具，可用于评估和记录昆虫通过触角受体产生的嗅觉电生理反应。EAG筛选过程有助于减少需测试的挥发物数量，从而快速锁定具有潜力的生物活性成分。然而，EAG生物测定仅能提供有关受体激活的信息，无法揭示化合物所引发的昆虫行为类型——例如引诱、驱避或其他行为反应。相对于适当阳性对照能引发显著EAG反应的挥发物，通常会被进一步用于测试害虫的行为响应。本文所介绍的实验设计将详细阐述通过EAG生物测定法检测成年害虫脐橙螟蛾（Amyelois transitella）对基于杏仁的寄主植物挥发物4,5的单一组分及简单混合组分的电生理触角反应的方法。该方法使用两个离体触角，置于“叉状”电极支架上。此处演示的方案提供了一种快速、高通量且标准化的挥发物筛选方法。每种挥发物均以设定且恒定的剂量施加，以标准化刺激强度，从而使触角反应能够反映相对化学感受敏感性。阴性对照有助于排除残留溶剂及气流机械力引起的电生理反应。阳性对照（本实验中为苯乙酮）是一种能够稳定引起来自雄性和雌性脐橙螟蛾（NOW）个体一致反应的单一化合物。另一种常用于雄性NOW蛾生物测定研究的半化学标准物质是(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛，它是雌性产生的性信息素中的醛类成分。6-8

本文演示了一种通过电天线图分析法测定成年脐橙螟（Amyelois transitella）触角对单一组分及混合物挥发性物质的电生理反应，从而快速筛选寄主植物挥发物的方法。

植物挥发物在植物与昆虫的相互作用中起着重要作用。植食性昆虫利用植物释放的挥发物（称为互利素）来定位其寄主植物……

本实验的总体目标是快速筛选大量寄主植物挥发物是否具有潜在的生物活性。首先通过气相色谱-质谱联用技术（GCMS）收集并分析目标寄主植物的挥发物，随后对其中的化学组分进行鉴定与验证。第三步是通过电生理分析，对各个组分进行足够重复次数的生物活性筛选。最后一步是配制并评估活性组分的混合物。最终，研究结果可提供一组经过筛选的单一组分或组分混合物，可用于后续针对目标昆虫的行为学研究。 该技术相较于现有方法（如耗时的行为学研究）的主要优势在于，通过脑电图分析进行快速筛选，可显著减少后续研究中所需测试的化合物数量，从而展示出一种高效的研究流程。MR Wage 是我实验室的技术员吗？在通过气相色谱-质谱联用技术鉴定出相关挥发性物质后，可首先对每种可获得的挥发性物质进行电生理图谱分析（EAG）。然而，必须预先准备可用的挥发性物质。在可严密封闭的容器中，用戊烷配制每种挥发性物质的溶液，浓度为每毫升五毫克，并于四摄氏度保存。接下来，制备刺激用移液管。每种挥发物标记10支移液管，并用一小块封口膜包裹其管尖。在初步筛选中，每种性别的低重复次数实验使用10支移液管已足够。现在将剩余的五支移液管排列在支架中，并将一个生物测定圆片放入每支移液管的开口端。用镊子轻轻折叠一个圆盘，并将其部分插入移液管的宽口端，使圆盘露出2至3毫米。使用移液器或注射器将10 µL挥发性溶液加到每个圆盘上。正确计算、配制和准备溶液以确保重复实验的一致性极为重要。等待两分钟后，将圆片完全推入移液管中。加载完成后，立即用石蜡密封每根移液管。根据所需重复次数，重复此移液管制备步骤。采用相同的方案。在此实例中，准备仅含戊烷的阴性对照，以及苯乙酮和性激素的阳性对照。现在开始准备昆虫触角。在本实验中，前置放大器将信号从叉状电极传递至EAG采集仪器。必须在软件中对EAG仪器配套的软件进行适当配置。首先将采样率设置为106.7，以完成参数设置。在滤波器选项卡下，将整流切换开关设为“已知”，并将滤波器设置为0至42赫兹。启用EAG滤波器，并将低频截止设为0.1赫兹。然后将设置保存为配置文件以供将来使用。运行该程序非常简单，只需打开一个新的项目文件，将其以特定名称保存，然后开始记录即可。红色三角形图标启动记录过程，并在每次单独的气流刺激期间保持开启，持续预定的时间。当所有针对触角的气流刺激完成后，黑色的 X 图标将停止记录，以便更准确地读取 EAG 反应。可将一把小尺子用胶带固定在计算机屏幕信号基线位置。反应幅度以毫米记录，随后转换为微伏（µV）为单位的振幅。如有需要，可回放记录以进行进一步评估。在此示例中，使用三至四日龄的脐橙雄蛾和交配后的雌蛾。然而，本方案可针对其他昆虫进行调整。将每只昆虫转移至一个小的铺有垫料的塑料容器中。在分析当天，进行生物测定前，将昆虫插入移液器吸头的大端开口内，该吸头的小端开口仅稍大于昆虫头部。然后使用更小的移液器吸头，小心地将昆虫推向小端开口，直至其头部在体视显微镜下暴露出来。确保触角固定在固定管内，且触角基部暴露，以便切除。接下来，将叉形电极架放置在靠近触角的位置，并在其上涂抹少量电极胶。使用显微剪刀轻轻分离，随后切除两条触角，并启动计时器，记录从该操作到后续刺激之间的时间间隔。使用一端带有少量胶液的金属丝工具，拾取一条触角并将其放置在叉形电极上。确保触角基部置于叉形电极的非红色无关接地电极上。对第二根触角进行相同操作。将触角基部置于叉子的同一侧，间距两到三毫米，并调整触角位置。根据需要修剪触角尖端。使用刷子将电极涂抹到凝胶上，并确保电极的底部和尖端均浸入电极凝胶中，以避免凝胶中产生气泡。避免将凝胶覆盖到触角的中央区域，以最大限度地增加触角表面暴露于挥发性气流的面积。待制备样品充分凝胶化后，将叉状电极连接至探针前置放大器。现在，在制备物上施加湿润的空气流，以维持触角制备物的活性。在切除后10分钟，开始施加第一种刺激。刺激制备物的操作顺序以阳性对照开始和结束，中间以随机顺序施加各化合物，相邻刺激不能使用相同化合物，并至少包含一个阴性对照；施加到一根触角的化合物数量因物种而异。一个柑橘天蛾的触角制备样本可保持活性超过30分钟，因此可在较低重复次数下快速分析多达10种挥发性物质。相同的样品递送原理适用于后续对初步筛选中发现能引发反应的混合化合物进行的筛选。第一根刺激进样毛细管必须在施加气流刺激前30秒准备好，打开毛细管并将其置于持针器中，使其气流方向对准距离触角2至3毫米处，该操作应在触角切除后10分钟内完成。以每分钟300毫升的流速，持续一到两秒输送第一次刺激气流。现在，迅速更换移液管，使在第一次刺激后一分钟时输送第二次刺激。保持样品间操作的一致性将最小化实际喷出挥发性物质含量的变异。在施加最后一次阳性对照气流后，取下触角并清洁叉状电极。使用浸有乙醇的擦拭巾清洁后，需待其完全干燥后再进行后续使用。为提高检测通量，助手应在上一轮准备结束前10分钟，提前准备好下一根带有洁净叉状电极的触角。测试顺序需要使用多个叉；每次实验后，将测试用蛾类置于干冰环境中处死，并解剖雌性蛾类以检查其交配状态。假设共处一室的雄性已成功交配。取橘实蛾的触角制备样本，用持续两秒的气流刺激，随后在5毫伏量程下进行10秒记录，记录时间窗为10秒。负向偏转是典型的反应。但记录的是绝对值。所有对阳性对照反应较弱的雌性标本均被弃用。其余样品的平均反应为 2,600 微伏。同样，雄性对性信息素 pH 对照的平均反应通常为 3,000 微伏。因此，反应低于标准的个体被剔除；在试验过程中表现出反应衰减的触角所获得的数据也被舍弃。如果 Anton 对最终阳性对照气流的反应值低于预实验对照（pre-con control）第一次气流反应值的 75%，或低于预实验对照第二次气流的反应值，则视为发生降解。对反应值的分析方法如下：取每轮实验的原始测量值，从该轮所有数值中减去该轮的阴性对照反应值。随后，计算每轮实验中所有阳性对照的平均值，并将其校正至 1000 微伏（Microvolts），同时记录每轮实验校正至 1000 微伏的校正比率。随后，将测试化合物的数值乘以阳性对照校正比率。最后，通过比较每种测试化合物在所有运行中的平均校正反应，评估其是否值得进一步研究。切记，操作化学品可能具有极高危险性，必须始终采取适当的安全防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

作为寄主植物挥发物的筛选工具electroantennographic生物活性

昆虫的嗅觉系统为记录气味物质诱导的反应提供了独特的机会，这些反应形式包括触角电位图（EAG）和单个嗅觉毛记录（SSR），它们分别来自位于触角上所有气味受体神经元（ORNs）的总和反应以及来自单个嗅觉毛内神经元的反应。...

来自蛾类嗅觉系统的电生理学测量

嗅觉信号介导昆虫的多种不同行为，通常是由数十至数百种挥发性化合物组成的复杂混合物。我们采用气相色谱结合昆虫触角叶的多通道记录技术，描述了一种用于鉴定生物活性化合物的方法。...

利用气相色谱-多通道记录技术（GCMR）鉴定昆虫触角叶中的嗅觉挥发物

在本视频中，我们展示了一种筛选试验，用于评估小分子杀线虫剂对线虫的杀灭效果。若经药物处理后，样品中活动性线虫数量减少，则认为该杀线虫剂有效。...

小分子杀线虫剂筛选实验：一种针对 Ditylenchus dipsaci 的中通量潜在杀线虫剂筛选方法

本文描述了一种用于检测节肢动物行为反应的垂直T型迷宫嗅觉仪。该嗅觉仪可使实验者测量受试对象在两种潜在气味场作用下的选择行为。利用此装置可测定动物对气味物质的趋性及避性反应。...

垂直T型迷宫选择实验用于节肢动物对气味物质的反应分析

我们介绍了一种将昆虫触角以自主机器人上的电触角图（EAG）形式加以应用的实验方案。我们的实验设计可在一天内实现稳定的记录，并能分辨高达10...

利用昆虫触角电位传感器在自主机器人上进行嗅觉搜索

臭虫依靠其触角嗅觉感受器中的嗅觉受体神经元来探测环境中的化学信号物质。通过单感受器记录技术，我们展示了一种评估臭虫对化学信号物质反应的方法，并探讨了其中涉及的编码过程。...

利用单感器记录技术检测臭虫嗅觉神经元对化学信号物质的电生理反应

光吸引生物测定装置用于确定使昆虫吸引力最大化的最佳光色；然而，生物测定及方法需针对目标昆虫的行为和栖息环境进行设计。本文阐述了适用于夜行性或昼行性、陆生或空中昆虫的可定制设备及其改装方法。...

昆虫研究或监测项目中光吸引生物测定的关键要素

本文介绍了用于昆虫嗅觉行为测定的风洞装置的构建与使用方法。该风洞设计支持多种方式释放气味源，既可结合视觉刺激，也可在无视觉刺激条件下进行。风洞实验是鉴定具有行为活性的挥发性化学物质的重要方法。...

用于气味介导昆虫行为测定的风洞装置

本文详细介绍了一种在多种蚊子（包括雌性和雄性）中成功获得低噪声触角电位图的逐步实验方案。...

蚊虫触角电生理记录技术分步指南

本研究介绍了基于蚕蛾触角的生物混合型嗅探无人机的实验方案。除了展示利用蚕蛾触角操作实验性触角电位装置的方法外，还介绍了采用螺旋涌进算法实现气味源定位的生物混合无人机的结构设计。...

基于丝蛾触角的电触角图谱生物混合型嗅探无人机用于气味源定位

本方案建立了提取和量化秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫中挥发性性信息素的提取与化学吸引测定

了解利用触角电位分析快速筛选寄主植物挥发物的方法，通过测量脐橙螟成虫触角的电生理反应来评估单一组分及混合物的生物活性，为害虫防治策略提供依据。

触角电位生物测定作为寄主植物挥发物筛选工具

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